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1、材料与方法书写格式举例1材料与方法实验动物及标本处理1.1.1 实验动物及分组26 只 SPF 级 10 月龄 Sprague Dawley (SD)雌性大鼠，体质量(42550) g; 45 只 SPF 级3月龄SD雌性大鼠，体质量(30025) g,均由上海中医药大学实验动物中心购买并饲 养，合格证号：SCXK (沪)2008-0016。所有大鼠同一室内按组分笼饲养，室温1822C, 12h光照，12h黑暗的条件下，自由进食、饮水，饲喂大鼠标准饲料，大鼠全价颗粒饲料由 实验动物中心提供。其中18只10月龄大鼠饲养至16月龄作为自然衰老绝经状态模型、 18只3月龄大鼠行去势手术后作为去势绝经
2、状态模型、27只3月龄大鼠适应性喂养1周 作为青年模型、8只10月龄大鼠饲养至22月龄作为老年模型开始本实验，8周后处死。 在两组模型组中，10只大鼠下丘脑检测性激素促卵泡成熟激素(follicle stimulating hormone, FSH)促黄体生成素(luteinizinghormone, LH)雌二醇(estradiol, E2)及超氧化物歧化 酶(superoxidedismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、总抗氧化能力(totalanti- oxidative capacity, T-AOC); 5 只大鼠下丘脑检测线粒体 DNA (mi
3、tochondriaDNA, mt-DNA) 损伤基因Col、Coin表达；3只大鼠电镜下检测下丘脑线粒体微观结构。由于18月龄大 鼠饲养周期较长，与去势5月龄大鼠实验时间前后相错，因此血清、下丘脑性激素水平和 氧化损伤指标分开检测和统计，两次均设青年模型组，一次10只，另一次9只。1.1.2 去势手术方法大鼠经3%戊巴比妥钠L4mLkg”腹腔注射(ip)麻醉后，背位固定，剪除腹部长毛， 充分消毒术野，沿正中线开腹，暴露Y型子宫，在子宫远端找到包埋在脂肪团中的卵巢， 分离、套线结扎近端后剪除卵巢，止血后将子宫角送回腹腔，同法摘除另一侧卵巢，缝合腹 部切口。1.1.3 血清制备大鼠经3%戊巴比妥
4、钠L4mLkgip麻醉后，背位固定，沿正中线开腹，充分暴露腹 主动脉，抽取血液56mL,放置2h后，血样经4000rpm, 4c离心10min,取血清，-60 冰箱保存。1.1.4 下丘脑取材取下大鼠头颅，快速沿背侧正中线开颅，充分暴露大脑并仔细翻开，断开视交叉，以神 经分离棒分离并取出下丘脑，称重，置于Eppendorf离心管中于-60保存。1.2 主要试剂及来源FSH、LH、E2放免药盒(、)，北京北方生物技术研究所；SOD、MDA、T-AOC、考马 斯亮兰蛋白测试盒(、)，南京建成生物工程研究所第一分所；反转录试剂盒(PrimeScriptRT reagent Kit Perfect R
5、eal Time, TaKaRa Code: DRR037A), Real Time PCR 试剂盒SYBR PremixEx TaqTM II (Per feet Real Time) , TaKaRa Code: DRR081A均购自上海硕盟生物科 技有限公司；细胞色素氧化酶亚单位I (Co I )和HI (Colli) 7-8及内参照3-磷酸甘油醛 脱氢酶(GADPH)基因序列由上海博彩生 物科技有限公司合成。引物序列如下：Co I :F: 5GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-39,R: 59 -TA A ACTTC AGGGTG ACC A A A A A ATC A
6、-39;Colli:F: 5 9-CGTAGTAGGC A A AC AATA AGG-3 R: 5LTTCTATTCACCNTCTCGGAAAG3;GADPHF: 5GGTCGGAGTCAACGGATTTG-39,R: 5,-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3,1.3观察指标和测定方法1.3.1 检测血清和下丘脑性激素水平FSH、LH、E2按试剂盒要求操作。1.3.2 检测下丘脑SOD、MDA、T-AOC活性黄喋吟氧化酶法检测组织SOD,硫代巴比妥酸（TBA）比色分析法检测组织MDA,分 光光度比色法检测组织T-AOC,按试剂盒要求操作。1.3.3 利用RT-PCR方法检测下丘脑
7、线粒体DNA损伤基因指标Col、Colli提取下丘脑组织块中RNA,按照反转录试剂盒的实验操作将RNA反转录成cDNA,然 后按照Real Time PCR试剂盒的实验操作，以GADPH作为内参用FTC-2000型荧光定量 基因扩增仪进行cDNA的扩增，并进行数据处理。1.3.4 电镜检测下丘脑组织线粒体形态变化下丘脑取材后直接置于2.5%戊二醛溶液固定2h, 1%钺酸后固定2h,酒精和90%丙 酮阶梯脱水，100%丙酮浸透、包埋、超薄切片，醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染色后透射电子 显微镜下镜检。1.4 统计学方法所有数据应用SPSS 15.0软件包进行统计分析。两组间比较用t检验；数据符合方差齐 性要求，多组间差异采用单因素方差分析（ANOVA分析）及LSD法进行多重比较；若数 据不符合方差齐性要求，多组间差异则采用Kruskal-Wallis非参数检验及LSD法进行多重 比较。以P0.05&P0.01为差异有统计学意义。(神经药理学报,2011,1(02):28-34.)