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1、实验一 3,5-二硝基水扬酸比色法测定还原糖和总糖一、目的掌握3,5-二硝基水杨酸比色定糖法的原理和方法，并用此法测定山芋粉中的总糖和还原糖。二、原理糖的测定方法有物理的和化学的两类。物理方法是通过其折光率、比旋度的变化来进行测定，也可利用比重计进行测定。比较精确和常用的方法是化学测定法。还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖就是指含有自由醛基或酮基的糖类。单糖都是还原性糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖。利用单糖、双糖与多糖的溶解度不同可把它们分开，并且可用酸水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成具有还原性的单糖，再进行测定，这样就可以分别求知样品中总糖和还原糖的量
2、。本实验是利用3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物。在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色强度成正比。因此，利用分光光度计进行比色测定，即可求得样品的含糖量。此法是半微量定糖法，操作简便、快速，杂质干扰少。三、实验步骤1.葡萄糖标准曲线的制作取6支比色管，分别按下表顺序加入各种试剂：将各管混匀后，在540 nm波长下，用0号管调零，分别读取各管的光密度值;号项目空白12345含糖总量（mg）00.20.40.6().81.()葡萄糖标准液（ml）00.20.40.60.81.0蒸储水（ml）2.01.81.61.41.21.0DNS 试 剂(m l)1.51.51.51.
3、51.51.5混匀后在沸水浴中加热5分钟，立即用流动水冷却。加蒸储水稀释至25毫升刻度线。以光密度值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标绘制标准曲线。2.样品中还原糖和总糖含量的测定（1）样品中还原糖的提取：准 确 称 取1克山芋粉，放入大试管中。先以少量水调成糊状，然后加3 0毫升蒸储水，搅匀，在5 0 恒温水浴中保温2 0分钟，使还原糖浸出。抽滤或离心，用少量蒸储水洗涤残渣。将滤液收集在1 0 0毫升的容量瓶中，用蒸储水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。（2）样品中总糖的水解和提取：准确称取0.2克山芋粉，放入大试管中。用移液管加入5毫 升6 m o i/L H C 1,8毫升蒸储水，摇匀后在
4、沸水浴中加热3 0分钟，用流动水冷却后，用6 m o i/L Na O H中和至中性，抽滤或离心，滤液用蒸储水定容到1 00毫升容量瓶中，此为总糖待测液。使用时把它稀释一倍再按量进行。（3）样品中含糖量的测定：取5支比色管，编号，按下表加入各种试剂：将上述各管混匀，其余操作均与制作葡萄糖标准曲线时相同，测定各管光密度值。项目空白还原糖测定管总糖测定管I1 1还原糖待测液（毫升）01.01.000总糖待测液（毫升）00201.01.0蒸俑水（毫升）2.01.()1.01.01.0DNS试 剂（毫升）1.51.51.51.51.5四、结果与计算:将2管光密度值平均后在标准曲线上查出相应的还原糖毫克
5、数，按下列公式计算样品中还原糖和总糖百分含量。还原糖还原糖毫克数x样品稀释倍数样品重量X100总糖=水解后不原糖毫克数x样品稀释倍数样品毫克数X 0.9 X 1 00五、实验材料、仪器和试剂1.实验材料：山芋粉2.试剂(1)1毫克/毫升葡萄糖标准液：准确称取100毫克分析纯葡萄糖(预先在105烘干至恒重)置于小烧杯中，用少量蒸储水溶解后，定量转移到100毫升的容量瓶中，以蒸播水定容至刻度，摇匀、冰箱保存备用。(2)3,5-二硝基水杨酸试剂(D N S试剂)：甲液溶解6.9克结晶酚于15.2毫 升10%氢氧化钠中，并稀释至69毫升，在此溶液中加入6.9克亚硫酸氢钠。乙液一一称 取255克酒石酸钾
6、钠，加 到300毫 升10%氢氧化钠中，在加入880毫升1%3,5-二硝基水杨酸溶液。将甲液与乙液即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中。在室温下，放置710天以后使用。(3)6mol/LHCL(4)6mol/LNaOH3.器材(1)容 量 瓶(100毫 升)X2,(25毫 升)X I(2)移 液 管(1毫 升)X4,(5毫 升)X2(3)量 筒(100毫 升)X I(4)移液管架(5)试管X5(6)大试管X2(8)滴管X2(1 0)抽滤瓶或离心机(1 2)吸耳球(1 4)水浴锅(7)标签纸X4(9)玻棒X2(11)擦镜纸(13)72型分光光度计(1 5)称量纸(1 6)烧 杯(50毫升或100毫 升
