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1、实验室六大常用消毒灭菌方法实验室常用的器材一般包括玻璃器材、金属器械、橡胶制 品及塑料制品等，每类器材的处理及消毒措施都有不同。严格 的消毒灭菌工作极为重要，直接影响着整个实验能否顺利进 行。目前常用的消毒灭菌方法多采用物理方法（如干热灭菌 法、湿热灭菌法、过滤除菌法、射线杀菌法等）和化学方法（消 毒剂、抗生素）两大类。1、湿热灭菌法湿热灭菌法是指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌 的方法，压力蒸汽湿热灭菌法是目前最常用的一种灭菌方法。 它利用高压蒸汽以及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的穿 透力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死亡。适合于布类工 作衣、各种器皿、金属器械、胶塞、蒸像水、棉塞
2、、纸和某些 培养液的灭菌。分为三种：（1）流通蒸气灭菌法：是指在常压条件下，采用100摄 氏度流通蒸气加热杀灭微生物的方法，灭菌时间通常为30-60 分钟。该法适用于消毒以及不耐高热制剂的灭菌，但不能保证 杀灭所有芽抱，是非可靠的灭菌方法。（2）间歇蒸汽灭菌法：利用反复多次的流通蒸汽加热， 杀灭所有微生物，包括芽胞。方法同流通蒸汽灭菌法，但要重 复3次以上，每次间歇是将要灭菌的物体放到371孵箱过夜， 目的是使芽胞发育成繁殖体。若被灭菌物不耐100高温，可 将温度降至75。(28(TC,加热延长为3060分钟，并增加次 数。适用于不耐高热的含糖或牛奶的培养基。(3)高压蒸汽灭菌法：103.4千
3、帕蒸汽压温度达 121. 3,维持 15-20 分钟。2、干热灭菌法是利用恒温干燥箱内1202 C150。C的高热，并保持90 120分钟，杀死细菌和芽抱，达到灭菌目的的一种方法。主 要适用于不便在压力蒸汽灭菌器中进行灭菌，且不易被高温损 坏的玻璃器皿、金属器械以及不能和蒸汽接触的物品的灭菌。 用此方法灭菌的物品干燥，易于贮存。酒精灯火焰烧灼灭菌法 也是属于干热灭菌的方法之一，在进行动物细胞体外培养工作 时，常须利用工作台面上的酒精灯火焰对金属器具及玻璃器皿 口缘进行补充灭菌。3、射线灭菌法利用紫外线灯进行照射灭菌的方法。紫外线是一种低能量 的电磁辐射，可以杀灭多种微生物。紫外线的作用机制是通
4、过 对微生物的核酸及蛋白质等的破坏作用而使其灭活。适合于实 验室空气、地面、操作台面灭菌。灭菌时间为30min。用紫外 线杀菌时应注意，不能边照射边进行实验操作，因为紫外线不 仅对人体皮肤有伤害，而且对培养物及一些试剂等也会产生不 良影响。4、化学消毒剂消毒法用于那些不能利用物理方法进行灭菌的物品、空气、工作 面、操作者皮肤、某些实验器皿等。常用的化学消毒剂包括甲 醛、高镒酸钾、70%75%乙醇、过氧乙酸、来苏尔水、0. 1%新 洁尔灭、环氧乙烷、碘伏或碘酊等。其中利用70%75%乙醇、 0. 1%0. 2%氯化汞、1096次氯酸钠、饱和漂白粉等进行实验材 料的灭菌；利用甲醛加高镒酸钾（2mL
5、甲醛+lg高镒酸钾）/n）3 或乙二醇（6mL/m3）等加热熏蒸法进行无菌室和培养室的消毒。 在使用时应注意安全，特别是用在皮肤或实验材料上的消毒 剂，须选用合适的药剂种类、浓度和处理时间，才能达到安全 和灭菌的目的。5、过滤除菌法是将液体或气体通过有微孔的滤膜过滤，使大于滤膜孔径 的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌的方法。过滤除菌法 大多用于遇热易发生分解、变性而失效的试剂、酶液、血清、 培养液等。目前，常用微孔滤膜金属滤器或塑料滤器正压过滤 除菌，或用玻璃细菌滤器、滤球负压过滤除菌。滤膜孔径应在 0. 220.45 um范围内或用更小的细菌滤膜，溶液通过滤膜 后，细菌和抱子等因大于滤膜孔
