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1、高级生物化学第 一 章 绪 论一、发展中的生物化学生物化学是在生物学发展的基础上融合了化学、物理学、生理学等学科的理论和方法形成的科学，是研究动物、植物、人体、微生物等生命物体的化学组成和生命过程中的化学变化的门学科，所以人们认为生物化学是生命的化学。生命是发展的。生命起源、生物进化、人类起源等等均己说明生命是发展的，因此人们对生命化学的认识也是在发展之中的，生物化学的发展可以追寻到18世纪下半叶(在约是乾隆年间)，要从拉瓦锡研究燃烧和呼吸说起。法国著名的化学家拉瓦锡(AttoineLaureut Lavoisier,1743-1794),他曾经钻研燃烧现象。并进而研究了呼吸作用。在他29岁时
2、开始燃烧的科学试验，发现磷燃烧后成为磷酸，硫燃烧后成为硫酸：磷酸和硫酸分别比磷和硫重，这表明燃烧并不是失去了“燃素”，而是跟氧结合的过程。他又利用天平和量热器，测量了豚鼠等动物在一定时间内的呼吸，定量测定了 CO?和释放的热量，从而证实动物的呼吸作用就好象物体的燃烧一样，只不过动物体的燃烧是缓慢和不发光的燃烧。他的研究成果彻底地推翻了“燃素说”，为生命过程中的氧化奠定了基础。瑞典化学家舍勒(Carl Wilhelm Scheele,1742-1786)从 14岁开始就随一位药剂师作了8 年学徒，在此期间，他废这寝忘食的学习化学，并利用业余时间进行化学实验。在 1770年他28 岁时从酒石里分离
3、出酒石酸，以后他又分析了膀胱结石获得了尿酸，分析研究了柠檬酸、苹果酸、没食子酸或称为五倍子酸，分析研究了甘油。舍勒在无机化学方面也有很多贡献，曾经拒绝了柏林大学和英国要他担任化学教授职务的邀请，-生乐于他的化学实验。这 是 18世纪的成果，是山化学家通过科学实验，发现了生物体的呼吸作用，发现了生物体的中间代谢产物。所以拉瓦锡和舍勒是两位生物化学的先驱，是生物化学的奠基人。进 入 19世纪后，在物理学、化学、生物学方面有了极大的进展，如 1804年道尔顿的原子论，1869年门捷列夫的元素周期律，1895年伦琴发现了 X一射线，1835年贝采利乌斯说明了催化作用，1859年达尔文发表了 物种起源，
4、1865年孟德尔的碗豆杂交试验和遗传定律，1848年亥姆霍兹(Helmholtz)找到了肌肉中热能来源，贝 尔 纳(Bernard)发现了肝脏生糖功能等等。如此多的发现和进展极大的促进了生物化学的发展，而且也是现代生物化学发展的前提。此外，生产的发展，工业的发达和社会的进步也极大地推动了生物化学的发展。德国化学家李比希(Liebig)是农业化学的奠基人，也是生理化学和碳水化合物化学的创始人之一，他 于 1826年在德国吉森(Giessen)大学建立了李比希实验室，并首创了在大学进行化学实验的教学。1842年撰写的 有机化学在生理学和病理学上的应用专著，首次提出了“新陈代谢”这个学术名词。他研究
5、了许多有机化合物，并对脂肪、血液、胆汁和肌肉提取物进行了研究。他有很多杰出的学生,有位叫施洛斯比尔格尔(Julins Schlossberger),是第一位担任生,理化学教授职务的人，他 于 1840 1859年间在德国蒂宾根(Tubingen)大学教授有机化学和生理化学。施洛斯比尔格尔逝世后，蒂宾根大学生理化学的盛名延续了一个世纪。历任的生理化学教授都是当时第一流的生理化学专家，具有医学和有机化学的基础，如霍佩 一 赛 勒(Hopp e Seyler)、Gustav、Han Thierfelder(研 究 脂 肪 氧 化)和F ranz-Knoop(研究脂肪氧化，尿中排出马尿酸)等。霍佩赛
6、勒(1825 1859)是德国医生，因将生理化学(即生物化学)建立成一门独立的科学而著名。1877年他首次提出了“生物化学”这个名词，创办和编辑了第一种 生理化学杂志，出版了 生理化学及病理化学分析手册，首次获得了纯的卵磷脂，并曾获得晶体状的血红素。首 创“蛋白质”一词，又研究过代谢、叶绿素及血液。他研究病理液体和脓细胞，从而导致他的一位学生F riedrich Miescher(1844 1895)从脓细胞核中分离出了脱氧核糖核蛋白，另 一 位 学 生 AlbrechtKossel(1853 1927)因对蛋白质、细胞及细胞核化学的研究而获得1910年诺贝尔生理学或医学奖。霍佩一赛勒建立了著
