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1、学习必备 欢迎下载 分子生物学教案 E DNA 复制 教学目的和要求 1 理解 DNA 复制的半保留机制和半不连续复制 2 掌握细菌 DNA 复制过程及有重要作用的酶和蛋白质 3 了解细胞周期 4 了解真核生物 DNA 复制的特点 E1 DNA 复制概述 半保留机制 DNA 两条亲代链分别作为模板催化新生子链的合成，新生 DNA 的一条链是原来的旧链，另一条是新合成的，为半保留复制。Meselson 和 Stahl(1958 年)用实验证明了该机制（见教材 P71）。亲代链分开及新生 DNA 开始复制处称为复制叉。DNA 合成的底物是脱氧核苷三磷酸（dNTP）:dATP dGTP、dCTP、d
2、TTP。合成的能量来自 dNTP的水解。复制子、复制起始与终点 以单一单位复制的任一段 DNA 都称为复制子。每个复制子都有固定的起始点，原核生物许多病毒的 DNA 呈环形，为单一复制子，通常两个复制叉从一个起始点向两个方向复制，复制的起始和细胞生长周期调节都在起始点处调节。真核生物的线性染色体由多复制子构成，每个复制子都有自己的起始点，起始点在最初解链处富含 AT 序列，它比富含 GC 的起始点更易解链。半不连续复制 由于 DNA 新链合成只允许以 5/3/方向 进行，而两条亲本链反向平行，因而一条新链从起始点按 5/3/方向连续合成（前导链），另一条新链（后随链）从复制叉开始按 5/3/方
3、向先合成一些短的 DNA 片段（冈崎片段），再由连接酶连成一条连续的 DNA。即前导链连续合成为长链，后随链则是间断合成的，这种合成方式为半不连续复制。RNA 引导 在每一片段的 5/端先合成一小段 RNA（引物），引导 DNA 合成。E2 细菌的 DNA 复制 起始 E.coli 的起始点位于遗传基因座 oriC，大肠杆菌编码的蛋白 DnaA 首先识别和结合于 oriC 的 9bp 重复序列形成复合物，约 45bp 成为单链，DnaB 进入，它是 DNA 解旋酶，利用 ATP 水解产生的能量解开双链 DNA，形成的单链泡被单链结合蛋白 Ssb 所覆盖。DNA引发酶结合到 DNA 上并合成引物
4、 RNA。解旋 DNA 解旋酶沿模板链前进，打开双螺旋使复制顺利进行，在闭环 DNA 中复制叉处解旋所形成的正超螺旋可通过型拓扑异构酶即 DNA 旋转酶的作用而释放。延伸 DNA 聚合酶的全酶二聚体引发体和 DNA 解旋酶结合成复合体（复制体），以每秒 900bp 的速率合成 DNA。引发体含有 DnaB 解旋酶和 DNA 引物酶，在后续链上间断合成 RNA 引物。DNA 聚合酶催化合成 DNA，该酶含有聚合酶 亚基和一个 3/5/外切核酸酶 亚基。DNA 聚合酶负责切除引物并填补缺口，该酶具有 5/3/聚合酶、5/3/外切核酸酶及 3/5/校正外切核酸酶活性。DNA 连接酶填补片段间的缺口。
5、终止与分离 两个复制叉在 oriC 约 1800 的对面相遇。该区域有终止子位点，它们与 DnaB抑制剂（tus 基因的产物）结合，阻止复制叉移动。复制结束后两个相扣的子链 DNA 由拓扑异构酶（一种型拓扑异构酶）解联，分配到两个子细胞。E3 细胞周期 细胞周期 细胞分裂为两个子细胞的全部过程为细胞周期，它包括 DNA 的复制和细胞分裂。细胞周期分 4 个时期：G1 期细胞为复制作准备；S 期 DNA 复制；G2 期 S 期后有学习必备 欢迎下载 丝分裂前的短暂期；有丝分裂期染色体对等分配到两个子细胞，它又有前、中、后期之分。G1、S、G2 共同组成间期。有丝分裂后，增殖的细胞进入下一个细胞周
