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1、学习必备 欢迎下载【课题 5】：课题 1 DNA 的粗提取与鉴定【知识回顾】一、实验原理 1、提取 DNA 的方法 提取生物大分子的基本思路是。对于DNA 的粗提取而言，就是要利用、等在物理和化学性质方面的差异，提取 DNA，去除其他成分。1）DNA 的溶解性 思考题 1：DNA 在氯化钠溶液中的溶解度有什么特点？对此有什么应用？2）DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解，但是对 没有影响。大多数蛋白质不能忍受 6080oC 的高温，而 DNA在 以上才会变性。洗涤剂能够瓦解，但对 DNA 没有影响。3）DNA 的鉴定 思考题 2：依据什么原理来鉴定 DNA？在 条件下，DNA遇 会
2、被染成 色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA 的试剂。二、实验设计 1、实验材料的选取 凡是含有 的生物材料都可以考虑，但是使用 的生物组织，成功的可能性更大。2、破碎细胞，获取含 DNA 的滤液 1）制备和提取细胞核物质：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例。在鸡血细胞液中加入一定量的，同时用 搅拌，得到鸡血细胞液。过滤后收集研磨液；如果实验材料是植物细胞，需要先用 溶解细胞膜。例如，提取洋葱的 DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的 和，进行充分的搅拌和研磨。过滤后收集研磨液。2）溶解细胞核的 DNA：向收集的滤液中加入 的溶液，搅拌使 DNA 呈溶解状态。3、去除滤液中的杂质 方案一的原理是
3、DNA 在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解 DNA；方案三的原理是蛋白质和 DNA 的变性温度不同。4、DNA 的析出与鉴定 将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积、冷却的，静置，溶液中会出现，这就是粗提取的 DNA。用玻璃棒 搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。取两支 20ml 的试管，各加入物质的量浓度为 的 NaCl 溶液 5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入 4ml 的。混合均匀后，将试管置于 中加热 5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有 DNA 的溶液是否变。三
4、、实验案例：以鸡血细胞 DNA 的提取和鉴定为例：学习必备 欢迎下载 1制备鸡血细胞液：在鸡血中加入质量浓度为 0 1g/mL 的柠檬酸钠溶液，离心处理；加入柠檬酸钠的目的：2提取鸡血细胞的细胞核物质：向鸡血细胞液中加入蒸馏水，搅拌、过滤；思考 1：加入蒸馏水的目的是什么？为什么能达到此目的？3溶解细胞核内的 DNA：加入 2mol/L 的氯化钠溶液，搅拌，使 DNA 呈溶解状态；4析出含 DNA 的黏稠物：加入蒸馏水，用玻璃棒搅拌；思考题 2：此时加入蒸馏水的目的是什么？5滤取含 DNA 的黏稠物：过滤；思考题 3：这次过滤与上次过滤的目的一样吗？为什么？6将 DNA 的黏稠物再溶解：加入
5、2mol/L 的氯化钠溶液，搅拌，使 DNA 呈溶解状态；7过滤含有 DNA 的氯化钠溶液：思考题 4：这一步骤过滤的目的是什么？思考题 5：为什么反复地溶解与析出 DNA，能够去除杂质？8提取含杂质较少的 DNA：加入冷却的 95%的酒精，搅拌；思考题 6：这一步骤的目的是什么？9 DNA 的鉴定：取两支试管，各加入 0 015mol/L 的氯化钠溶液 5mL，一支加入提取的 DNA，两支各加入 4mL的二苯胺试剂。混合均匀后置于沸水中加热。四、操作提示 1、以血液为实验材料时，每 100ml 血液中需要加入 3g，防止。2、加入洗涤剂后，动作要、，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操
6、作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要，以免，导致 DNA 分子不能形成絮状沉淀。3、二苯胺试剂要，否则会影响鉴定的效果。4 DNA 的溶解度与 NaCl 溶液浓度的关系：当 NaCl 溶液浓度低于 0.14mol/L 时，随浓度的升高，DNA 的溶解度降低；当 NaCl 溶液浓度高于 0.14mol/L 时，随浓度升高，DNA 的溶解度升高。5盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的 DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内 DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的 DNA 就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的 DN