7、名的斯特拉斯堡研究所，并在此担任过生理化学教授，在科学研究和培养学生方面都做出了巨大的贡献。总 之，自1840 1900年间，德国的生理化学跟其他领域的科学一样，处于开拓和领先地位。并对美国的生理化学的发展起了非常重要的推动作用。例如，池廷登(Russel HenryChittendlen)是美国留德学生，回到美国纽黑文的耶鲁大学教授生理化学，是全美第一位任生理化学教授职务的留德归美学生。他在生理化学方面任教达30年，居美国生理化学的领导地位。他与他的德国老师寇南(Willy K uhne)合作对胃液和肠液消化过程的产物进行了化学研究，发现了不少新东西。也进行了蛋白质的分解试验。再如，艾 贝
8、尔(John Jacob Abel,18571938)曾在德国留学7 年，获斯特拉斯堡大学医学博士，返美后在密西根大学和约翰斯霍普金斯大学任教，他分离了肾上腺素。1962年制成了胰岛素晶体。1932年领导内分泌研究室。总的说来，美国生理化学初始阶段受德国的影响较深。2 0 世纪后，生物化学有了很大的发展。德国、美国、英国、法国都有了生物化学的学术中心。就生物化学来说，2 0 世纪前半叶，在蛋白质、酶、维生素和物质代谢及生物氧化方面都有了很大的发展。霍普金斯(S ir F rederick Gow land Hopkins,1861 1947)是英国剑桥大学生物化学教授，因发现维生素而与荷兰的艾
9、克曼(C.Ei jkman,18581930)共获1929年的诺贝尔生理学或医学奖。霍普金斯创建了剑桥大学普通生物化学学派和中心，从事教学和研究的人员都是生物化学方面的精英，为生物化学的发展做出了较大的贡献。2 0 世纪初直至二战前夕，德国在生物化学方面仍占领先地位，如埃米尔费歇 尔(Emil F ischer,1852 1919),普鲁士化学家，研究糖和嗓吟类物质，获 1902年诺贝尔化学奖。汉 斯 费 歇 尔(Hans F ischer,1881 1945),德国生物化学家，因对血红素和叶绿素的研究而获诺言贝尔化学奖。迈 尔 霍 夫(Otto Meyerhof,1 8 8 4-1 9 5
10、1),德国生物化学家，因研究肌肉代谢的糖原一乳酸循环与英国的A.V.H ill共 获 1922年 的 诺 贝 尔 生 理 学 或 医 学 奖。威 尔 施 泰 特(RichardW i l l s t a t t e r,1 8 7 2 1 9 4 2),德国化学家，研究叶绿素及其植物色素结构而获得1 9 1 5 年诺贝尔化学奖。温 道 斯(A d o l f W in d a u s,18 7 6 19 5 9),德国有机化学家，因研究维生素等有重要生物学作用的物质而获得19 2 8 年的诺贝尔化学奖。瓦尔堡(O t t o W a r b u r g,18 8 3 19 7 0),德国生物化
11、学家，因对细胞呼吸的研究而获19 3 1年诺贝尔生理学或医学奖。在留德学生的推动下，20世纪前半叶，美国的生物化学方面也的很大发展。如耶鲁大学池廷登的后继者门德尔(L a fa yet t e B en ed ic t M en d el,18 7 2 19 3 5),美国生物化学家，发现了维生素和蛋白质的营养价值，建立了现代营养学概念。2 0-3 0 年代营养和维生素的研究在美国比较突出。再如哈佛医学院的福林(O t t oF o l in),于 19 0 9 年任生物化学教授，19 15 时福林教授将哈佛大学生物化学系办成了有影响的学术中心，重点放在分析方法和临床应用研究上。福林建立了尿中
12、肌酸和肌酸酊的测定方法，氨基酸测定方法，尿氮测定方法。福林和吴宪(我国生物化学 家)于 19 19 19 2 2 年设计了血液分析的颜色测定方法。大约从2 0 世纪中叶起，生物化学得到了突飞猛进地发展，并且生物化学的领域也向深度和广度发展，其原因是：物理学家、化学家以及遗传学家等参加到生命化学的领域中来了。研究人员迁居和交往频繁。研究方法有了突破和改进。信息交流量增大。从研究方法的改进上来说，相继出现了色谱技术、电泳技术、超速离心技术、荧光分析技术、同位素示踪技术以及电子显微镜的应用等。可以说生物化学的分离、纯化和鉴定的方法向微量、快速、精确、简便和自动化的方向发展。从不同学科专家的参与上来看
13、，英国物理学家肯德鲁(Jo h n C o w d e ry Ke n d re w)测定了肌红蛋白的结构。英国物理学家佩鲁茨(M a x F e rd i n a n d P e ru t z)用 X-射线衍射技术分析了血红蛋白的结构，二人共获1 9 6 2 年的诺贝尔化学家。美国化学家 鲍 林(Li n u s P a u l i n g)因确定了氢键在蛋白质结构中及大分子间相互作用的重要性，并认为某些蛋白质具有类似螺旋的结构，研究了镰刀型贫血病，提出了“分子病”的名称，获得了诺贝尔化学奖和和平奖。桑 格(F re d e ri c k S a n g e r)英国生物化学家，经 过 1
