Bac-to-Bac杆状病毒表达系统_医学心理学-医学研究方法.pdf

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1、.资料.Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统 试剂盒容物：Introduction：Overview：Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在 Ecoli 中扩增。Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac 捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。*一个 Ecoli 宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染 pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。*一个控制表达的质粒，包括

2、Gus 和/或 CAT 基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。Bac-to-Bac 表达系统的优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的 4-6 周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒 DNA 所包含亲缘和非重组病毒的几率*可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白 选择 pFastBac 菌体（Vector）：大量的 pFastBac 菌体都适于进行 Bac-to-Bac 表达系统。选择对于你的需要最合适的菌体。Vector 特点 参考 pFastBac TM1

3、高水平表达的强 AcMNPV聚乙烯（PH）启动子 用于简单克隆的大量克隆位点 Anderon 1996 pFastBac TMHT 高水平表达的聚乙烯启动子；N-末端含有 6XHis，可以用来纯化重组蛋白，并可用 TEV蛋白酶切去；提供 3 个阅读框 Polayes 1996 pFastBac TMDual 两个强启动子（PH 和 p10）Harris 和 Polaye 1997.资料.可以同时表达两种蛋白；两个大的克隆位点 指南用途：指南提供了一个对于 Bac-to-Bac 表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆目的基因到 pFastBac TM 供体质粒的选择 2、转化 pFastBa

4、c TM 结构到最高效的 DH10Bac TM 产生重组质粒 3、转染重组质粒 DNA 到昆虫细胞产生重组杆状病毒 4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白 重要的：Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。我们高度推荐使用者具有病毒和组织培养的技术和知识。Bac-to-Bac 表达系统 表达系统的成分：表达系统简单高效的产生重组杆状不能给党。基于 Lu

5、ckow1993 年的方法，此系统利用了位点特意的专座子 Tn7 区简化和提高重组质粒 DNA*系统的第一个成分是用来克隆目的基因的 pFastBac TM 菌株。基于 pFastBac TM 菌株的选择，表达基因被AcMNPV 的 PH 或 p10 启动子控制，在昆虫细胞高水平表达表达框被 Tn7 的左右臂包围，并且包含一个庆大霉素抗性点和 SV40 多腺苷酸化信号，形成一个微型的 Tn7*第二个主要结构是 Ecoli 的 DH10Bac TM 品系，用来作为 pFastBac TM 菌株的宿主。DH10Bac TM 细胞包含带有微型-attTn7 靶位点的病毒质粒和辅助质粒（详细见下文）。

6、一旦 pFastBac TM 表达质粒转入 DH10Bac细胞，转化就会发生在 pFastBac TM 菌株的微型 Tn7 单位和微型-attTn7 的靶位点之间产生重组质粒。这个转化反应发生在辅助质粒提供的转化蛋白处。如果你已经完成了转化反应，你需要分离这个高分子量的重组质粒 DNA 并将质粒 DNA 转染如昆虫细胞趋产生重组杆状病毒，用来进行初步表达实验。在杆状病毒株扩增和滴定后，高效价的病毒株可以用来感染细胞，进行大规模的重组蛋白的表达。杆状病毒菌株：病毒菌株（杆粒），bMON14272(136KB)，在 DH10Bac Ecoli 中包括：*一个低拷贝的 微型 F 复制子*卡那霉素的抗

7、性标记*一个来自于 pUC 载体的编码 LacZa 肽的 DNA 片段，用来接触病毒转座子，Tn7（微型 attTn7）已经被插入。插入的微型 attTn7 不会中断 LacZa 肽的阅读框。杆粒在具有卡那抗性的大的质粒 Ecoli DH10Bac 中扩增，在显色物质如 Bluo-gal 或 X-gal 和诱导剂 IPTG存在时，能补充染色体 LacZ 的缺失形成蓝斑（LacZ+）辅助质粒：DH10Bac Ecoli 也包含辅助质粒，pMON7124(13.2kb)，他编码转移酶和四环素抗性基因。这个辅助质粒提供 Tn7 转化功能。图示 Bac-toBac 系统：下图刻画了重组病毒的产生和目的

8、基因的表达 状病的质粒杆粒的位点特意转座子的表达框的质粒在中扩增杆状病毒表达系统主要包括捐献质粒的选择它要能够产生包含目的位点的表达结构这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制一个宿主包含杆状病毒质粒杆粒和辅 毒表达葡萄糖酸酐酶和或氯霉素乙酰转移酶表达系统的优点使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的周相比鉴别纯化重组病毒少于两周减少了从点筛选重组病毒所包含亲 达系统选择对于你的需要最合适的菌体特点参考高水平表达的强聚乙烯启动子用于简单克隆的大量克隆位点高水平表达的聚乙烯启动子末端含有可以用来纯化重组蛋白并可用蛋白酶切去提供个阅读框两个强