7、)X 1实验二酵母蔗糖酶的提取及动力学分析本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。自 1860年 Bertholet从酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶(invertase)(p一D 吠喃果糖甘果糖水解酶)(fructofuranosidefructohydrolase)(EC.3.2.1.26)特异地催化非还原糖中的。一吠喃果糖甘键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。本实验提取干酵母中
8、的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖醐(external yeast invertase),其活力占蔗糖醐活力的大部分，是 含 有 50%糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶(internalyeast invertase),含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，S er和 M e t,它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验
9、未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。两种酶的性质对照表如下：名称Mw糖 含量亚基底 物为 蔗糖的Km底 物为 棉子 糖的Km等电点pl最适PH稳定PH范围最适温度外酶2 7 万(22 万)50%双26mM150mM5.04.9(3.5 5.5)3.0 7.560内前13.5万3%双25mM150mM4.5(3.5 5.5)6.0 9.0实验中，用测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。本实验共有九个分实验：一、蔗糖酶的提取与部分纯化二、凝胶过滤
10、柱层析(Sephadex G-100)纯化蔗糖酶三、离子交换柱层析(DEAE-Sepharose Fast Flow)纯化蔗糖酶四、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定五、反应时间对产物形成的影响六、p H 对酶活性的影响和最适pH的测定七、温度对酶活性的影响和反应活化能的测定八、底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数K m 和最大反应速度Vm a x的测定九、尿 素（胭）抑制蔗糖酶的实验（一）蔗糖酶的提取与部分纯化一 实验目的：学习酶的纯化方法，并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。二、试剂：1 .干酵母2 .石英砂3 .甲 苯（使 用 前 预 冷 到 以 下）4 .去离子水（使用前冷至4 左右）
11、5 .2 0 m m o l/L T r i s-H C l 缓 冲 液,p H 7.36 .无水乙醇三 仪器：1 .研 钵 1 个2 .离心管2个3.滴管3 个4 .量筒5 0 m l 1 个5 .水浴锅1 个6 .恒温水浴7 .烧 杯 1 0 0 m l 2 个8 .广泛p H 试纸9 .高速冷冻离心机四 操作步骤：1.提取（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。（2）称 取 1 0 g干酵母，放入研钵中，加入适量石英砂。（3）量取30 m l T r i s-H C l 缓冲液缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需6 0 分钟。（4）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心
12、，4,l O O O O r p m,l O m i n。如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4,1 O O O O r p m,离 心 1 O m i n。（7）将清液转入量筒，量出体积，留出0.5 m l 测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。此 为“粗级分I”。2.热处理(1)预先将恒温水浴调到50,将盛有粗级分I 的离心管稳妥地放入水浴中，50下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。(2)取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用 4,lOOOOrpm,离 心 lOmin。(3)将上清液转入量筒，量出体积，留出0.5
