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1、湖南省大学生创新创业训练计划项目申请书项目名称：大曲中耐酸、高产淀粉酶微生物的筛选及初步鉴定项目编号：学生姓名：陈阔所在学校和院系：邵阳学院食品与化学工程学院项目实施时间：指导教师：尹乐斌申请日期：2020 630陈阔同学从大曲为研究对象，拟从中分离纯化并鉴定出耐酸高产淀粉酶微生物, 对其发酵工艺参数进行初步优化，选题结合工厂生产实际，有一定的实用价值。该 同学在前期调查研究分析基础上，对课题研究内容把握较好，研究目标明确，研究 方案、思路、方法选择恰当，研究内容工作量适中，进度安排合理，且该团队成员 均具备了微生物学科基础理论和专业知识以及分析问题好解决问题的能力，同意推 荐申报。五、 学院
2、大学生创新创业训练计划专家组意见学校大学生创新创业训练计划专家组意见七、 大学生创新创业工作领导小组审批意见湖南省教育厅2020年制一、 基本情况项目名称大曲中耐酸、高产淀粉酶微生物的筛选及初步鉴定所属学科学科一级门：生物学学科二级类：微生物学申请金额10000 元起上年月2020年6月至2022年6月负责人姓名陈阔性别男民族汉族出生年月2001年02月学号联系电话宅：手机：指导教师尹乐斌联系电话宅：手机：负责人曾经参与 科研的情况无指导教师承担科 研课题情况指导教师目前承担湖南省教育厅青年项目1项、校级双一流产 学研合作平台建设项目1项，参与湖南省重点研发计划1项。指导教师对本项 目的支持情
3、况指导老师多年从事食品微生物的教学与科研工作，有较深入的 研究经历，能够对对课题实施方案、实施过程中所遇问题、学术论 文发表等进行指导，并提供实验场地和必要的设备。项 目 组 主 要 成 员姓名学号专业班级所在学院项目中的分工何天翔2019级生物工程食品与化学工程学院耐酸、产淀粉酶微 生物的分离筛选欧阳英2019级生物工程食品与化学工程学院耐酸、产淀粉酶微 生物的鉴定匡秀慧2019级生物工程食品与化学工程学院耐酸、产淀粉酶微 生物的培养工艺二、 立项依据(可加页)1项目简介目前在湘窖制酒过程中存在原料转换率低的情况，大曲中的高产淀粉酶微生 物转化过低，进而导致产酒的速率过低，且在一定的程度上来
4、说影响酒的品质。 在本项目研究中需要筛选出高产淀粉酶及耐酸性的微生物，能有效使淀粉被淀粉 酶快速转化为酿酒所需的原料，且保障微生物在生产过程中不受影响，进而提高 产酒的效率，节约成本，为推动浓香型白酒的发展具有重要的意义。2研究目的在酿酒过程中，大曲中的多种微生物及其产生的各种酶发挥着重要的作用， 如糖化、发酵和香气生成，直接或间接改变着白酒的产量、质量和风格，因此， 研究大曲中耐酸高产淀粉酶的微生物具有十分重要的意义。本项目拟从湖南湘窖 酒业制曲车间的大曲中分离并鉴定耐酸、高产淀粉酶微生物，明确其发酵产淀粉 酶的最佳工艺，为生产上提高固态发酵白酒原料利用率奠定基础。3研究内容(1)耐酸、高产
5、淀粉酶微生物的分离筛选；（2）而寸酸、高产淀粉酶微生物的鉴定及生物学特性研究；（3）而由酸、高产淀粉酶微生物的发酵工艺优化。4国、内外研究现状和发展动态4.1 大曲的简介大曲的历史源远流长，人类一直在利用它进行野生菌株的人工培育，在烧酒 的发酵过程中它起到了主要的功效，并且能积蓄酶及发酵前提物质,还可以在发酵 中产生多种营养物质。多年来，不同地域的人们在利用大曲方面积累了大量的经 验，逐渐产生了各个地区各有代表的名酒。在发酵的过程中，因为有许多微生物的共 同作用，对研究人员的进一步研究制造了困难，这个需要我们做进一步的探索。经过 研究，对于微生物的制曲过程可以分成四期，即适应期、增殖期、平衡期
6、、衰退期, 在经过这四个阶段后，经过36个月倾向于稳定，形成的微生物群系能够接种到酒 上。大曲的原材料是空空麦，是一类微生态成品，可以经过天然的接种、发酵而 成的一类拥有物系、菌系、酶系的成品。大曲的重要组成部分之一是微生物，它种 类和数量的多少，对白酒的风格与品质有着直接的影响。大曲中用来产蛋白酶和 香味类物质的重要菌类是细菌。在温度很高的状况下，部分细菌能利用大曲原材 料中的肮产生酚类、酯类、高分子醛类等挥发性风味成分，因而给予酒曲独特的 曲香味。酵母菌是影响白酒发酵产酒的主要菌类。酒曲里面的酵母菌主要有产酒 酿母菌、产酯酿母菌以及假丝酵母菌等，产酒酵母是酒曲中主要的产酒功能菌，可以 把发