7、A 的损失。典例解析 本实验中有三次过滤：过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液过滤含粘稠物的 0.14mol/LNaCl 溶液 过滤溶解有 DNA 的 2mol/LNaCl 溶液 以上三次过滤分别为了获得（）A含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含 DNA 的滤液 B 含核物质的滤液、滤液中 DNA 粘稠物、含 DNA 的滤液 C 含核物质的滤液、滤液中 DNA 粘稠物、纱布上的 DNA D含较纯的 DNA 滤液、纱布上的粘稠物、含 DNA 的滤液 取而言就是要利用异提取去除其他成分的溶解性思考题在氯化钠溶液中的溶解度有什么特点对此有什么应用对于等在物理和化学性质方面的差会被染成色因此二苯胺可以作为鉴定
8、的生的溶液搅拌使呈溶解状态但是对没有影响以上才 的鉴定思考题依据什么原理来鉴定在条件下遇的剂二实验设计实验材料的选取凡是含有的生物材料都可以考虑但是使用物组织成功的可能性更大破碎细胞获取含的滤液制备和提取细胞核物质动物细胞的破碎比较容易以鸡血细胞为例 的洋葱中加入一定的和溶解细胞核的向收集的滤液中加入去除滤液中的杂质方案一的原理是在不同浓度溶液中溶解度不同方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质不分解方案三的原理是蛋白质和的变性温度不同的析出与鉴定将处理后的溶学习必备 欢迎下载 答案：A解析:用蒸馏水稀释鸡血细胞液，使血细胞的细胞膜、核膜破裂，释放出核物质，此时过滤只能得到含 DNA和其他物质如蛋白质的
9、滤液，这种滤液必须经过实验中其他步骤得相继处理，方能得到较纯的 DNA。DNA 在 0.13mol/LNaCl 溶液中溶解度最低，成丝状粘稠物，可经过滤留在纱布上。【习题巩固】一、选择题（10 个）1.在研究 DNA的基因样本前，采集来的血样需要蛋白水解酶处理，然后用有机溶剂除去蛋白质。用蛋白水解酶处理血样的目的是（）A.除去血浆中的蛋白质 B.除去染色体上的蛋白质 C.除去血细胞表面的蛋白质 D.除去血细胞中的所有的蛋白质，使 DNA 释放，便于进一步提纯 2与析出 DNA 粘稠物有关的叙述，不正确的是（）A.操作时缓缓滴加蒸馏水，降低 DNA 的溶解度 B.在操作 A时，用玻璃棒轻缓搅拌，
10、以保证 DNA 分子完整 C.加蒸馏水可同时降低 DNA 和蛋白质的溶解度，两者均可析出 D.当丝状粘稠物不再增加时，此时 NaCl 的浓度相当于 0.14mol/L 3洗涤剂能够瓦解（），但对 DNA 没有影响。A.细胞壁 B.细胞膜 C.细胞核 D.细胞质 4在沸水浴的条件下，DNA 遇（）会被染成蓝色。A.斐林试剂 B.苏丹染液 C.双缩脲试剂 D.二苯胺 5在 DNA 提取过程中，最好使用塑料试管和烧杯，目的是（）A.不易破碎 B.减少提取过程中 DNA 的损失 C.增加 DNA 的含量 D.容易洗刷 6下列操作中，对 DNA 的提取量影响最小的是（）A.使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，
11、放出 DNA 等核物质 B.搅拌时，要使用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌 C.在“析出 DNA 粘稠物”时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增加 D.在用酒精沉淀 DNA 时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却 E 在 DNA 的溶解和再溶解时，要充分搅拌 7 DNA的粗提取中，将与滤液体积相等的、冷却的（），静置 2 3min，溶液中会出现白色丝状物。A.0 9%的 NaCl B.0.14mol/L 的 NaCl 溶液 C.质量分数 15%的 HCl D.体积分数为 95%的酒精溶液 8.以血液为实验材料时，需要向血液中加入（），防止血液凝固。A.醋酸钠 B.龙胆紫 C.柠檬酸钠 D.
12、醋酸洋红 9.在向溶解 DNA 的 NaCl 溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（）A.加快溶解 DNA 的速度 B.加快溶解杂质的速度 C.减少 DNA 的溶解度，加快 DNA 析出 D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出 10.去除滤液中的杂质时，直接在滤液中加入嫩肉粉，利用嫩肉粉中的（）分解蛋白质。A.胃蛋白酶 B.胰蛋白酶 C.木瓜蛋白酶 D.肠肽酶 二、非选择题（3 个）1提取鸡血中 DNA 时，要除去血液中的上清液，这是因为什么？取而言就是要利用异提取去除其他成分的溶解性思考题在氯化钠溶液中的溶解度有什么特点对此有什么应用对于等在物理和化学性质方面的差会被染成色因此二苯胺可以作为鉴定的生
13、的溶液搅拌使呈溶解状态但是对没有影响以上才 的鉴定思考题依据什么原理来鉴定在条件下遇的剂二实验设计实验材料的选取凡是含有的生物材料都可以考虑但是使用物组织成功的可能性更大破碎细胞获取含的滤液制备和提取细胞核物质动物细胞的破碎比较容易以鸡血细胞为例 的洋葱中加入一定的和溶解细胞核的向收集的滤液中加入去除滤液中的杂质方案一的原理是在不同浓度溶液中溶解度不同方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质不分解方案三的原理是蛋白质和的变性温度不同的析出与鉴定将处理后的溶学习必备 欢迎下载 2填写本实验完成下列实验操作时所用试剂。提取鸡血细胞中核物质 溶解核内 DNA：析出 2mol/LNaCl 溶液中的 DNA DN