9、启动子和和资料可以同时.资料.实验轮廓：流程：下图揭示了表达目的基因的一般步骤 1、pFastBac donor 质粒（步骤：目的基因的克隆）得到 2、pFastBac 重组体（转化至 DN10Bac 细胞（含有杆粒和 helper）得到 3、含有重组杆粒的 Ecoli 细胞（重新划线）得到 4、验证过的含有重组杆粒的 Ecoli 细胞（过夜培养，分离重组杆粒 DNA）得到 5、重组杆粒 DNA（使用 Cellfectin 试剂感染细胞）得到 6、P1 重组杆状病毒株（10 6pfu/ml）（感染昆虫细胞扩增病毒）得到 7、P2 重组杆状病毒株（10 7pfu/ml）（滴定感染昆虫细胞）得到

10、8、蛋白的表达 培养昆虫细胞：一般指导：介绍：对于您的杆状病毒转移菌，我们推荐使用 Sf9 和 Sf21 昆虫细胞作为宿主。在开始你的转化试验和表达之前，确定你有收获的 Sf9 和 Sf21，并将其冻存。使用无血清的介质：昆虫细胞可能在无血清的条件下收获。我们推荐使用 Sf900 SFM。Sf900 SFM对于维持 Sf9 和 Sf21 以及对于大规模生产重组蛋白，都是无蛋白的最优的介质。状病的质粒杆粒的位点特意转座子的表达框的质粒在中扩增杆状病毒表达系统主要包括捐献质粒的选择它要能够产生包含目的位点的表达结构这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制一个宿主包含杆状病毒质粒杆粒和辅 毒表

11、达葡萄糖酸酐酶和或氯霉素乙酰转移酶表达系统的优点使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的周相比鉴别纯化重组病毒少于两周减少了从点筛选重组病毒所包含亲 达系统选择对于你的需要最合适的菌体特点参考高水平表达的强聚乙烯启动子用于简单克隆的大量克隆位点高水平表达的聚乙烯启动子末端含有可以用来纯化重组蛋白并可用蛋白酶切去提供个阅读框两个强启动子和和资料可以同时.资料.昆虫细胞培养参考指导：维持和传代昆虫细胞在贴壁和悬浮条件下 冷冻细胞 使用无血清的介质 按比例增加细胞产量 一般指导：昆虫细胞对于环境很敏感，此外化学和营养因素，物理因素都可以影响昆虫细胞的

12、成长。需要优化以得到最大产量。考虑以下培养条件：*温度：细胞的感染和成长的最适合围是 27-28 度*PH：对于许多培养系统 6.1-6.4 时合适的围。Sf900 SFM 在此围支持一般的空气和开盖培养*同渗重摩：鳞翅类细胞使用介质的最优同渗重摩是 345-380 mOsm/kg*通风：对于最优生长条件和蛋白的表达，昆虫细胞要求被动的通氧。积极的通氧系统要求溶氧饱和在10%-50%*剪切力：悬浮培养产生机械剪切力。生长的昆虫细胞在含有血清的介质中（10%-20%FBS），对于细胞的剪切力一般会得到足够的保护。如果你的细胞在无血清条件下生长，加入剪切力保护剂例如 PluronicF-68。注意

13、：在 Sf900 SFM 中生长的细胞不需要加入剪切力保护剂。转染的细胞：你需要的是对数期的细胞 95%发育能力，可以完成成功的转染。产生重组的 pFastBac TM 菌株（Vector）一般信息：介绍：为了产生包含目的基因的重组质粒，使用 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统，你需要使用限制酶消化和连接，将你的目的基因克隆进入 pFastBac 菌的其中一种。一般分子生物学技术：为了帮助限制酶消化和连接 DNA 的序列，需要其他一般的分子生物学技术 扩增和保存质粒：pFastBac 菌种和他的相应的表达对照质粒包含氨苄青霉素抗性基因，可以使用 Ecoli进行 Amp 筛选。为了扩增和保存