6、期的 G1 期，也可脱离细胞周期进入非增殖的休眠状态 G0 期（沉默期）。检验点及其调控 在 G1 期有决定细胞进入下一个分裂周期的限制点（R 点），细胞分裂周期起始还需促细胞分裂原，若细胞在到达 R 点之前缺乏促细胞分裂原，细胞将重进 G0 期。细胞周期中终止细胞分裂的那些点叫检验点，它在间歇期发生以保证细胞分裂之前完成DNA 复制。细胞周期蛋白和 CDK 蛋白磷酸化是调控细胞周期进程的一个主要机制，由一个调节亚基（细胞周期蛋白）和依赖细胞周期蛋白的激酶（CDK）来完成，细胞周期蛋白 CDK 复合物决定将被磷酸化的目标蛋白。E2F 和 RB 的调控 由 G1 期进入 S 期主要依靠对 E2F
7、 这一转录因子的激活，E2F 的活性又受与其结合的蛋白 RB 的抑制，在 G1 中后期，细胞周期蛋白 CDK 复合物使 RB 磷酸化从而释放 E2F 进而激活转录。细胞周期的激活、抑制和癌症 小的抑制蛋白如 CIP 蛋白和 INK4 蛋白可通过抑制细胞周期蛋白 CDK 复合物的活性来延迟细胞周期的进程。细胞周期与癌症间有着根本的联系，G1 到 S 期的过渡受到原癌基因和抑癌蛋白的调控。B细胞的癌变与细胞周期蛋白 D1 基因的过表达相关。人类癌症中两个重要的抑癌基因产物抑癌蛋白 RB 和 P53 均与细胞周期调控密切相关，RB 调控 E2F 的活性，当 DNA 损伤时，P53 诱导 P21 WA
8、F1/CIP1 的合成。E4 真核生物的 DNA 复制 实验系统 仅有 400 个复制子的酵母，更为简单的猿猴病毒（SV40）病毒都是很好的模型。非洲爪蟾卵提取物广泛用于外加 DNA 或整个细胞核的复制。起始点和起始 约 2050 个复制子串联成簇在 S 期同时开始复制，常染色质先复制，其次为异染色质，最后是着丝粒和端粒。酵母的起始点都有一个 11bp 长的保守序列（自动复制序列 ARS），它可结合起始点识别复合体（ORC），被 CDK 激活后引导 DNA 复制。每个复制子仅起始一次，特许因子在作用后失活能防止复制的再次起始。复制叉 真核生物复制叉移动速度为每秒 50bp，该过程需要解旋酶、单
9、链结合蛋白（复制蛋白 A）和 3 种 DNA 聚合酶。聚合酶 引发复制的起始，聚合酶 延伸前导链，聚合酶 完成后续链的复制。DNA 及复制所需的蛋白质均固定在核基质上。端粒的复制 真核染色体末端（端粒）由多个简单重复序列构成，不带遗传信息，且 3/端突出于 5/端 以防止半不连续复制不能复制线性染色体末端而造成遗传信息的丢失。端粒酶负责端粒 DNA 的复制，它带有与端粒重复序列互补的 RNA 分子。该酶在体细胞中处于抑制状态，但在许多癌细胞中处于激活状态。F DNA 损伤、修复与重组 教学目的和要求 1 了解突变的种类和产生的因素 2 理解 DNA 复制忠实性的机制 3 掌握 DNA 修复的机
10、制 4 掌握 DNA 重组的方式及原理 F1 诱变 突变 指 DNA 碱基序列发生的永久的可遗传的改变。一个单一碱基的改变为点突变，它包括转换（嘌呤与嘌呤，嘧啶与嘧啶间的互换）或颠换（嘌呤与嘧啶间的互换）。如果点突变及有重要作用的酶和蛋白质了解细胞周期了解真核生物复制的特点复制概述半保留机制两条亲代链分别作为模板催化新生子链的合成新生的一条链是原来的旧链另一条是新合成的为半保留复制和年用实验证明了该机制见教材亲代链 单一单位复制的任一段都称为复制子每个复制子都有固定的起始点原核生物许多病毒的呈环形为单一复制子通两个复制叉从一个起始点向两个方向复制复制的起始和细胞生长周期调节都在起始点处调节真核