7、酵糟酷中的淀粉发酵为乙醇；产酯酵母又称为生香酵母，能促进发酵过程中 酯类的生成，形成浓杳型白酒的特征风味物质。4.2 淀粉酶的简介淀粉酶是一类能作用于淀粉、糖原、多糖衍生物中的糖普键，并把它们降解 成较小分子化合物的酶的总称，属于水解酶。它的全称为1,4-a-D-葡聚糖水解酶， 可催化淀粉及糖原水解，生成葡萄糖、麦芽糖及含有（x-1,6-糖昔键支链的糊精。按 水解产物不同淀粉酶可分为：（1） a-淀粉酶：从淀粉分子内部切开a-1,4-糖首键， 产生糊精和还原糖；（2）隹淀粉酶：从淀粉分子非还原端隔两个单位水解一次a-1,4- 糖甘键，产物为麦芽糖；（3）葡萄糖淀粉酶：从淀粉分了非还原端逐个水解
8、a-1,4- 糖首键；（4）脱支酶：只水解a-1,6-糖苔键，切下整个侧枝，产生麦芽三糖和麦芽糖。淀粉酶按来源又可分为真菌淀粉酶、细菌淀粉酶、动物以及植物淀粉酶。淀粉酶从20世纪50年代就作为食品添加剂应用于面包行业了,目前生料酒精、淀粉 糖浆、啤酒酿制、焙烤制品等诸多行业得到了广泛的应用，并且在白酒，黄酒， 啤酒的生产中都有运用。淀粉酶可以提高白酒出酒率，及改善酒质减少黄取酒取 用量的同时提高酒质，增加出酒率。不同地域大曲微生物区系及遗传背景均存在 较大差异，且有关湘窖大曲中耐酸、高产淀粉酶微生物分离筛选还鲜有报道。4.3 大曲中能产淀粉酶的微生物分类大曲的微生物主要有四类：即霉菌、细菌、酵
9、母菌、放线菌。放线菌为数不 多，在大曲中的作用尚不十分明显。霉菌生长代谢能产生多种酶。大曲中的能产生淀粉酶微生物有：霉菌、酵母 菌、青霉菌、细菌等。大曲酒酿造主要利用其代谢产生的液化型、糖化型淀粉酶, 作为生产发酵中的糖化剂。大曲生长的霉菌种类和数量受培曲温度的影响：培养 温度高，液化能力高，糖化力低；培养温度低，液化力低，糖化力高。4.3.1 霉菌霉菌生长代谢能产生多种酶。大曲酒酿造主要利用其代谢产生的液化型鬣糖 化型淀粉酶，作为生产发酵中的糖化剂。在高温制曲过程中由于水分减少、氧气 消耗而使得部分好氧霉菌被淘汰。霉菌的菌落有疏松、干燥、成蜘蛛网或绒毛状 等特征从外观上较易区别出来。从记载中
10、可以知道，茅台酒曲中也可以分离出各 种霉菌，如曲霉、根霉、毛霉、青霉、甚至很难生长的红曲霉。这些霉菌多在曲 子表面繁殖，生成抱子，耐高温高湿的匏子才能幸存下来。在工业上，霉菌在工 农业生产、医疗、环境等领域有着密切联系。在酱香酒生产中，霉菌可代谢产生 柠檬酸、葡萄糖酸、草酸等有机酸，还可以生成淀粉酶、蛋白酶等多种酶制剂。 由此看出，霉菌在前期分解原料、生成有机酸以此增加酱香、赋予酱香酒保健功 能等方面都起着重要作用。武晋海等在茅台酒大曲中筛选到3株在50以上可旺盛生长的霉菌，并对其 进行的初步鉴定；通过在不同温度或pH值条件下称量菌丝干重来确定菌种的最适 生长温度和pH值，研究结果为进一步研究
11、霉菌耐酸耐高温机制及其和客观条件的 关系奠定了基础。徐成勇等用淀粉培养基从收集来的酒饼中筛选出6株分解淀粉 能力较强的根霉，并对其糖化力、产酸力进行了研究，其结果为霉菌糖化力和耐 酸研究提供了可行思路，亦可按此筛选优良的菌株作为试验和生产。4.3.2 酵母菌酵母菌是一种单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。一种肉眼看不见的微 小单细胞微生物，能将糖发酵成酒精和二氧化碳，分布于整个自然界，是一种典 型的异养兼性厌氧微生物，在有氧和无氧条件下都能够存活，是一种天然发酵剂。 一般泛指能发酵糖类的各种单细胞真菌，可用于酿造生产，也可为致病菌-遗传工 程和细胞周期研究的模式生物。徐亚男等通过对酵母菌的筛选