14、 pFastBac 和 pFastBac 对照质粒，使用以下方法：1、使用载体株系感染一个 recA,endA Ecoli 株，例如 Top10，DH10B 或者 DH5 2、在含有 100ug/ml Amp 的 LB 琼脂糖平板选择转化株。3、选择含有质粒的转化子制备甘油菌以便长期保存 克隆进入 pFastBac TM1 介绍：为了帮助你设计策略克隆你的目的基因进入 pFastBac TM1，参考以下建议和表格 克隆考虑事项：pFastBac TM1 菌株是非融合菌株（无融合标签）。为了保证重组蛋白的表达，你的插入必须含有：*一个 ATG 起始密码子用于转录起始*一个终止密码子。注意：终止密

15、码子包含在所有三个阅读框中的多克隆位点中 注意：重组蛋白的产生要求你的插入包含一个转录起始 ATG。一般来说，转移载体包含完整的 PH 引导序列，可以提高表达的产量。蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变的 ATG（ATT），尽管如此，从这个位点起始的效率是低的，而且一般不干涉表达和重组蛋白的检测。pFastBac TM1 的多克隆位点：下图是 pFastBac TM1 的多克隆位点。限制位点标出来以便显示实际切刻位点。潜在的终止密码子下划线表示。pFastBac TM1 的全序列可以从下载。pFastBac TM1 的图谱和描述见后缀 状病的质粒杆粒的位点特意转座子的表达框的质粒在中扩增杆状病

16、毒表达系统主要包括捐献质粒的选择它要能够产生包含目的位点的表达结构这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制一个宿主包含杆状病毒质粒杆粒和辅 毒表达葡萄糖酸酐酶和或氯霉素乙酰转移酶表达系统的优点使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的周相比鉴别纯化重组病毒少于两周减少了从点筛选重组病毒所包含亲 达系统选择对于你的需要最合适的菌体特点参考高水平表达的强聚乙烯启动子用于简单克隆的大量克隆位点高水平表达的聚乙烯启动子末端含有可以用来纯化重组蛋白并可用蛋白酶切去提供个阅读框两个强启动子和和资料可以同时.资料.克隆进入 pFastBac TMHT A

17、，B，C 介绍：pFastBac TMHT 载体由三个读码框（A，B，C）提供的多克隆位点从而实现克隆目的基因，并且在N 端带有 6XHis。克隆：pFastBac TMHT菌株是融合菌株。为了保证表达重组蛋白，你必须：*克隆你的基因要带有 ATG，位于 4050-4052 碱基对间。这个将会产生融合表达，带有 6XHis 标签，可以用 TEV切除*你的插入要含有终止密码 注意：重组蛋白的产生要求你的插入包含一个转录起始 ATG。一般来说，转移载体包含完整的 PH 引导序列，可以提高表达的产量。蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变的 ATG（ATT），尽管如此，从这个位点起始的效率是低的，而且

18、一般不干涉表达和重组蛋白的检测 pFastBac TMHT A 的多克隆位点：下图是 pFastBac TMHT A 的多克隆位点。其实 ATG 用黑体标出。限制性位点标出来以便显示实际切刻位点。状病的质粒杆粒的位点特意转座子的表达框的质粒在中扩增杆状病毒表达系统主要包括捐献质粒的选择它要能够产生包含目的位点的表达结构这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制一个宿主包含杆状病毒质粒杆粒和辅 毒表达葡萄糖酸酐酶和或氯霉素乙酰转移酶表达系统的优点使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的周相比鉴别纯化重组病毒少于两周减少了从点筛选重组病毒所包含

19、亲 达系统选择对于你的需要最合适的菌体特点参考高水平表达的强聚乙烯启动子用于简单克隆的大量克隆位点高水平表达的聚乙烯启动子末端含有可以用来纯化重组蛋白并可用蛋白酶切去提供个阅读框两个强启动子和和资料可以同时.资料.pFastBac TMHT B的多克隆位点：下图是 pFastBac TMHT A 的多克隆位点。其实 ATG 用黑体标出。限制性位点标出来以便显示实际切刻位点。框住的核苷酸显示出的是易变区域。状病的质粒杆粒的位点特意转座子的表达框的质粒在中扩增杆状病毒表达系统主要包括捐献质粒的选择它要能够产生包含目的位点的表达结构这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制一个宿主包含杆状病毒质

20、粒杆粒和辅 毒表达葡萄糖酸酐酶和或氯霉素乙酰转移酶表达系统的优点使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的周相比鉴别纯化重组病毒少于两周减少了从点筛选重组病毒所包含亲 达系统选择对于你的需要最合适的菌体特点参考高水平表达的强聚乙烯启动子用于简单克隆的大量克隆位点高水平表达的聚乙烯启动子末端含有可以用来纯化重组蛋白并可用蛋白酶切去提供个阅读框两个强启动子和和资料可以同时.资料.pFastBac TMHT C 的多克隆位点：下图是 pFastBac TMHT A 的多克隆位点。其实 ATG 用黑体标出。限制性位点标出来以便显示实际切刻位点。框住的核苷