14、0 年的研究，于 1 9 5 5 年确定了牛胰岛素的结构，获得了 1 9 5 8 年的诺贝尔化学奖。1 9 8 0 年他又设计出了 种测 定 D N A 核甘酸排列顺序的方法，而与吉尔伯特(W a l t e r G i l b e rt),伯 格(P a l l B e rg)共 获 1 9 8 0 诺贝尔化学奖。麦克林托克(B a rb a ra M e C l i n t o c k)美国遗传学家，从事玉蜀黍遗传研究4 0 年，发现了可移动的遗传成分，因而获得了 1 9 8 3 年的诺贝尔生理学或医学奖。生物化学领域中，在 2 0 世纪获得诺贝尔奖的成果还有：克雷布斯(S i r H a
15、 n sA d o l f Kre b s,英籍德裔生物化学家，犹太人，1 9 3 3 年被迫迁居英国)1 9 3 7 年发现三竣酸循环。李 普 曼(F ri t z A l b e rt Li p m a n n,美籍德裔生物化学家)1 9 4 7 年成功的分离出了 C o A,1 9 5 3 年确定了其分子结构。克雷布斯和李普曼二人共获1 9 5 8年诺贝尔生理学或医学奖。奥乔亚(S e v e r。O c h o a,美籍西班牙生物化学家)发现细菌内的多核甘酸磷酸化酶，并合成了核糖核酸。科恩伯格(A rt h u r Ko rb e rg,美国医师、生物化学家)发现D N A 在细胞内及
16、试管内的复制方式。奥乔亚和科恩伯格二人共获1959年诺贝尔生理学或医学奖。威尔金斯（Maurice Wilkins,新西兰出生的英国物理学家）完成了对DNA的 X 射线衍射分析，沃森（James Dewey Watson）和克里克（Francis Harry Compton Crick）提出了 DNA的双螺旋结构，三人共获1962年的诺贝尔生理学或医学奖。尼伦伯格（Marshall Warren Nirenberg,美国生物化学家）破译遗传密码，霍 利（Robert William Holly）阐明酵母丙氨酸tRNA的核甘酸的排列顺序，并证明所有tRNA的结构类似，科拉纳（Har Gobind
17、 Khorana,美籍印度裔生物化学家）首次人工复制出酵母基因，三人共获1969年诺贝尔生理学或医学奖。莫诺（Jacques Momod,法国生物化学家、遗传学家）和雅各布（FrancoisJacob,法国生物学家）发现了操纵子而获得1965年诺贝尔生理学或医学奖，等等。我国生物化学的主要先驱是吴宪，他曾留学美国哈佛大学，回国后于1924 1942年担任私立北京协和医学院生物化学教授，兼生物化学系主任教授。我国在生物化学研究中最突出的成就是1965年人工合成了牛胰岛素，1983年人工合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸。此外我国在酶的作用机理、血红蛋白变异、生物膜结构与功能等方面都做出了国际水平的研究
18、成果。生物化学在蛋白质、核酸、酶及代谢等方面已有理论方面的成就，理论成果必将导致应用，所以生物化学的发展推动了生物技术的进步，从 80年代开始，生物工程和生物高技术得到了迅速发展。生物工程有遗传工程或基因工程，蛋白质合成的分子生物学，或称蛋白质工程、醐工程，还有组织培养、细胞培养，以及其他体外技术，以求生产出对人类有用的产物。有工业微生物学，利用合适原料经过发酵,生产酣类或人类食品和动物饲料。生物工程的远景包括应用于人类健康、动物疾病治疗与预防、污水和废物处理、以及生物电子学等等。由于生物工程对人类社会目前效益的广阔的前景，世界各国，特别是欧洲、澳洲、日本等国家比较重视，发展较快。我国也已重视
19、生物工程的理论研究和应用研究，特别重视生产方面的开发研究。生物化学虽然有近二百年的历史，但是还在发展之中。目前看得到的一些未知领域正受到日益的重视，例如：地球上的生命是怎样起源的？地球以外的天体上有没有生命？遗传物质是怎样进化的？一个受精卵中的遗传物质怎样发生成个体？怎能样发生为各种器官和组织的？细胞器的进化途经还有争论，癌的问题、病毒问题、人体自身免疫问题、大脑的记忆、推理的分子生物学、生物行为有什么规律，其分子的基础又是什么？还有环境生态等问题。总之，生物化学是在发展之中。生物化学方面的主要期刊中文:中国科学生物化学与生物物理学进展生命的化学微生物学报实验生物学报日文：科学生化学英文：Na