14、A 粘稠物的再溶解 提取杂质较少的 DNA 白色乳状丝状物 DNA 的鉴定 3.关于 DNA粗提取的实验材料的选择，也经过了多次实验效果的比较，最终选择鸡血做实验材料的原因是什么？请回答下列问题：鸡血细胞中红细胞，家鸡属于鸟类，新陈代谢旺盛，因而血液中 细胞数目较多，可以提供丰富的。生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，若他们按实验要求完成实验步骤后，结果是，这是因为这些动物和人一样，成熟的红细胞中，但若改用动物肝脏做实验材料，实验能顺利进行。这是因为。若选用动物肝脏做实验材料，在提取之前，最好增加 程序，使组织细胞更易分离。【疑难点拨】1为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？答：蒸馏水对于
15、鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出 DNA。2加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于 DNA 的释放；食盐的主要成分是 NaCl，有利于 DNA 的溶解。3如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？答：研磨不充分会使细胞核内的 DNA 释放不完全，提取的 DNA 量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。4此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和 RNA 等杂质。5为什么反复地溶解与析
16、出 DNA，能够去除杂质？答：用高盐浓度的溶液溶解 DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使 DNA 析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出 DNA，就能够除去与 DNA 溶解度不同的多种杂质。6方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的 DNA 与蛋白质分开；方案三利用的是DNA 和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与 DNA 分离。7.DNA 的溶解度与 NaCl 溶液浓度的关系：当 NaCl 溶液浓度低于 0.14mol/L 时，随浓度的升高，DNA 的溶解度降低；当 NaCl 溶液浓度高于 0.14mol/
17、L 时，随浓度升高，DNA 的溶解度升高。取而言就是要利用异提取去除其他成分的溶解性思考题在氯化钠溶液中的溶解度有什么特点对此有什么应用对于等在物理和化学性质方面的差会被染成色因此二苯胺可以作为鉴定的生的溶液搅拌使呈溶解状态但是对没有影响以上才 的鉴定思考题依据什么原理来鉴定在条件下遇的剂二实验设计实验材料的选取凡是含有的生物材料都可以考虑但是使用物组织成功的可能性更大破碎细胞获取含的滤液制备和提取细胞核物质动物细胞的破碎比较容易以鸡血细胞为例 的洋葱中加入一定的和溶解细胞核的向收集的滤液中加入去除滤液中的杂质方案一的原理是在不同浓度溶液中溶解度不同方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质不分解方案三的
18、原理是蛋白质和的变性温度不同的析出与鉴定将处理后的溶学习必备 欢迎下载 思考题 5、加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出 DNA；蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂。思考题 6、使氯化钠溶液浓度接近 0 14mol/L，使 DNA 最大限度地析出。思考题 7、不一样；这次过滤是为了去除不溶于氯化钠溶液的杂质，而上次过滤是为了去除破裂的细胞膜等物质。思考题 8、除去含有 DNA 滤液中的杂质；思考题 9、用高盐浓度的溶液溶解 DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使 DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解
19、与析出 DNA，就能够除去与 DNA溶解度不同的多种杂质。思考题 10、去除溶于酒精的杂质；思考题 11、可抑制核酸水解酶的活性，防止降解 DNA；降低分子的运动，易于形成沉淀析出；低温有利于增加 DNA 分子柔韧性，减少断裂。思考题 12、确定二苯胺不与氯化钠发生颜色反应；实验组试管中可看到溶液变蓝色。课题 5 答案 DCBDB BDCCC 1 答案：因为上清液是血浆，不含有血细胞，DNA 存在于沉郁试管底部的鸡血细胞的细胞核中，所以提取鸡血中的 DNA 时，要除去血液中的上清液。2 答案：蒸馏水 2mol/LNaCl 溶液蒸馏水 2mol/LNaCl 溶液冷却的 95%的酒精二苯胺 3 答
20、案：含细胞核；红；DNA 鸡血细胞液中 DNA 相对含量很难提取到 DNA；无细胞核；肝细胞有细胞核研磨 取而言就是要利用异提取去除其他成分的溶解性思考题在氯化钠溶液中的溶解度有什么特点对此有什么应用对于等在物理和化学性质方面的差会被染成色因此二苯胺可以作为鉴定的生的溶液搅拌使呈溶解状态但是对没有影响以上才 的鉴定思考题依据什么原理来鉴定在条件下遇的剂二实验设计实验材料的选取凡是含有的生物材料都可以考虑但是使用物组织成功的可能性更大破碎细胞获取含的滤液制备和提取细胞核物质动物细胞的破碎比较容易以鸡血细胞为例 的洋葱中加入一定的和溶解细胞核的向收集的滤液中加入去除滤液中的杂质方案一的原理是在不同浓度溶液中溶解度不同方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质不分解方案三的原理是蛋白质和的变性温度不同的析出与鉴定将处理后的溶