21、酸显示出的是易变区域。注意 pFastBac TMHT C 在 Xba 位点有一个终止密码子，他在 N 端标签框。确定你的基因的 5 端是在 Xba 位点上游开始。状病的质粒杆粒的位点特意转座子的表达框的质粒在中扩增杆状病毒表达系统主要包括捐献质粒的选择它要能够产生包含目的位点的表达结构这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制一个宿主包含杆状病毒质粒杆粒和辅 毒表达葡萄糖酸酐酶和或氯霉素乙酰转移酶表达系统的优点使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的周相比鉴别纯化重组病毒少于两周减少了从点筛选重组病毒所包含亲 达系统选择对于你的需要最合适

22、的菌体特点参考高水平表达的强聚乙烯启动子用于简单克隆的大量克隆位点高水平表达的聚乙烯启动子末端含有可以用来纯化重组蛋白并可用蛋白酶切去提供个阅读框两个强启动子和和资料可以同时.资料.克隆进入 pFastBac TMDual 介绍：pFastBac TMDual 包含两个多克隆位点，可以同时表达两个异源基因，一个通过 PH 启动子控制，另一个通过 P10 启动子控制。参见下列建议以便有助于你的基因克隆 克隆事项：pFastBac TMDual 是一个非融合载体。为了保证重组蛋白的表达，你的插入必须含有以下两点*一个 ATG 起始密码子*如果你不使用多克隆位点中的终止密码子，就必须要有一个终止密码

23、子 注意：重组蛋白的产生要求你的插入包含一个转录起始 ATG。一般来说，转移载体包含完整的 PH 引导序列，可以提高表达的产量。对于插入克隆上游的聚乙烯启动子，注意到蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变的 ATG（ATT），尽管如此，从这个位点起始的效率是低的，而且一般不干涉表达和重组蛋白的检测。PH 启动子下游的多克隆位点：下图是 pFastBac TMDual 中 PH 启动子下游的多克隆位点的图示。限制性位点标记出来显示了实际的切刻位点。潜在的终止密码子有下划线标出。状病的质粒杆粒的位点特意转座子的表达框的质粒在中扩增杆状病毒表达系统主要包括捐献质粒的选择它要能够产生包含目的位点的表达结

24、构这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制一个宿主包含杆状病毒质粒杆粒和辅 毒表达葡萄糖酸酐酶和或氯霉素乙酰转移酶表达系统的优点使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的周相比鉴别纯化重组病毒少于两周减少了从点筛选重组病毒所包含亲 达系统选择对于你的需要最合适的菌体特点参考高水平表达的强聚乙烯启动子用于简单克隆的大量克隆位点高水平表达的聚乙烯启动子末端含有可以用来纯化重组蛋白并可用蛋白酶切去提供个阅读框两个强启动子和和资料可以同时.资料.P10 启动子下游的多克隆位点：下图是 pFastBac TMDual 的 AcMNPV p10 启动子

25、下游的多克隆位点。限制性位点标记出来以便显示实际切刻位点。潜在的终止密码子标记下划线。转化和分析 介绍：如果你已经完成了你的连接反应，你就要准备把你的 pFastBac TM 结构转化进 Ecoli 了。很多 Ecoli宿主菌和转化程序都是可以使用的。一般推荐转化 Ecoli 和分析转化在下面列出 Ecoli 宿主：一旦你把你的插入序列克隆进入了 pFastBac TM，你需要转化连接反应到 Ecoli，并选择优 Amp抗性的转化株。你可以使用任何 recA，end A Ecoli 菌。包括 Top10，DH10B 或者 DH5进行转化。不要转化连接反应进入 DH10Bac 细胞。注意 TOP

26、10 和 DH10B 感受态细胞可以从 Invitrogen 得到 转化方法：你可以选择使用任何方法对 Ecoli 进行转化。化学转化是最便利的方法，而电转对大质粒是最有效的方法。选择好转化株，使用含有 100ug/ml Amp 的 LB平板。状病的质粒杆粒的位点特意转座子的表达框的质粒在中扩增杆状病毒表达系统主要包括捐献质粒的选择它要能够产生包含目的位点的表达结构这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制一个宿主包含杆状病毒质粒杆粒和辅 毒表达葡萄糖酸酐酶和或氯霉素乙酰转移酶表达系统的优点使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的周相比鉴别