20、ture(London)Analytical Biochemistry(New York)科学通报生物化学与生物物理学学报生物化学与分子生物学学报遗传学报生物科学动态自然蛋白质、核酸、酵素Science(Washington)Bidchemical Journal(London)Archives of Biochemistry and Biophysics(New York)Biochemical and Biophysical Research Communications(New york)Biochimica et Biophysica Acta(Amsterdam)Biochemist
21、ry(USA)BioorganicChemistry(London)Biopolymers(New York)Biotechnology and Bioengineering(New York)Canadian Journal of Biochemistry(Canada)Cancer Research(USA)Chromosoms(Berlin)Comparative Biochemistry and Physiology(Oxford)Current Advances in Genetics and Molecular Biology(U.K.)European Journal of Bi
22、ochemistry(Heidelberg)Enzyme(Basel)F ederation Proceedings(New York)General Cytochemical Methods(New York)Immunology(Oxford)Experimental Cell Research(New York)Indian Journal of Biochemistry(Indian)International Journal of Biochemistry(Oxford)International Journal of Peptide and Protein Research(Cop
23、enhagen)Journal of the Americal Society(Washington)Journal of Bacteriology(USA)Journal of Biological Chemistry(USA)Journal of Chromatography(USA)Journal of Experimental Biology(London)Journal of General Microbiology(london)Journal of General Virology(London)Journal of Histochemistry and Cytochemistr
24、yJournal of Biochemistry(Tokyo)Journal of Cell Biology(New York)Journal of Electron Microscopy(Tokyo)(USA)Journal of Immunology(USA)Journal of Lipid Research(New York)Journal of Molecular Biology(London)Journal of Neurochemistry(London)Journal of Theoretical Biology(London)Journal of the Chemistry S
25、ociety I.Organic and Bioorganic Chemistry(London)Journal of Virology(Washington)Metabolism,Clinical and Experimental(USA)Molecular and Cellular Biochemistry(Hague)Molecular and Cellular Genetics(Berlin)Molecular Pharmacology(New York)Methods of Biochemical Analysis(New York)Nucleic Acids Research(US