11、生物的线性染色体由多复 于新链合成只允许以方向进行而两条亲本链反向平行因而一条新链从起始点按方向连续合成前导链另一条新链后随链从复制叉开始按方向先合成一些短的片段冈崎片段再由连接酶连成一条连续的即前导链连续合成为长链后随链则是学习必备 欢迎下载 发生在 DNA 的非编码区、非调节区或密码子的第 3 个碱基，它不会影响渗入蛋白质中的氨基酸，为沉默突变；如果发生氨基酸的改变，则为错义突变。形成新的终止密码的突变为无义突变，产生截短的蛋白质产物。一个或多个碱基的增加或丢失，会引起移码突变。群体中许多沉默突变及非致死性突变的积累会产生遗传多态性。复制忠实性 复制的精确性有 3 种机制：互补碱基配对原则
12、（模板链和进入核苷酸在 DNA聚合酶的作用位点正确配对）；聚合酶的 3/5/外切酶活性有校对功能，它能回走从 3/端切掉错配核苷酸，引物是 DNA 聚合酶发挥自我校正功能的必要条件；逃脱校对的错误可被错配修复机制所纠正。诱变剂 常见的物理诱变剂为紫外线，它引起相邻嘧啶核苷酸产生嘧啶二聚体。化学诱变剂种类很多，碱基类似物可改变碱基配对特性，诱发直接突变（如 5溴尿嘧啶是胸腺嘧啶的类似物）。亚硝酸使胞嘧啶脱氨变成尿嘧啶，引起复制中 A T 向 G C 转化。烷化剂能在DNA 不同位置加上烷基，造成碱基脱落，经修复才能防止 DNA 损伤，细胞对损伤的处理有可能会由于间接诱变而导致突变。直接诱变和间接
13、诱变 DNA 中存在稳定的、配对特性发生改变的碱基而导致的突变为直接诱变；在有些情况下，一些损伤 DNA 聚合酶为了保证染色体的完整性在损伤对应的位点上插入错误的碱基，导致间接诱变；突变发生在损伤的位点上为定点突变，发生在其它位点为非定点突变。原核生物中转移损伤 DNA 合成属于对 DNA 损伤的 SOS 反应（有时也叫“易错修复”）F2 DNA 损伤 碱基的损伤和丢失 DNA 的一些损伤是自发的，如胞嘧啶会自发水解脱氨变为尿嘧啶，它会在接下来的复制中与腺嘌呤配对。生理温度下，哺乳动物的基因组每天约失去 10000 嘌呤和几百个嘧啶。许多已改变的碱基会被专一性的 DNA 糖基化酶所除去，形成无
14、嘌呤和无嘧啶位点或 AP 位点。氧化性损伤 自由基可攻击 DNA，产生氧化产物造成氧化损伤 烷基化 烷化剂为亲电化学试剂，可将烷基加到核酸的各种位点，导致 DNA 损伤。有些是致死性的，多数导致间接诱变损伤。聚化加合物 紫外线使相邻嘧啶，尤其是胸腺嘧啶形成环丁烷嘧啶二聚体；煤焦油中的苯并芘在肝脏产生的一种产物可与鸟嘌呤残基共价结合；芳香族烷化剂、黄曲霉毒素 B1 均可与DNA 共价结合。F3 DNA 修复 光复活 DNA 中的嘧啶二聚体可通过可见光的光解作用而恢复为单体，催化此过程的酶是DNA 光解酶（光复活酶）。E.coli 的光解酶有两个发色团：蝶呤和 FAD。这是一种无差错的“直接修复”
15、。烷基转移酶 该酶可直接从突变的 O6烷基鸟嘌呤上除去烷基，酶作用后即失活。它也属于无差错直接修复。切除修复 为普遍的无差错的修复机制。有两种形式：核苷酸切除修复（如 E.coli 中的UvrABC 内切核酸酶识别并切除嘧啶二聚体和其他大块损伤，缺口可由 DNA 聚合酶和连接酶填补）；碱基切除修复（专一的 DNA 糖基化酶识别修饰碱基，切除修饰碱基与糖基间的 N糖苷键，留下一个脱嘌呤或脱嘧啶的 AP 位点，AP 内切核酸酶在该位点切开 DNA。错配修复 是一种特殊的切除修复，它是按模板的遗传信息来修复错配碱基的，因此修复时首先要区别模板链和新合成的 DNA 链。它通过碱基的甲基化来实现的。大肠
16、杆菌 DNA 的5/GATC 序列中 A 的 N6 都是甲基化的（Dam 甲基化酶负责），复制后的一个短暂时间内，新合成链的 GATC 中的 A 未被甲基化，故子代 DNA 暂时是半甲基化的，这是识别的基础。错配的碱基被 MutS 和 MutL 组合的复合体识别并与之结合，再与 MutH 内切核酸酶结合，及有重要作用的酶和蛋白质了解细胞周期了解真核生物复制的特点复制概述半保留机制两条亲代链分别作为模板催化新生子链的合成新生的一条链是原来的旧链另一条是新合成的为半保留复制和年用实验证明了该机制见教材亲代链 单一单位复制的任一段都称为复制子每个复制子都有固定的起始点原核生物许多病毒的呈环形为单一复