27、纯化重组病毒少于两周减少了从点筛选重组病毒所包含亲 达系统选择对于你的需要最合适的菌体特点参考高水平表达的强聚乙烯启动子用于简单克隆的大量克隆位点高水平表达的聚乙烯启动子末端含有可以用来纯化重组蛋白并可用蛋白酶切去提供个阅读框两个强启动子和和资料可以同时.资料.转化株分析：一旦你得到 Amp 抗性转化株，我们有以下推荐：1、选出 10 个转化株，在含有 100ug/ml 的 Amp 的 LB 或 S.O.B 培养基过夜培养 2、使用你选的方法分离质粒 DNA。我们推荐使用公司的试剂盒 3、使用限制性方法分析质粒，证明是重组质粒并证明插入起始的正确。使用限制性酶或者酶化合物对Vector 和插入

28、端各进行一次酶切。使用 PCR 对转化株进行分析：你也可以使用 PCR 方法对阳性转化株进行分析。使用合适的 PCR 引物和Amp 条件。如果你是第一次使用此方法，你最好使用限制性分析作平行试验。使用错误的引物或污染的平板可能会得到假象。以下方法可以给你提供便利。其他方法也是可用的。需要的材料：高保真 PCRSuperMix，合时的 PCR 前后引物 过程：1、对于每个样品，在 0.5ml 的小离心管加入 48ul 的高保真 PCR SuperMix 和各 1ul 的前后引物。2、选出 10 个克隆，在上述离心管中进行重悬（记得做一个 Patch 板保护克隆以便进行更深的分析）3、94 度 1

29、0 分钟溶解细胞灭活核酸酶 4、20-30 个循环进行扩增 5、延伸使用 72 度 10 分钟。4 度储存 6、琼脂糖凝胶电泳检测 测序：对于你的结构需要进行测序证明目的基因是正确的起始以便表达。如果你是将基因克隆进入了pFastBac TMHT，证明的基因进入了 N 末端标签的读框中。长期保存：一旦你证明了测序的正确，确定克隆的纯度并制作甘油菌长期保存。推荐储存质粒 DNA 在-20度 1、在含有 100ug/ml 的 LB平板上对原始的克隆进行划线培养 2、挑单克隆在 1-2ml 含有 Amp 的 LB抚育 3、培养至稳定期 4、在 0.85ml 的培养物中混合 0.15ml 的过滤甘油，

30、转到冷冻小管 5、-80 度储存 重组质粒的产生 转化到 DH10Bac Ecoli 介绍：一旦你有了你的 pFastBac TM 结构，你就可以准备转化纯化的质粒 DNA 进入 DH10Bac TMEcoli，转变成为杆粒。你可以使用蓝/白斑选出含有重组杆粒的克隆。Bac-toBac 表达系统提供高效 DH10Bac TM感受态细胞。阳性对照：每个 pFastBac TM 质粒都提供相应的阳性对照用来作为阳性转染和表达对照（下表）。根据pFastBac TMVecctor 的使用，我们推荐在你的 DH10Bac 转染试验中作相应的对照。所需材料：开始之前你需要有以下材料*纯化的 pFastB

31、ac TM 结构（200pg/ul 储存于 PH8.0 的 TE）*阳性表达对照*高效 DH10Bac TM 感受态细胞（表达系统提供，每个转化试验使用 1 管细胞）*pUC19（与 DH10Bac 一起提供，用来做对照）状病的质粒杆粒的位点特意转座子的表达框的质粒在中扩增杆状病毒表达系统主要包括捐献质粒的选择它要能够产生包含目的位点的表达结构这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制一个宿主包含杆状病毒质粒杆粒和辅 毒表达葡萄糖酸酐酶和或氯霉素乙酰转移酶表达系统的优点使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的周相比鉴别纯化重组病毒少于两周减

32、少了从点筛选重组病毒所包含亲 达系统选择对于你的需要最合适的菌体特点参考高水平表达的强聚乙烯启动子用于简单克隆的大量克隆位点高水平表达的聚乙烯启动子末端含有可以用来纯化重组蛋白并可用蛋白酶切去提供个阅读框两个强启动子和和资料可以同时.资料.*LB平板，包含 Kan，Gen（庆大），Tetracycline（四环素），Bluo-gal（卤代吲哚基-beta-D-半乳糖苷）和 IPTG。（每个转化 3 个板，使用新鲜平板，推荐见下文）*LB板含有 100ug/mlAmp（用于 pUC19 转化对照）*S.O.C 介质*15ml 圆底塑料管*42 度水域和 37 度摇床及 37 度培养箱。你需要准备