26、A)Plant Physiology(USA)Peptides(USA)Preparative BiOchemistry(USA)Proceeding of the National Academy of Sciences(Washington)Proceedings of the Royal Society of London,Series B(London)Protoplasma(Vienna)Steroids(San F radsisco)TBS(USA)Virology(NewYork)德文:Die Naturwissenschaften(Berlin)Zeritschrift fur
27、 NaturforschungBiochemischeZerischrift(Berlin)法文：Comptes Rendus Hebdomadaires des Seances deLAcademie des Sciences(Paris)第二章蛋白质生物化学蛋白质生物化学研究的是蛋白质的结构、性质、和功能及结构与功能的关系。生物体最重要的组成物质是蛋白质和核酸。核酸是遗传大分子，负责遗传信息的储存与传递。蛋白质是功能大分子，是生物体的结构、性质与功能的具体体现者。例如：遗传信息的复制、传递和表达要依靠各种蛋白质才能完成；细胞的骨架是由许多种蛋白质构成的三维网状结构，而细胞的各种生命活动都是
28、在细胞骨架上进行的；生命的运动依赖于各种运动蛋白；氧的运输要靠血红蛋白来完成：动物体对疾病的抵抗力是由免疫球蛋白执行的；细胞能够认识“自己”与“非己”，是靠糖蛋白的特殊功能；机体的代谢活动要依赖各种酶和激素来完成，酶是蛋白质，激素中有相当一部分是肽类。可见蛋白质在生命活动中无所不在，无时无刻不在发挥着重要功能。近年来发现的羊的瘙痒病(Scr叩ie)的病因是一种最简单的具有感染性的蛋白因子(P rion)引起的，它是比类病毒还小的微生物，未检查出其含有核酸物质，而只是一种蛋白质颗粒。这是值得人们思考的问题。要研究蛋白质的功能，首先必须深入了解它们的结构，特别是空间结构(三维结构)，因为结构决定功
29、能，生命物质的功能和它的结构二者是统一的，有什么样的结构必有什么样的功能，反之亦然。例如，酶蛋白的催化功能只有在彻底弄清酶的活性中心与底物如何结合，并如何反应，才真正了解那种酶的作用机理。再如，在彻底弄清楚血红蛋白的分子构象及与氧分子结合后的构象的变化之后，才能完整地阐述动物机体中氧和二氧化碳的运载过程。因此，我们本章中首先介绍蛋白质结构原理的最新进展，然后再介绍几类蛋白质的结构与功能的关系及其它的有关问题。蛋白质的结构很早就受到科学家的关注，但 在 50年代以前一直未能得到满意的结果。直 到 1952年丹麦生物化学家林德斯洛姆兰(Linderstromlan g)第一次提出蛋白质结构的三级结
30、构的概念，才使蛋白质结构的研究走上了正确的道路。Linderstrom-lang的三级结构概念是：级结构是指多肽链中氨基酸的顺序，而不涉及其空间排列状态；二级结构是指多肽链骨架(主链)的局部空间结构，不涉及侧链构象，也不考虑与其它肽链片段之间的关系及整个肽链的空间排列状况；三级结构是指整个肽链的折迭情况，或者说是指肽链中全部原子在空间的排列状态。这一概念一提出来，立即得到了科学家的认同。1958年，英国晶体学家在研究蛋白质晶体时发现，有些蛋白质是山几条相同或不同的肽链组成，每条肽链都有完整的三级结构，称之为亚基，几个亚基排列成空间几何状态，并靠|非共价键|结合在一起。他将这种结构称为四级结构。
31、现在蛋白质的一、二、三、四级结构的概念已由国际生化协会(IUB)的生化命名委员会采纳并作出正式定义。到目前为止已有2000多种蛋白质的一级结构被搞清楚。据 1990年 4 月的统计，有 488种蛋白质的三级结构利用X射线衍射技术在不同分辨率水平上得到了阐明。蛋白质三维结构的研究资料大大丰富了人们对蛋白质空间结构规律的认识，同时，蛋白质四级结构水平的概念也已不能满足人们的要求。因此，近年来蛋白质化学家又在四级结构水平的基础上增加了两种新的结构水平，即超二级结构和结构域。超二级结构是1 9 7 3 年罗 斯 曼（Ro s s m a n）提出的，是指蛋白质结构中存在的各种二级结构组合物，是构成三级