13、ml测定酶活力及蛋白质含量(称为“热级分 H)。3.乙醇沉淀将热级分II转入小烧杯中，冰浴，逐滴加入等体积预冷至-2 0 的 95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30 分钟，再在冰浴中放置10分钟，以沉淀完全。于 4,lOOOOrpm,离心lO m in,倾去上清，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存(称为“醛级分HI)。废弃上清液之前，要用尿糖试纸检查其酶活性(于下一个实验一起做)。(-)凝胶过滤柱层析(S e p h a d e x G-1 0 0)纯化蔗糖酶一、原 理凝胶层析法(即凝胶过滤法gel filtration)是根据生物分子大小不同而将其分离开的
14、一种方法，又称为分子筛层析(molecular sieve chromatography),排 阻 层 析(exclusionchromatography),凝胶本身具有一种网状结构即分子筛，它可以把生物分子按大小不同进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分子由于直径大于凝胶孔径，不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。分离过程的示
15、意图见图2-9。342图2-9.凝胶层析的原理A.小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留，大分子被排阻的在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。B.I 蛋白质混合物上柱；2 洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内；大分子则被排阻于内颗粒之外；3 小分子被滞留，大分子向下移动，大小分子开始分开；4 大小分子完全分开；5 大分部子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在行进中。“，商 品 名 Sepharose）,人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel P）和葡聚糖凝 胶（Sephadex）,它们都是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水，其内部结构见图2-1 0,化学结构式如图2-
16、11。图2-1 0.葡聚糖凝胶的内部结构0 CH,CHOHCHOHCH：O、HH?0H HO葡聚糖直链HCHOH交联剂图2-1 1.葡聚糖凝胶化学结构这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同Mr的物质。当凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以V Q o l a l v o l u m e）表示。实际上V,是由V。,M与V g三部分组成，即V产Vo+Vi+%。V o称为“孔隙体积”或“外体积（o u t e r v
17、 o l u m e）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒之间空隙之间的水相体积；%为内体积（i n n e rv o l u m e）,又 称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；Vg为凝胶本身的体积，因此V 1-V 0等于V i+Vg。洗脱体积（V e，e l u t i o n v o l u m n）与V。及V j之间的关系可用下式表示：Ve=V0+KdV j式 中V。为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Q 为样品组分在两相间的分配系数，也可以说凡 是Mr不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分
18、离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与层析柱长短粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。凡 可通过实验获得，上式可改写成：上式中Vc为实际测得的洗脱体积；V。可用不被凝胶阻滞的大分子物质的溶液（最好有颜色以便于观察，如血红蛋白、印度黑墨水、M r约200万的蓝色葡聚糖-2,000等）通过实际测量求出；M可 由gWR求 得（g为干凝胶重，单位为g；WR为凝胶的“吸水量”即膨胀度，以ml/g表示）。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实验得知某一物质得洗脱体积V。，就可算出它的K 值。以上关系可用图4表示。可以有下列几种情况：1.当Kd=O时，则Vc=Vo。即对于根本