33、 LB 琼脂糖平板，包含 50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline，100ug/ml Biuo-gal，40ug/ml IPTG，用来进行 DH10Bac TM 转化株的筛选。可以从我公司预订抗生素，Bbluo-gal，IPTG，在后面有制备平板的指导。如果你正准备的 LB 平板使用的是事先混合好的，我们推荐使用 Luria Broth Base 代替 LB。使用 LB 板将会降低颜色敏感度，并可能降低克隆的数量。注意：在蓝/白斑筛选中使用 Bluo-gal 代替 X-Gal。Bluo-gal 产生的蓝斑颜色要比 X-Gal 深。准备

34、转化：对于每个转化，你都需要一小瓶感受态细胞和三个平板。*42 度水域平衡*37 度烘板 30 分钟*室温放置 SOC 介质*对于每个转化试验预冷一个 15ml 管子 转化过程：按照以下过程用高效 DH10Bac TM 感受态细胞转化 pFastBac TM 结构。我们推荐做阳性对照的转化来帮助你证明你的结果。1、整管高效 DH10Bac TM 感受态细胞冰上解冻。2、每个转化试验，轻轻地混合，将 100ul 高效 DH10Bac TM 感受态细胞倒入预冷的 15ml 管子 3、向细胞中加入适量的质粒 DNA，轻轻混合。千万不要上下吹吸混合*pFastBac TM 结构：1ng(5ul)*pF

35、astBac TM 对照质粒：1ng*pUC19 对照：50pg（5ul）4、冰上抚育 30 分钟 5、42 度热激 45 秒 6、立即冰上 2 分钟 7、加入 900ul 室温的 SOC 培养基 8、pFastBac TM 转化：37 度 225 转震荡培养 4 小时。pUC19 转化：37 度 225 转震荡培养 1小时 9、对于每个 pFastBac TM 的转化：准备 10 折连续（不知道什么意思）用 SOC 稀释的细胞（10-1，10-2，10-3），每个稀释用 100ul 铺一个 LB 平板，平板包含 50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml te

36、tracycline，100ug/ml Biuo-gal，40ug/ml IPTG。对于 pUC19转化：用 SOC 培养基 1：100 稀释细胞，铺 100ul 稀释物在含有 100ug/mlAmp 的 LB 平板。10、37 度抚育 48 小时。分析筛选的克隆（参见推荐）。注意：我们不推荐早于 48 小时挑单克隆，因为这样可能会难于区分蓝白斑。重要的：微型 Tn7 插入到微型 attTn7 附属位点会干扰 LacZa 肽的表达，所以包含重组质粒的克隆在蓝色背景下是白色的，可能隐藏在未改变的质粒中。选择白斑分析。真正的白斑克隆比较大；因此为了避免选择成假阳性，选择最大的，最独立的白斑。避免挑

37、出现灰色的或者在中间的菌落，因为他们可能是包含空质粒的细胞核重组细胞的混合。验证显性：1、挑 10 个白色的克隆，重新划线在新鲜 LB平板（50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline，100ug/ml Biuo-gal，40ug/ml IPTG）。37 度过夜培养。2、在包含 Bluo-Gal 和 IPTG 的重新划线的平板上选出单克隆证明是白色的显性，嫁接至有50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline 的液体中 3、使用我公司的试剂盒抽提重组质粒 DNA。选择性的，你可以使用附

38、录提供的操作步骤。这个过程源于抽提大的质粒 DNA（100kb），适用于分离质粒 DNA。状病的质粒杆粒的位点特意转座子的表达框的质粒在中扩增杆状病毒表达系统主要包括捐献质粒的选择它要能够产生包含目的位点的表达结构这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制一个宿主包含杆状病毒质粒杆粒和辅 毒表达葡萄糖酸酐酶和或氯霉素乙酰转移酶表达系统的优点使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的周相比鉴别纯化重组病毒少于两周减少了从点筛选重组病毒所包含亲 达系统选择对于你的需要最合适的菌体特点参考高水平表达的强聚乙烯启动子用于简单克隆的大量克隆位点高水平表