32、结构的构件。结构域的概念是由免疫化学家波特（Po r t e r）提出的，是指蛋白质分子中那些明显分开的球状部分。例如，动物的免疫球蛋白（IgG）含 有 1 2个结构域。现证明许多蛋白质含有明显的结构域。这两种新的蛋白质结构概念目前已被生物化学家及分子生物学家所公认。所以，我们所提到的蛋白质结构应包括六级水平的结构。即：级结构f二级结构f超二级结构f结构域f三级结构f四级结构蛋白质三维结构的深入研究，不仅从分子水平上深入揭示了生命的奥秘，而且可用于生产实践。例如，8 0 年代兴起的蛋白质工程技术，就是利用现代生物技术改造蛋白质的分子结构，提高其生物活性，使其更加符合人类的需要。所以，将蛋白质生
33、物化学的理论知识应用于生产实践，必将对人类做出更大的贡献。第一节蛋白质的一级结构一、蛋白质一级结构的内容蛋白质是不分枝的生物大分子，由 2 0 种氨基酸组成（从各种生物体中发现的氨基酸有1 8 0 种，参与蛋白质组成的基本氨基酸有2 0 种，称为蛋白氨基酸，其它的称为非蛋白氨基酸），氨基酸在多肽链中有一定的排列顺序，蛋白质的一级结构就是指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。蛋白质一级结构也称为蛋白质的共价结构。当然，蛋白质一级结构中还应包括二硫键的定位。蛋白质一级结构包括以下几个内容：1 .蛋白质分子中多肽链的数目；2 .每一条多肽链末端氨基酸的种类；3 .每一条多肽链中氨基酸的种类、数目和排列顺序
34、；4 .链内二硫键的位置和数目；5 .链间二硫键的位置和数目。研究蛋白质级结构就是要研究这些内容。蛋白质一级结构的表示方法一般是从左到右表示多肽链从氨基端到竣基端。氨基酸的种类和排列顺序通常用三字母表示，即氨基酸英文名称的前三个字母。但为了更加方便，国际生化委员会推荐了 一套单字母表示法。二、蛋白质一级结构的测定1 9 5 5 年，英国生物化学家桑格（S a n ger）首先完成了胰岛素一级结构的分析,为蛋白质一级结构的研究开辟了道路。但这项工作花费了他整整十年的时间。随后，唉 德 曼（E d m a n）液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪以及气相色谱一质谱（G C-M S）等方法相继出现，使
35、蛋白质一级结构的分析速度大大加快。现在分析一个分子量在1 0万左右的蛋白质只需要几天的时间就可完成。蛋白质一级结构分析的综述和专著文献很多，在此我们只作简要的概述。蛋白质级结构分析的基本步骤如下；1.蛋白质样品的纯化；2.测定N 末端和C 末端氨基酸；3.至少以两种方式裂解肽链成肽段；4.肽段的分离纯化；5.肽段的顺序分析；6.肽段重迭重组以确定肽链的全部氨基酸顺序;7 .二硫键的定位。（一）、蛋白质的纯化（均一）在测定蛋白质的一级结构之前，首先必须保证被测蛋白质样品的纯度，只有均一的蛋白质样品，才能保证顺序测定结果准确可靠；其次要了解它的分子量和亚基数。如果某些蛋白质分子是由两个以上的肽链组
36、成的，第一步必须将多肽链分开。蛋白质多肽链之间有非共价键和共价键（二硫键）作用力。如果只有非共价键，可用服或盐酸 II等变性剂将其分开。如果肽链之间有二硫键，则需要用拆开二硫键的方法进行处理。拆开二硫键的化学方法主要有以下两种：1.过甲酸氧化法用过甲酸（过氧化氢+甲酸）可使蛋白质分子中的二硫键断裂。反应一般在0下进行2 小时左右，就能使二硫键中的两个硫全部转变为磺酸基。这样被氧化的半胱氨酸称为磺基丙氨酸。反应如下：C H 2 S S C H 2N H C H C O N H C H C O HCOOOIK 0、2hCHLS O 3 H2 N H C H C O 如果蛋白质分子中同时存在半胱氨酸
37、，那么也会被氧化成磺基丙氨酸。此外，甲硫氨酸和色氨酸也可被氧化，从而增加了分析的复杂性。2.疏基乙醇原法利用筑基乙醇亦可使蛋白质中二硫键断裂。高浓度的筑基乙醇在pH89、室温下作用数小时后，可二硫键定量的还原为一SH。在此反应系统中还需加入8M版或6M 盐酸胭使蛋白质变性，多肽链松散成为无规则的构象，从而有利于筑基乙醉作用于二硫键。此反应是可逆的，因此要使反应完全，毓基乙醇的浓度必需保持在 01一0.5M。反应如下：C H2-S-C H2/SH啰8-9、室温、数 小 时.？平 一S HN H C H C O-N H C H C O C H2O H 8 M 版或 6 M 盐酸呱 N H C H
38、C O C 1 I2&SM 2 O H H 0&被还原生成的一SH不稳定，极易被重新氧化生成一SS,故需要稳定。稳定一SH的方法通常是用碘乙酸（ICH2co0 一）使一SH竣甲基化（一SHCH2co0）或者用氟乙烯(CH2=CHC N)使一SH氟乙基化(SHCH2CH2CN)蛋白质多肽链被拆开后，要将它们分离纯化。常用的分离纯化方法通常有凝胶过滤法、离子交换层析法、电泳法等。分离纯化后的每条肽链再进行末端分析。(二)、末端分析分析肽链末端氨基酸的方法很多，常用的有以下儿种。1.N末端氨基酸分析二硝基氟苯法(DNP或 F DNB或 DNF B)此方法是1945年由Sanger提出的，其反应过程如