17、制子通两个复制叉从一个起始点向两个方向复制复制的起始和细胞生长周期调节都在起始点处调节真核生物的线性染色体由多复 于新链合成只允许以方向进行而两条亲本链反向平行因而一条新链从起始点按方向连续合成前导链另一条新链后随链从复制叉开始按方向先合成一些短的片段冈崎片段再由连接酶连成一条连续的即前导链连续合成为长链后随链则是学习必备 欢迎下载 后者在子代链 GATC 附近的位点上产生缺刻，启动对损伤区的切除修复。遗传性非息肉结肠癌就是一种错配修复酶突变丢失引起的。着色性干皮病（XP）患者缺乏对紫外线引起的大块 DNA 损伤的切除功能，对阳光极度敏感，易患皮肤癌 F4 重组 同源重组 也称一般重组，即两个
18、双螺旋 DNA 分子间同源序列进行交换。双倍体真核生物发生在减数分裂过程，非姐妹染色单体交换相对应的区域，产生的单倍体配子会包含父母本两方的遗传信息。单倍体细菌也可重组，如发生在部分已复制 DNA 间或染色体 DNA 与外源 DNA（质粒或噬菌体）间。重组的过程和机制包括断裂复合、异源双链、分支迁移、Holliday 结构、拆分（见教材 P98 图）。大肠杆菌的核酸酶和 RecBCD 结合在 chi 序列上并产生切口形成单链末端，单链 DNA 被 RecA 蛋白包裹，4 条单链形成 Holliday 结构。同源重组对 DNA 修复也很重要（复制后修复或重组修复）。位点特异性重组 非同源 DNA
19、 的特异片段间的交换，它是在结合序列部位由特异的酶来催化断裂重接，而同源重组则是由能与 RecA 蛋白结合的 DNA 序列随机断裂引发的。噬菌体可将自身基因组插入大肠杆菌染色体的特定位点，噬菌体编码的整合酶与细菌编码的整合宿主因子（IHF）促成重组结果和 DNA 进入宿主染色体。噬菌体编码的切除酶被激活时，整合作用发生逆转，DNA 脱离细菌基因组。在真核生物中，免疫球蛋白有 3 个基因段编码重链和轻链的可变区：V、D 和 J。这些基因段间的重组产生大量的不同重链和轻链基因序列，导致抗体种类的多样化。转座作用 又称非常重组，一些短的 DNA 片段（转座子或转座元件）可转移进基因组的几乎任何位置。
20、转座子均有两个结构特征：两端有 2040bp 的反向重复序列；具有编码转座酶的基因，该酶催化转座子插入新的位置。E.coli 中的 IS 元件（插入序列）是最为简单的转座子。Tn 转座子系列除了转座酶，还携带其它基因（如抗性基因），其中的 内酰胺酶可使生物体抗青霉素。酵母中的 Ty 元件编码的蛋白与反转录病毒的反转录酶和整合酶相似，Ty元件两侧为长末端重复序列，它先转录成 RNA 再反转录到 DNA 双螺旋中，然后插入到其它地方，果蝇的 copia 转座子与其相似，称为反转录转座子。高等真核生物中的一些分散重复序列（如 LINES 和 SINES）很可能是通过转座作用在基因组内传播的。及有重要
21、作用的酶和蛋白质了解细胞周期了解真核生物复制的特点复制概述半保留机制两条亲代链分别作为模板催化新生子链的合成新生的一条链是原来的旧链另一条是新合成的为半保留复制和年用实验证明了该机制见教材亲代链 单一单位复制的任一段都称为复制子每个复制子都有固定的起始点原核生物许多病毒的呈环形为单一复制子通两个复制叉从一个起始点向两个方向复制复制的起始和细胞生长周期调节都在起始点处调节真核生物的线性染色体由多复 于新链合成只允许以方向进行而两条亲本链反向平行因而一条新链从起始点按方向连续合成前导链另一条新链后随链从复制叉开始按方向先合成一些短的片段冈崎片段再由连接酶连成一条连续的即前导链连续合成为长链后随链则是