39、达的聚乙烯启动子末端含有可以用来纯化重组蛋白并可用蛋白酶切去提供个阅读框两个强启动子和和资料可以同时.资料.4、分析重组质粒 DNA 证明成功转化到了杆粒中。我们推荐使用 PCR 分析杆粒 DNA。注意：适用琼脂糖凝胶电泳可以证明转化的成功与否，他可以分出高分子量的 DNA。这个方法要比 PCR 分析可信度低，因为高分子量 DNA 是很难见到的。使用 PCR 分析重组质粒 介绍：重组杆粒 DNA 要大于 135kb。既然限制性分析很难完成这么大的 DNA 分析，我们推荐使用 PCR分析鉴定重组杆粒中的目的基因。杆粒包含 M13 正负引物位点，位于 LacZa 互不区域的微型 attTn7 位点

40、两侧，可以完成 PCR 检验。本节提供使用 M13 引物的 PCR 检验指导。使用 M13 引物进行 PCR 分析：使用 PCR 法证明你的目的基因在重组杆粒中，你可能会：*使用 M13Forward（-40）和 M13 Reverse 引物*使用 M13Forward（-40）或 M13 Reverse 引物于你的插入片段杂交成联合物 DNA 聚合酶：你可能会使用任何 DNA 聚合酶在你的 PCR 试验中，包括 Platinum Taq 酶。如果希望 PCR产物 4kb，我们推荐使用聚合酶混合物。例如高保真的 Platinum Taq 酶 得到 PCR 产物：使用下面过程扩增重组杆粒 DNA

41、，适用 M13 正反引物和 Platinum Taq 酶。如果你使用M13F 或 M13 R 与一个你的基因特意引物混合，你需要自己决定扩增的条件。如果你使用其它的聚合酶，依照供应商提供的建议。注意：如果你的插入片段 4kb 扩增条件需要被优化.1、每个样品，在 0.5ml 微型管子中装入 50ul 的量进行 PCR 反映 重组杆粒 DNA（100ng）1ul 10XPCR Buffer 5ul 10mM dNTP Mix 5ul 50mM MgCl2 1.5ul PCR 引物（1.25ul/10uM）2.5ul 蒸馏水 38.5 总体积 50ul 2、一滴矿物油覆盖 3、一下参量进行扩增 状

42、病的质粒杆粒的位点特意转座子的表达框的质粒在中扩增杆状病毒表达系统主要包括捐献质粒的选择它要能够产生包含目的位点的表达结构这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制一个宿主包含杆状病毒质粒杆粒和辅 毒表达葡萄糖酸酐酶和或氯霉素乙酰转移酶表达系统的优点使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的周相比鉴别纯化重组病毒少于两周减少了从点筛选重组病毒所包含亲 达系统选择对于你的需要最合适的菌体特点参考高水平表达的强聚乙烯启动子用于简单克隆的大量克隆位点高水平表达的聚乙烯启动子末端含有可以用来纯化重组蛋白并可用蛋白酶切去提供个阅读框两个强启动子和和资料

43、可以同时.资料.4、从反应产物吸取 5-10ul 进行琼脂糖电泳分析 你将会看到：如果转化发生了，而且你使用的是 M13 正负引物扩增，你将会在电泳上看到下列 PCR 产物大小 如果你使用的是 M13 和你的特异引物进行的扩增，你需要决定 PCR 产物是否是希望的。12 页的图有助于你计算。重组杆状病毒的产生 转染昆虫细胞：介绍：一旦你证明了你的重组杆粒含有你的目的基因，就可以准备进行昆虫细胞的转染了，以产生重组杆状病毒。本章提供指导和建议以便完成昆虫细胞的转染 准备质粒：你可以使用任何方法准备纯化的重组杆粒 DNA。杆粒 DNA 必须没有酚和 NaCl 的污染，他们会杀死细胞，盐类会干扰脂类

44、复合物，降低转染效率。我们推荐使用本公司产品提质粒。转染方法：推荐使用一个阳离子脂质体，例如 Cellfectin 试剂进行转染。此试剂用来提供给表达系统使用。Cellfectin 试剂：不做翻译 昆虫细胞系：推荐使用 Sf9 和 Sf21 进行转染。High Five and Mimic Sf9 不推荐 因为他们转染效率低下。不过，如果你有了你的杆状病毒株，你可以进行 High Five and Mimic Sf9 表达试验。转染介质：为了高效的转染，我们推荐在无 Grace 的昆虫细胞培养基中完成转染。注意 Grace 的昆虫细胞培养基应该不含有 FBS（血糖），因为蛋白在血糖和其补充物中