39、下：6MHC1O2NDNP氨基酸RHNCHCOOH+H2NCHCOOH氨基酸混合物DNP氨基酸可用有机溶剂抽提后，通过层析法来鉴定它是何种氨基酸。Sanger用此法成功地测定出胰岛素的N末端氨基酸分别为甘氨酸和苯丙氨酸。二甲基氨基蔡磺酰氯法(NDSC1)此方法是1956年由哈特利(Hartley)等人提出的。二甲基氨基蔡磺酰氯又称丹磺酰氯，简 称 DNS-C1。其反应过程如丹磺酰氯丹磺酰一肽CH3 N CH36MHe1.p|y +氨基酸混合物R,S02 HN CH COOH丹磺酰一氨基酸丹磺酰一氨基酸具有强烈的黄色荧光，可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析法进行鉴定。此法的优点是灵敏度高（比D N P
40、法 高 1 0 0 倍），且丹磺酰一氨基酸的稳定性好。2.C末端氨基酸分析脱解法 这是分析C-末端氨基酸的最常用方法。将多肽溶于无水肿中，1 0 0 下进行反应，可 使 C 末端氨基酸以游离状态释放出来，而其它氨基酸都与股反应生成氨基酰肿化合物，此类化合物可与苯甲醛作用变成水不溶性的二苯基衍生物而沉淀。游离的C 末端氨基酸可采用D N S C 1 或 D N P 等方法进行鉴定。竣肽酶水解法竣肽酶可以专一地水解竣基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可分为竣肽酶A、B、C和 Y （A和 B来自胰脏，C来自柑桔叶，Y来自面包酵母）。应用竣肽酶水解C-末端氨基酸时，首先要进行动力学实验，以便选择合适
41、的酶浓度和反应时间，以保证释放出的氨基酸主要是J 末端氨基酸。（三）、氨基酸组成分析在进一步分析多肽链的氨基酸顺序之前，首先要了解它是山哪些氨基酸组成的，每种氨基酸有多少。分析组成的方法有层析法和离子交换层析法两种。层析法是将多肽链用酸完全水解成游离氨基酸，然后进行D N S （D a n sy l）标记，聚酰胺薄膜层析。这是一种超微量的分析方法，但用于定量分析尚不够准确。离子交换层析是种精确的氨基酸组分分析的定量方法，它是将多肽链完全水解后，通过离子交换法使各种氨基酸相互分开，再分别进行定量测定。氨基酸自动分析仪就是在此基础上发展起来的。（四）、多肽链的降解多肽链的氨基酸组成往往是比较复杂的
42、，因此直接分析多肽链的氨基酸顺序还是很困难的，多采用将多肽链进步降解成肽链片段，先分析各片段的氨基酸顺序,再重迭重组确定肽链的全部氨基酸排列顺序。肽链的裂解是蛋白质一级结构研究中的重要问题，它要求裂解点少，选择性强，反应产率高。目前主要有化学法和酶解法两种方法。多肽链的降解至少要用两种对肽链有不同裂解点的方法，降解生成两套以上不同的肽段。否则，将给下一步的重迭重组造成极大的困难。1.化学法最常用的化学法是澳化氢法，此法能选择性地断裂甲硫氨酸的竣基端肽键。浪化氢化学降解法的优点是：一般蛋白质中含甲硫氨酸较少，因此裂解点少，可获得较大的肽链片段；产率在8 0%以上；作用条件温和，在室温下作用几到十
43、几个小时即可。近年来有一种羟胺法开始受到人们的重视。羟胺能专一地裂解天冬酰胺和甘氨酸 之 间 的 肽 键（A sn-G ly）o在酸性条件下裂解天冬酰胺和脯氨酸之间的肽键（A sn P ro）现已有人将这种方法用在某些蛋白质一级结构的分析上。2.酶解法酶解法比化学法有更多的优越性，使用也更广泛。因其具有较高的专一性，而且水解产率较高，所以可选择各种不同专一性的酶进行专一地裂解。常用的酶及其专一，性如下：氨基酸顺序分析常用蛋白酶及其专一性酶 名 称水解的肽键胰蛋白酶L y s（赖氨酸）、A rg （精氨酸）痰基端肽键胰凝乳蛋白酶T rp （色氨酸）、T y r（酪氨酸）、P he （苯丙氨酸）般
44、基端肽键弹性蛋白酶L e u （亮氨酸）、H e （异亮氨酸）、A la （丙氨酸）及基端肽键胃蛋白酶T y r（酪氨酸）、T rp （色氨酸）、P he （苯丙氨酸）氨基端肽键木瓜蛋白酶A rg （精氨酸）、L y s（赖氨酸）、G ly （甘氨酸）、L e u （亮氨酸）等覆基端肽键嗜热菌蛋白酶P he （苯丙氨酸）、L e u （亮氨酸）、H e （异亮氨酸）、T y r（酪氨酸）、T rp （色氨酸）、M e t （甲硫氨酸）、V a i（缀氨酸）的氨基端肽键枯草杆菌蛋白酶疏水侧链氨基酸残基之间的肽键在酶法裂解肽链时，可适当的选取用一些化学药品来修饰某些氨基酸，以控制酶的专一性，使所得