19、不能进入凝胶内部的大分子物质（全排阻）,洗脱体积等于外水体积（图2-12组分a）。2.当K d=l时，M=V o+V i。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为外水体积与内水体积之和（图2-12组分c）。可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出的分子即Kd都等于零，虽然分子大小有差别，但不能有分离效果。同样两种分子如都能进入内部空隙，即Kd都等于1,它们即使分子大小有不同，也没有分离效果。因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围。3.当0 心 l,表示凝胶对组分有吸附作用，此时VcVo+Vi。例如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等一些芳香族化合物在Sephadex G-25中的洗脱体积远超出理论计算
20、的最大值（Kd值分别为1.2,1.4,和2.2）,这些化合物的K d l。图2-1 2.凝胶层析柱洗脱的三部分示意图V。表示外体积；V,内体积；V、Vg分别代表组分b 和 c 的洗脱体积在实际工作中，对小分子物质也得不到人=1的数值，特别是交联度大的凝胶差别更大,如用G-1 0 型得K d 值在0.7 5 左右的物质，在用G-2 5 型时K d 在 0.8 左右。这是由于一部分水相与凝胶结合较牢固，成为凝胶本身的一部分，因而不起作用，小分子不能扩散入内所致。此时V i 即不能以g WR计算，为此也常有直接用小分子物质D2O,N a C l 等通过凝胶柱而由实验计算出M值的。另一个解决的办法是不
21、使用V i 与 K d，而 用 Ka v（有效分配系数）代替L，其定义如下：（V -V ）已知 凡,=：-,将 vt-V。代替V贝 I：K即（V,-v）即匕=匕+长 卬（匕一匕）在这里实际上将原来以水作固定相（V i）改为水与凝胶颗粒（V,-V o）作为固定相，而洗脱剂（V e V。）作为流动相。K a v 与 K d 对关联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过V,体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析法的特点，与一般层析方法不同。Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按 M
22、r大小顺序流出，M r大的先洗脱出来。V。与 M r的关系可用下式表示：Ve=K1-K2logMrK|与 K2为常数，M r为相对分子质量，Ve也可用VeVo（分离体积），Ve/Vo（相对保留体积），Vc/Vt（简化的洗脱体积，它受柱的填充情况的影响较小）或 Kav代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同。通常多以Kav对 M r的对数作图得一曲线，称 为“选择曲线”，如图2-13所示。曲线的斜率是说明凝胶性质的一个很重要的特征。在允许的工作范围内，曲线愈陡，则分级愈好，而工作范围愈窄。凝胶层析主要决定于溶质分子的大小，每一类型的化合物，如球蛋白类，右旋糖酢类等都有它自己的特殊的选择曲线，可用
23、以测定未知物的M r,测定时以使用曲线的直线部分为宜。图2-1 3.球蛋白Mr 选择曲线”用凝胶层析法测定蛋白质M r,方法简单，技术易掌握，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可。例如在一粗酶制剂中，为了测定某一酶组分的分子量，只要测定洗脱液中具有该酶最大活性的部分，然后确定其洗脱体积，即可从标准曲线中查出其Mr。凝胶层析法测定M r也有一定的局限性：（1）在 pH6 8 的范围内，线性关系比较好，但在极端pH 时;一般蛋白质有可能因变性而偏离。（2）一般球状蛋白质的轴比虽有差异，但 IgMr与 K”值的线性关系依然维持。而纤维状蛋白质轴比大，不能运用上述公式。如血纤维蛋白就属这种
24、情况。（3）糖蛋白在含糖量超过5%时，测得M r 比真实的要大，这可能是糖在溶液中有较大的水合值所致；而铁蛋白则与此相反，测得的M r 比真实的要小，推测这一现象的发生是由于铁的存在使蛋白质外壳的结构更加紧凑之故。（4）变 性 剂（如尿素）和盐酸胭存在时，只要在同样的条件下测出标准曲线，依然遵守上述公式的关系。（5）有一些酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等会与葡聚糖凝胶形成络合物，这种络合物与酶-底物络合物相似，因此在葡聚糖凝胶上层析时表现异常。用凝胶层析法所测M r 的结果，要和其他方法的测定相对照，由此才可作出较可靠的结论。凝胶层析技术操作方便，设备简单，周期短，重复性能好，而且条件温和，一般