12、鉴定，共得到11株 产淀粉酶菌株，酶学性质研究表明，该11株酵母菌在pH值为79时表现了较高 的酶活力，在pH值为56时保持稳定；最适反应温度为40,在3050时保 持较高酶活力；金属离子依赖性发现，Mg2+对酶有不同程度的激活作用，对 酶有抑制作用；十二烷基硫酸钠和乙二胺四乙酸对酶均有抑制作用，EDTA抑制酶 活约为50%,淀粉酶对二价金属离子具有一定的依赖作用。4.3.3 州9菌细菌是原核生物的一大类，形状有球形、杆形、螺旋形、弧形、线形等，一 般是用分裂繁殖。自然界中分布很广，对自然界物质循环起着重大作用。有的细 菌对人类有利；有的细菌能使人类、牲畜等发生疾病。而大曲中的细菌所产生的 淀
13、粉酶在酒的发酵过程中起着非常重要的作用。吴子龙等从丛台酒中温大曲中分 离高产淀粉酶的菌株，通过透明圈法和淀粉酶活力测定分别进行了初筛和复筛， 筛选出C3菌为高产淀粉酶的细菌，其淀粉酶活力为63.1 U,与原厂浓香型大曲的 相比，其淀粉酶活力提高了 44.4%。其中，C3为革兰氏阳性芽抱杆菌，其菌落为 黄褐色，表面无光泽、不透明且边缘整齐，有不规则突起。并通过生理生化性能 鉴定确定高产淀粉酶细菌的分类。对丛台酒高产淀粉酶细菌的分离，将为酒厂提 高大曲质量和出酒率提供菌种和依据。5创新点与项目特色(1)本课题是研究湘窖酒业大曲中高产淀粉酶的筛选及初步鉴定，此项过程 主要是对高产淀粉酶真菌的筛选。(
14、2)湘窖酒业目前面临着出酒率低的问题，而本次课题主要筛选出高产淀粉 酶的真菌，在极大程度上能提高由淀粉转向为糖类原料的转换，高产淀粉酶的高 效性以及专一性，使得出酒率增高，从而大大提高了酿酒的速率。(3)筛选出能稳定产生淀粉酶的真菌，并指导工业生产。6技术路线、拟解决的问题及预期成果IB逸出高广发野餐葭柱6.1 技术线路6.2 拟解决的问题对微生物筛选，需要选出高产淀粉酶的菌株，并对高产性以及耐酸性能是否 稳定进行鉴定，并对其最佳发酵条件进行优化。6.3 预期成果(1)能有效地筛选出高产淀粉酶及耐酸性的菌株1-2株，并对其进行初步的 鉴定，并且能够大量繁殖，用于指导生产。(2)发表学术论文1篇
15、，申请耐酸高产淀粉酶微生物产酶发酵工艺控制软件 著作权1项。7项目研究进度安排2020.06-2020.08 学习实验知识和方法，查阅、收集有关资料并且整理资料, 进行讨论，为下一阶段的计划提前做好准备。耐酸、高产淀粉酶微生物的分离筛选、鉴定及生物学特性研究。而寸酸、高产淀粉酶微生物的最佳发酵工艺条件，整理数据， 分析数据，分析实验时的问题，讨论后总结经验。发表学术论文1篇，申请耐酸 高产淀粉酶微生物产酶发酵工艺控制软件著作权1项。2022.01-2022.06 撰写总结报告，准备结题。8已有基础8.1 项目负责人有与本项目有关的研究积累和已取得的成绩学习了相关微生物的专业知识，具有一定的科研
16、素养，学习了生物技术实 践等课程，有着良好的生物基础，查阅学习了普通生物学实验、微生物学 实验指导等书籍，掌握了大部分的实验要点与技巧，懂得大部分实验仪器的实 际操作及使用方法，熟悉一些实验的相关流程，具备较强的动手操作能力。8.2 已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法(1)具有实验室:以邵阳学院李子园三栋教学楼103室生态酿酒实验室为主要 实验操作场地。(2)具有微生物分离、鉴定研究和技术指标测定的所有仪器与设备。(3)学院图书馆有相关文献资料，实验室有计算机网络可供文献检索。(4)学生已具备课题相关的基本知识、素养和能力。三、经费预算开支科目预算经费（元）主要用途阶段下达经费计划（元）前半阶段后半阶段预算经费总额10000620038001.业务费6500（1）计算、分析、测试费2000菌株鉴定10001000（2）能源动力费（3）会议、差旅费1000取样、参加微生 物学年会10000（4）文献检索费500资料打印，文献 查询等200300（5）论文出版费3000论文出版费、软 件著作权申请200010002.仪器设备购置费3.实验装置试制费4.材料费3500试剂耗材购买费20001500学校批准经费10000四、指导教师意见