45、的肽链片段更大一些.例如，用顺丁烯二酸酊或甲基顺丁烯二酸酎修饰赖氨酸，则胰蛋白酶仅使精氨酸的竣基端肽键断裂，若 用 1,2 或 1,3 二皴基化合物修饰精氨酸，则胰蛋白酶仅能裂解赖氨酸峻基端肽键。当然，修饰后的氨基酸还可以解封闭，解封闭后，酶仍能选择性的作用于这些氨基酸的肽键。目前倾向于采用这种裂解方式。（五）、肽段的分离肽段的分离方法主要是凝胶过滤法，但单靠凝胶过滤法分离的肽段一般纯度不够，常需辅以离子交换层析法进行纯化。将裂解后的肽段分离纯化后就逐地进行分析。（六）、肽段的顺序分析肽段的氨基酸顺序分析有化学法和酶解法两种。1.化学法一E d m a n 降解法这是目前用于顺序分析最主要的方
46、法。它的原理是从N 端开始，逐步降解，降解一个，分析一个。先将肽段与|异硫/酸苯酯（P T H 试剂）|在 p H 8-9 的条件下作用，肽辞的游篦|-N H z 末端|连接到异硫氟酸苯酯的2原子|上,生 成 苯异硫甲氨酰肽，简称b r c 肽I。在 强 酸（三氟乙酸）作用下，可使靠近P T C 基的|氨基酸环花肽键断裂形成苯氨基嚷哇咻酮衍生物（A P ZO和一个失去末端氨基酸的肽链，此肽链不被破坏，因而又出现 个新的N 末端氨基酸。重复上述步骤，继续与P T H 试剂作用，继续分析。苯氨基嚷哇咻酮衍生物用有机溶剂抽提出来进行鉴定。但此衍生物很不稳定，在水中可转变为稳定的乙内酰苯硫胭氨基酸（P
47、 T H 氨基酸），此化合物比较稳定，便于分析鉴定。反应过程如下：N=C=S +异硫氯酸苯酯（PTH）R.H C ON H H C O肽R2肽段p H 8 9S|偶联反应|R iR2N H(!HC OC H C O肽苯异硫甲氨酰肽（PTC肽）I环化断裂I CF.COOH（无水）噫喳咻酮苯胺（ATZ）肽 段（少一个氨基酸）ATZ苯乙内酰硫腺氨基酸（PTH氨基酸）这些步骤通常称为E d m a n 逐步降解法。E d m a n 逐步降解法的优点是样品用量少,灵敏度高。P T H 氨基酸可用各种层析法进行鉴定，如纸层析、薄层层析等。虽然此方法具有很多优点，但由于操作繁琐，工作量大，所以，有人根据E
48、 d m a n 降解法的原理作了一系列的改进。例如，1 9 6 7 年形成的液相顺序自动分析仪和1 9 7 0 年形成的固相顺序分析仪都是在E d m a n 降解法的基础上进一步改进而成的。再如，1 9 7 6年有人将E d m a n 降解法的异硫氟酸苯酯试剂改为甲氨偶氮苯一异硫氟酸盐（简称D A B I T C）,这是一种有色试剂，产 物 D A B T H 氨基酸呈桔黄色，因此鉴定时不需要染色，用肉眼即可分辩。此方法灵敏度高，是目前一种很可取的方法。2.酶解法蛋白水解酶中有一类是肽链外切酶或称外肽酶，例如氨肽酶和竣肽酣，它们分别从肽链的N端和C 端逐个地向里切。因此，原则上只要能跟随
49、酶水解的过程分别定量测出释放的氨基酸，便能确定肽的顺序。但这种方法实际上有许多困难，局限性很大，它只能用来测定末端附近很少几个残基的顺序。另外，质谱法和气谱一质谱（G CM S）联用法也已用于肽链的氨基酸顺序分析。这是一种不同于E d m a n 降解法和酶解法的物理化学方法，具有一定的发展前途，但目前应用还不十分普遍，其原理我们不再介绍。（七）、肽段的重迭重组一但获得用两种不同方法断裂的肽段的全部氨基酸顺序后，就可用重迭重组的方法确定出整条肽链的氨基酸排列顺序。肽段的重迭重组方法我们可通过卜面的例子来说明。实际工作中所得到的肽段远比下面的例子中的肽段大的多，但原理是一样的。例如，有一个肽链，
50、通过末端分析已知I N 一末端为丙氨酸，C一末端为缀氨酸,通过氨基酸组成分析已知其为十肽，假如先以糜蛋白酶水解，得一套肽段（A）；再以胰蛋白酶水解，则得到另一套肽段（B）。肽段的顺序分析结果如下：A：丙一苯丙+甘一赖一天冬酰胺一酪+精 一 色+组一缴B：丙苯丙甘赖+天冬酰胺酪精+色组缀推理如下：丙一苯丙丙一苯丙一甘赖A1B 1A2B2A3B3A4甘一赖一天冬酰胺一酪天冬酰胺一酪一精精一色色组缀组一缀此卜肽氨基酸顺序为：丙一苯丙一甘一赖一天冬酰胺一酪一精一色一组一缴（八）、二硫键的定位蛋白质分子不经任何处理，直接用酶水解，检出其中含二硫键的肽段，然后将二硫键拆开，分别测定两个肽段的顺序，将这两个