25、不引起生物活性物质的变化，目前已得到相当广泛的应用，例如可用于脱盐，浓缩高分子物质的溶液，生化物质的分离提纯，去除热源物质以及用于测定高分子物质的Mr。下面实验是以葡聚糖凝胶层析法为例测定蛋白质的Mr。二、操作方法（-）一般操作方法1.凝胶的选择和处理：葡聚糖凝胶是以干粉形式保存的，因此使用前必须将干凝胶浸泡于将要用作洗脱剂的相同液体或蒸储水中，充分溶胀后才能使用。根据层析柱的体积和所选用的凝胶膨胀后的床体积（即膨胀度），计算所需凝胶干粉的重量。将称好的干粉倾入过量的洗脱液中，一般多为水、盐溶液或缓冲液，放置于室温，使之充分吸水溶胀。注意不要剧烈搅拌，以防颗粒破碎。浸泡时间根据凝胶交联度不同而
26、异，为了缩短溶胀时间，可在沸水浴上加热至近100,这样可大大缩短溶胀时间至几小时，而且还可杀死细菌和霉菌，并且可排除凝胶内部包藏着的气泡。凝胶颗粒最好大小比较均匀，这样流速稳定，结果较好。如果颗粒大小不匀，可以在浸泡时用倾泻法将不易沉下的较细的颗粒倾去。装柱前最好将溶胀好的凝胶置真空干燥器中抽真空，以除尽凝胶中的空气。2.装柱：层析柱必须粗细均匀，柱管大小可根据实际需要选择。一般柱直径（内径）为 1cm,如果样品量比较多，最好用直径为23 c m 柱。但要注意直径太小时会发生“管壁效应”，即在柱管中心部分组分移动较慢，而在管壁周围移动较快，因而影响分离效果。一般说来，柱越长，分离效果愈好，但柱
27、过长，实验时间长而且样品稀释度大，易扩散，反而分离效果不好。一般用做脱盐时，柱高度50cm比较合适。在进行分级分离时，100cm高度就够了。装柱方法与一般柱层析法相似，柱管可用一般柱层析管，底部目前常用多孔的聚乙烯片做底板。如用烧结玻璃砂板做底，尽量用细孔的（3 号），粗孔的则要在其上铺一层滤纸或尼龙滤布。在装柱前先加适量溶剂到柱内，排走柱底部的空气，并调节柱内液体高度为整个柱高的1/4 1/3。然后将浸泡好的凝胶搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4 1/3时打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上凝胶徐徐下降至需要的高度（注意不要将流速开得过大超过洗脱时的流速）。柱装好
28、后凝胶表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，严防气泡产生。装好的层析柱应立即与洗脱剂连接，调节流速，并且再通过2 3 倍柱床体积的溶剂使柱床稳定（即平衡），并使固定相高度恒定或离子强度与洗脱剂一致。此时层析柱中基质应合乎装填均匀、松紧一致和没有气泡的标准。新装好的柱要检验其均一性，可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000（又称蓝色右旋糖酊，商品名为Blue dextran-2000）、红色葡聚糖或细胞色素c 等配成2mg/ml的溶液过柱，看色带是否均匀下降。或将柱管向光照方向用眼睛观察，看是否均匀，有否“纹路”或气泡。若层析柱床不均一，必须重新装柱。要注意在任何时候不要使液面低于凝胶表面，否则
29、水分挥发，凝胶变干，分离效果变坏，并有可能混入气泡，影响液体在柱内的流动。3.加样：被分离样品溶液一般以浓度大些、体积小些为好，但因用凝胶分离的物质多为M r较大的物质，浓度大时，溶液的粘度也随之变大，而粘度过大就会影响分离效果，所以要照顾到浓度与粘度两方面。分析用量一般为1 2ml（1%2%）/100ml床体积，制备用量一般为2030ml/100ml床体积左右。加样的方法与一般柱层析法相同，即当溶剂（平衡液）流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动固定相表面。待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂至固定相表面一定高度（5cm）,并在柱上
30、端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始洗脱。加样的同时柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集。4.洗脱：洗脱用的液体应与平衡凝胶所用的液体相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果。洗脱用的液体有水（多用于分离不带电荷的中性物质）及电解质溶液（多用于分离带电基团的样品），如酸、碱、盐的溶液及缓冲液等。对于吸附较强的组分，也有使用水与有机溶剂的混合液，如水-甲醇，水-乙醇，水-丙酮等为洗脱剂的，可以减低吸附，将组分洗下。流速与洗脱液加在柱上的压力（因液面差造成）有关。它与一般离子交换树脂不同，加压超过一个极限值，不仅不能增加速度，反而使流速急剧下降。流速对交联度不同大小的凝胶的影响是不同