45、会与 Cellfectin 试剂互作，影响转染。注意：如果你在 Sf-900 SFM 中收获了 Sf9 或 Sf21，你可以在不含有 Grace 的培养基中完成状病的质粒杆粒的位点特意转座子的表达框的质粒在中扩增杆状病毒表达系统主要包括捐献质粒的选择它要能够产生包含目的位点的表达结构这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制一个宿主包含杆状病毒质粒杆粒和辅 毒表达葡萄糖酸酐酶和或氯霉素乙酰转移酶表达系统的优点使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的周相比鉴别纯化重组病毒少于两周减少了从点筛选重组病毒所包含亲 达系统选择对于你的需要最合适的菌

46、体特点参考高水平表达的强聚乙烯启动子用于简单克隆的大量克隆位点高水平表达的聚乙烯启动子末端含有可以用来纯化重组蛋白并可用蛋白酶切去提供个阅读框两个强启动子和和资料可以同时.资料.转染，转染后可以容易的将 Sf-900 SFM 转变回去 阳性对照：如果你有了从 pFastBac 对照质粒中得到的重组杆粒，我们推荐，包括这个阳性对照在你的试验中和转化中能够评估你的结果。在这些杆粒中，包括-葡糖甘酶（Gus）和/或氯霉素乙酰转移酶（CAT）将会在 PH 或者 P10 启动子控制下表达。在转染过后，表达的 Gus 和 CAT 可以适当进行验证。所需材料：开始之前需要有下列材料：*从 pFastBac

47、TM 结构（500ng/ul TE 溶解，PH8.0）中纯化的重组杆粒 DNA*从合适的 pFastBac TM 对照结构中纯化的重组杆粒 DNA*合适培养基收获的 Sf9 或者 Sf21*Cellfectin 试剂（4 度保存）*Graces 昆虫细胞培养基，未被补充的（培养基不含有补充剂，FBS 或者抗生素）*6 孔培养板或者其它组织 培养用具*12X75mm 灭菌管*培养昆虫细胞的完全培养基 计算出你的转染试验所需的 Sf9 细胞数量，进行扩增。转染前确定细胞健康且繁殖能力 97%。转染条件：我们通常使用下列条件在 Sf9 中扩增杆状病毒株。对于你的转染试验这些条件应该作为一个起始点，你

48、可以通过改变 DNA 和 Cellfectin 试剂的浓度以及细胞密度对条件进行优化。转染步骤：适用下列步骤在 6 孔板进行 Sf9 细胞的转染。如果你想在其它细胞培养用具中转染细胞，你需要对你的条件进行优化。记得使用无补充的 Graces 培养基，他不含有 FBS 或抗生素 1、在 6 孔板或 35mm 组织培养板，与每个孔 2ml 含有抗生素的培养基中（例如：2ml 的 SF900 SFM 包含 50 单位/ml 青霉素和 50ug/ml 链霉素）接种 9X10 5Sf9 细胞。2、27 度细胞最少接触 1 小时 3、对于每个转染的样品，准备杆粒 DNA：Cellfectin 试剂混合在

49、12X75mm 的灭菌管中 1）将 1ug 纯化的杆粒 DNA 稀释进入 100ul 未补充 Grace 培养基 2）完全混匀 Cellfectin 试剂，翻转混合 5-10 次。吸出 6ulCellfectin 试剂稀释进 100ul 未补充 Grace 培养基。3）使用稀释的 Cellfectin 试剂连接稀释的杆粒 DNA（总体积约 210ul）。轻混合，室温抚育15-45 分钟。4、在 DNA/脂肪混合体抚育过程中，从细胞中除去培养基并用 2ml 未补充 Grace 培养基清洗。弃去清洗培养基。5、向每个含有混合体的管子中加入 0.8ml 未补充 Grace 培养基，清混匀，将混合体加

50、入到含有细胞的孔中。6、27 度培养 5 小时 7、弃去 DNA/脂肪混合体，向细胞中加入 2ml 全培养基（例如 SF900SFM 含有抗生素）8、27 度潮湿条件抚育 72 小时或者指导你开始能够看到病毒感染的现象。提取 P1 病毒株。分离 P1 病毒株 状病的质粒杆粒的位点特意转座子的表达框的质粒在中扩增杆状病毒表达系统主要包括捐献质粒的选择它要能够产生包含目的位点的表达结构这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制一个宿主包含杆状病毒质粒杆粒和辅 毒表达葡萄糖酸酐酶和或氯霉素乙酰转移酶表达系统的优点使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点与使用同源重组产生重组杆状病毒