6、径而被阻，并利用滤膜的吸附 作用，阻制小于滤膜孔径的细菌透过。6、抗生素抑菌法主要用于培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手 段以及作为微生物污染不严重时的“急救”措施。常用的抗生 素有青霉素、链霉素和新霉素等。实验室常见的消毒灭菌1、无菌操作室灭菌培养材料进行培养、观察或更换培养液时，必须从各方面 防止任何污染物进入培养液或容器，所以无菌操作室的灭菌是 至关重要的。由于无菌操作室的污染来源主要是空气中的细菌 和真菌袍子，因此长期停用后的无菌操作室应进行熏蒸灭菌， 熏蒸是用高镒酸钾+甲醛（2ml甲醛+lg高镒酸钾）/m3进行无 菌室的灭菌。经常使用的无菌操作室，在每次使用前都应进行 地面卫
7、生清洁，并用紫外线灯照射30min,进行空气灭菌。对 超净工作台，每次操作前用紫外灯照射30min,然后用70% 75%酒精擦拭。2、培养液灭菌培养液在制备过程中带有各种杂菌，分装后应立即灭菌， 或在24小时内完成灭菌工序。目前常用过滤除菌法除去培养 物操作液和培养液中的细菌。或对培养液中耐热组分先进行高 压蒸汽灭菌，然后在无菌室加入经过过滤除菌的不耐热溶液， 混匀后分装备用。使用高压蒸汽灭菌器灭菌时，将分装好的培养液放入底部 有一定量（淹没加热管）凉水的高压蒸汽灭菌器内，增压至 0.350. 4kg/cm2时排净灭菌器内冷空气，以便使蒸汽能到达 各个消毒部位，保证消毒灭菌彻底。然后继续加压加
8、热，当压 力表读数达到1. 01. Ikg/cm2为121& C,保持力20min即 可。由于消毒灭菌效果取决于温度而不是压力，所以在一定压 力下保持较长的消毒灭菌时间是必须的。在12H C的蒸汽温度下可以很快杀死各种细菌及高度耐 热的芽抱杆菌，因此许多培养液的消毒灭菌压力、温度一般保 持在1. 0l. Ikg/cm2、1219 Co消毒灭菌时间与需要消毒灭菌 的培养液量密切相关（表2-3）,时间不足达不到灭菌效果，时 间过长培养液内的一些化学物质遭到破坏，影响培养液成分0 消毒灭菌结束后，关闭热源，只有当灭菌器内压力降为零时才 能打开放气阀，排除剩余蒸汽，取出培养液。不可在压力较高 时打开放
9、气阀，引起减压沸腾，使容器中液体溢出。培养液组成中如含有遇热易分解的物质，则需用过滤方法 消毒灭菌。首先对培养液中耐热组分进行高压蒸汽灭菌后放置 在无菌场所，固体培养液在409 C左右琼脂即将凝结前，加入 经过过滤除菌的不耐热溶液，混匀后冷却备用。液体培养液在 冷却到室温后再加入过滤除菌溶液。过滤除菌时，使用孔径为 0. 22-0. 45 um或更小的细菌滤膜。过滤除菌可利用抽滤装置 或注射过滤器进行，所用器皿均应进行高压消毒灭菌，温度不 应超过1215 Co3、玻璃器皿、塑料器皿和器械灭菌玻璃器皿可进行干热灭菌或高压蒸汽灭菌，但在蒸汽灭菌 后最好及时烘干水分。对不能进行高压蒸汽灭菌的塑料器皿
10、可 用75%酒精浸泡，使用前在无菌操作台面上晾干的同时，用紫 外线重复杀菌。实验室还可以用环氧乙烷灭菌袋对塑料器皿进 行消毒，消毒后的器皿要充分散气24小时后才可使用。无 菌操作所用的各种器械，一般采用干热或高压蒸汽灭菌，或用 75%酒精浸泡，然后在无菌操作台面上晾干的同时再用紫外线 重复杀菌；在使用期间可多次对其进行酒精灯火焰灼烧灭菌。4、培养材料的消毒灭菌采自动物机体的实验材料，携带着微生物及杂质，接种前 须进行表面消毒灭菌，对内部已受微生物侵染的材料应予以淘 汰。从动物机体采集的某些组织块，须用消毒剂进行浸泡处 理，进行表面消毒。常用消毒剂有过氧化氢（1012%,浸泡 515min）、过氧乙酸（0.05%,浸泡 30slmin）、酒精 （7075%,浸泡 2min）。