31、的。对交联度大的凝胶（G-IO至G-50型），流速与柱的压力差成正比,与柱长成反比，与柱的直径无关。对交联度小的凝胶（G-75至G-200型），流速与柱的直径有关，并在一定的适宜操作压差下有最大的流速值。操作压示意图（见图2-14）。CD图2-14.各种层柱装置的操作压（或静水压）A和B：操作压等于或贮液器内液面和出水接管末端的高度洋差，C和D：压力的大小是由恒压瓶内空气入口管的底部至出口接管末端的高度计算，下向（C）或 向 上（D）流动无关重要流速亦受颗粒大小影响，颗粒大时流速较大，但流速大时洗脱峰形常较宽，颗粒小时流速较慢，分离情况较好。在操作时应根据实际需要，在不影响分离效果的情况下，尽
32、可能使流速不致太慢，以免时间过长。5.柱的重新填装：由于在洗脱过程中，所有组分一般全可自柱上洗下，所以装好一次柱管之后，可以反复使用，无须特殊的“再生”处理。但由于在使用过程中，颗粒可能逐渐沉积压紧，因此有使用一段时间后，流速可能逐渐减低，使一次分析时间拖长很久，这时需要将凝胶倒出，重新填装，或者用反冲方法，使凝胶松动冲起，再行沉降。有时流速改变是由于柱顶上有灰尘集聚，则需将表面层除去。由于葡聚糖凝胶为糖类化合物，并且一定要在液相中操作，所以有必要注意防止发霉与生长细菌。一般可用0.02%的叠氮钠（N aN）溶液，它极易溶于水，不与蛋白质和糖反应，也不改变它们的层析效果。也 可 用 0.002
33、%的洗必泰（hibitane）溶液。在弱酸性溶液中可用0.05%（或 0.01%0.02%）三氯丁醇溶液，但它在强碱性溶液或加热到60以上时就要分解。在弱碱性溶液中也可用0.01%乙酸汞溶液防腐消毒。一般不用氯仿、丁醇、甲苯等为防腐剂，因为它们能引起凝胶颗粒的收缩，同时还能进入层析仪器的塑料部件，使塑料变软，造成不良后果。6.凝胶的保存方法：凝胶用完后可用以下方法保存：（1）膨胀状态：即在水相中保存，可加入上述防腐剂，或加热灭菌后于低温保存。（2）半收缩状态：用完后用水洗净，然后再用60 70%乙醇洗，则凝胶体积缩小，于低温保存。（3）干燥状态：用水洗净后，加入含乙醵的水洗，并逐渐加大含醇量，
34、最后用95%乙醇洗，则凝胶脱水收缩，再用乙酸洗去乙醇，抽滤至干，于 60 80干燥后保存。这 3种方法中，以干燥状态保存为最好。（二）用葡聚糖凝胶层析分离蔗糖酶用少量0.02mol/LpH7.3的 Tris-HCl缓冲液充分溶解醇级分H l,（注意玻璃搅棒头必须烧园、搅拌溶解时不可将离心管划伤），若溶液混浊，则用小试管，4000rpm离心除去不溶物。取 0.5ml上清液（即醇级分HI样品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含量），将剩余的清 液（不多于15ml）小心地加到层析柱上，不要扰动柱床，注意要从上样开始使用部分收集器收集，每管2.53.0ml/15min。样品进胶后用缓冲液洗两次，然后加入适
35、量缓冲液，拧紧上盖，开始洗脱，控制流速3.0ml/15min。三、实验材料、仪器和试剂(-)试剂1.Sephadex G-1002.0.5 mmol/L NaOH3.0.5 mmol/L HCL4.0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液5.0.02 mol/L pH7.3(含 0.2 mol/L 浓度 N aC l)的 Tris-HCl 缓冲液(-)仪器1.层 析 柱(1.6 X 80cm)2.部分收集器3.玻璃砂漏斗4.真空泵与抽滤瓶5.精密pH 试纸或pH 计6.核酸蛋白检测仪7.蠕动泵(三)离子交换柱层析(DEAE-Sepharose Fast Flow)纯化蔗糖酶
36、3.3离子交换层析3.3.1 简介离子交换层析(Ion Exchange Chromatography简称为IE C)是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪4 0年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核甘酸等的分离纯化。3.3.2 基本原理离子交换层析是依
37、据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团.平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。离子交换反应可以表示为：阳离子交换反应：(R
38、 X-)Y+A+=(R X-)A+Y+阴离子交换反应：(RX+)Y-+A-Q(RX+)A-+Y其中R代表离子交换剂的高分子聚合物基质，X-和X+分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，Y+和Y-分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子，A+和A-分别代表溶液中的离子基团。从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交换剂的结合力强于Y离子，或者提高A离子的浓度，或者通过改变其它一些条件，可以使A离子将Y离子从离子交换剂上置换出来。也就是说，在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来,并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交
39、换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置换出来，随洗脱液流
40、出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来，而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来，从而达到分离目的。各种离子与离子交换剂上的电荷基团的结合是由静电力产生的，是一个可逆的过程。结合的强度与很多因素有关，包括离子交换剂的性质、离子本身的性质、离子强度、pH、温度、溶剂组成等等。离子交换层析就是利用各种离子本身与离子交换剂结合力的差异，并通过改变离子强度、pH 等条件改变各种离子与离子交换剂的结合力而达到分离的目的。离子交换剂的电荷基团对不同的离子有不同的结合力。一般来讲，离子价数越高，结合力越大；价数相
41、同时.，原子序数越高，结合力越大。如阳离子交换剂对离子的结合力顺序为:Li+Na+K+Rb+Cs+；Na+Ca2+Al3+Ti4+o蛋白质等生物大分子通常呈两性,它们与离子交换剂的结合与它们的性质及pH 有较大关系。以用阳离子交换剂分离蛋白质为例，在一定的pH 条件下，等电点pl pH 的蛋白带正电，能与阳离子交换剂结合，一般p l越大的蛋白与离子交换剂结合力越强。但由于生物样品的复杂性以及其它因素影响，一般生物大分子与离子交换剂的结合情况较难估计，往往要通过实验进行摸索。3.3.3离子交换剂的种类和性质1.离子交换剂的基质离子交换剂的大分子聚合物基质可以由多种材料制成，聚苯乙烯离子交换剂（又
42、称为聚苯乙烯树脂）是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔网状结构的聚苯乙烯为基质。聚苯乙烯离子交换剂机械强度大、流速快。但它与水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变性。故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核甘酸等。以纤维 素（Cellulose）,球状纤维素（Sephacel）、葡 聚 糖（Sephadex）、琼 脂 糖（Sepharose）为基质的离子交换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离蛋臼质等大分子物质，葡聚糖离子交换剂一般以S e p h a d e x G 2 5和G-5 0为基质，琼脂糖离子交换剂一般以S e p h a r os e C L-6 B为基质。关于
43、这些离子交换剂的性质可以参阅相应的产品介绍。2.离子交换剂的电荷基团根据与基质共价结合的电荷基团的性质，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。阳离子交换剂的电荷基团带负电,可以交换阳离子物质。根据电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型和弱酸型三类。它们的区别在于它们电荷基团完全解离的p H范围，强酸型离子交换剂在较大的p H范围内电荷基团完全解离，而弱酸型完全解离的p H范围则较小，如竣甲基在p H小于6时就失去了交换能力。一般结合磺酸基团（-S O3H）,如磺酸甲基（简写为S M）、磺酸乙基（S E）等为强酸型离子交换剂，结合磷酸基团（-P 0 3 H 2）和亚磷酸基团（
44、-P O2H）为中等酸型离子交换剂，结合酚羟基（-0 H ）或竣基（-C O O H）,如竣甲基（CM）为弱酸型离子交换剂。一般来讲强酸型离子交换剂对H离子的结合力比N a+离子小，弱酸型离子交换剂对H离子的结合力比N a+离子大。阴离子交换剂的电荷基团带正电，可以交换阴离子物质。同样根据电荷基团的解离度不同，可以分为强碱型、中等碱型和弱碱型三类。一般结合季胺基团（-N（C H3）3）,如季胺乙基（Q A E）为强碱型离子交换剂，结合叔胺（-N（C H 3）2）、仲胺（-N H C H 3）、伯胺（-N H,）等为中等或弱碱型离子交换剂，如结合二乙基氨基乙基（D E A E）为弱碱型离子交换剂
45、。一般来讲强碱型离子交换剂对O H-离子的结合力比C L离子小，弱酸型离子交换剂对离子的结合力比C L离子大。3.交换容量交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换剂所能提供交换离子的总量，又称为总交换容量，它只和离子交换剂本身的性质有关。在实际实验中关心的是层析柱与样品中各个待分离组分进行交换时的交换容量，它不仅与所用的离子交换剂有关，还与实验条件有很大的关系，一般又称为有效交换容量。后面提到的交换容量如未经说明都是指有效交换容量。影响交换容量的因素很多，主要可以分为两个方面，一方面是离子交换剂颗粒大小、颗
46、粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的大小等的影响。这些因素主要影响离子交换剂中能与样品组分进行作用的有效表面积。样品组分与离子交换剂作用的表面积越大当然交换容量越高。一般离子交换剂的孔隙应尽量能够让样品组分进入，这样样品组分与离子交换剂作用面积大。分离小分子样品，可以选择较小孔隙的交换剂，因为小分子可以自由的进入孔隙，而小孔隙离子交换剂的表面积大于大孔隙的离子交换剂。对于较大分子样品，可以选择小颗粒交换剂，因为对于很大的分子，一般不能进入孔隙内部，交换只限于颗粒表面，而小颗粒的离子交换剂表面积大。另一些影响因素如实验中的离子强度、pH 值等主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。一般pH对弱酸
47、和弱碱型离子交换剂影响较大，如对于弱酸型离子交换剂在pH较高时，电荷基团充分解离，交换容量大，而在较低的pH 时，电荷基团不易解离，交换容量小。同时pH 也影响样品组分的带电性。尤其对于蛋白质等两性物质，在离子交换层析中要选择合适的p H 以使样品组分能充分的与离子交换剂交换、结合。一般来说，离子强度增大，交换容量下降。实验中增大离子强度进行洗脱，就是要降低交换容量以将结合在离子交换剂上的样品组分洗脱下来。离子交换剂的总交换容量通常以每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的毫克当量数（1 4/0 或 114/011）来表示。通常可以由滴定法测定。阳离子交换剂首先用HC1处理，使其平衡离子为H+。再
48、用水洗至中性，对于强酸型离子交换剂，用 NaCl充分置换出H+,再用标准浓度的NaOH滴定生成的H C L 就可以计算出离子交换剂的交换容量；对于弱酸型离子交换剂，用一定量的碱将IT充分置换出来，再用酸滴定，计算出离子交换剂消耗的碱量，就可以算出交换容量。阴离子交换剂的交换容量也可以用类似的方法测定。对于一些常用于蛋白质分离的离子交换剂也通常用每毫克或每毫升交换剂能够吸附某种蛋白质的量来表示，一般这种表示方法对于分离蛋白质等生物大分子具有更大的参考价值。实验前可以参阅相应的产品介绍了解各种离子交换剂的交换容量。3.3.4离子交换剂的选择、处理和保存1.离子交换剂的选择离子交换剂的种类很多，离子
49、交换层析要取得较好的效果首先要选择合适的离子交换剂。首先是对离子交换剂电荷基团的选择，确定是选择阳离子交换剂还是选择阴离子交换剂。这要取决于被分离的物质在其稳定的pH 下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换剂；如带负电，则选择阴离子交换剂。例如待分离的蛋白等电点为4,稳定的p H 范围为69,由于这时蛋白带负电，故应选择阴离子交换剂进行分离。强酸或强碱型离子交换剂适用的pH 范围广，常用于分离一些小分子物质或在极端pH 下的分离。由于弱酸型或弱碱型离子交换剂不易使蛋白质失活，故一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂。其次是对离子交换剂基质的选择。前面已经介绍了，聚苯乙烯离子
50、交换剂等疏水性较强的离子交换剂一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核甘酸等。而纤维素、葡聚糖、琼脂糖等离子交换剂亲水性较强，适合于分离蛋白质等大分子物质。一般纤维素离子交换剂价格较低，但分辨率和稳定性都较低，适于初步分离和大量制备。葡聚糖离子交换剂的分辨率和价格适中，但受外界影响较大，体积可能随离子强度和pH变化有较大改变，影响分辨率。琼脂糖离子交换剂机械稳定性较好，分辨率也较高，但价格较贵。另外离子交换剂颗粒大小也会影响分离的效果。离子交换剂颗粒一般呈球形，颗粒的大小通常以目数（mesh）或者颗粒直径（|im）来表示，目数越大表示直径越小。前面在介绍交换容量时提到了一些关于交换剂颗