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1、.资.料.山楂叶中黄酮类提取工艺与质量标准的研究 一、实验目的 1 掌握从山楂叶中提取总黄酮的原理、方法及操作要点。2 掌握正交试验的原理及方法。3 掌握 UV含量测定、TLC 的原理和方法。二、实验原理 利用正交试验法筛选最佳提取工艺，以总黄酮量为指标，芦丁为对照品进行含量测定，以得出的最佳工艺做验证实验，TLC 的结果做质量标准的研究。三、材料与仪器 材料：山楂叶、芦丁标准品、聚酰胺板 试剂：95%乙醇、甲酸、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3、AlCl3 仪器：UV2550 紫外可见分光光度计(日本岛津)、循环水式真空泵、旋转蒸发仪、抽滤装置、圆底烧瓶、冷凝管、层析缸、电子天平 四、
2、实验步骤 1 山楂叶总黄酮的提取 用剪刀将干燥的山楂叶剪碎，准确称取 5.0g 置于烧杯中，称取 9份用来做正交试验，根据正交试验要求加入一定浓度、体积的乙醇回流提取一定时间。趁热抽滤，用 50ml 50%乙醇洗涤，合并滤液，减压浓缩至体积小于 100ml，用 60%乙醇定容至 100ml，作为待测液。2 标准曲线的制备.资.料.将芦丁于 120干燥至恒重，精密称取芦丁标准品 9.28mg，用 60%乙醇溶解，定容于 50ml，得浓度为 0.186mg/ml芦丁标准液。准确吸取芦丁标准液 0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml 于 25ml 容量瓶中，每瓶加去离子水至 6ml，加 5%
3、NaNO2溶液 1ml，摇匀，放置6min 后加入10%Al(NO3)3溶液1ml，摇匀，放置6min 后加入4%NaOH溶液 10ml，去离子水定容，摇匀，15min 后于 500nm 处测定吸光度A，得芦丁含量与 A之间的回归方程。3 山楂叶总黄酮的测定 准确吸取待测液 0.4ml于 25ml 容量瓶中，步骤同上，测定其在500nm 处吸光度，计算每组山楂叶中总黄酮含量。算出正交试验中的 K和 R值，从而得出最佳工艺。4 验证实验 根据最佳工艺，做验证实验，提取、含量测定方法如上。5 TLC 鉴定 吸附剂：聚酰胺板 展开剂：乙醇-甲酸-水（4:0.01:1 v/v/v）以最佳工艺提取出的溶
4、液为供试品溶液，另取配好的芦丁对照品溶液各 2-3l，分别点于同一聚酰胺板上，以乙醇-甲酸-水（4:0.01:1 v/v/v）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，热风吹干，置紫外光灯(365nm)下检视。交试验的原理及方法掌握含量测定的原理和方法二实验原理利用正交试验法筛选最佳提取工艺以总黄酮量为指标芦丁为对照品进行含量测定以得出的最佳工艺做验证实验的结果做质量标准的研究三材料与仪器材料山楂叶芦丁标准品析缸电子天平四实验骤山楂叶总黄酮的提取用剪刀将干燥的山楂叶剪碎准确称取置于烧杯中称取份用来做正交试验根据正交试验要求加入一定浓度体积的乙醇回流提取一定时间趁热抽滤用乙醇洗涤合并滤液减压
5、浓缩至体积小于用乙丁标准液准确吸取芦丁标准液于容量瓶中每瓶加去离子水至加溶液摇匀放置后加入溶液摇匀放置后加入溶液去离子水定容摇匀后于处测定吸光度得芦丁含量与之间的回归方程山楂叶总黄酮的测定准确吸取待测液于容量瓶中步骤同上.资.料.五、实验结果 1 标准曲线 芦丁体积/ml 吸光度 A 1 2 3 4 5 0.065 0.147 0.219 0.306 0.356 芦丁标准曲线y=0.0741x-0.0037R2=0.99400.050.10.150.20.250.30.350.412345mlT系列1线性(系列1)交试验的原理及方法掌握含量测定的原理和方法二实验原理利用正交试验法筛选最佳提取工
6、艺以总黄酮量为指标芦丁为对照品进行含量测定以得出的最佳工艺做验证实验的结果做质量标准的研究三材料与仪器材料山楂叶芦丁标准品析缸电子天平四实验骤山楂叶总黄酮的提取用剪刀将干燥的山楂叶剪碎准确称取置于烧杯中称取份用来做正交试验根据正交试验要求加入一定浓度体积的乙醇回流提取一定时间趁热抽滤用乙醇洗涤合并滤液减压浓缩至体积小于用乙丁标准液准确吸取芦丁标准液于容量瓶中每瓶加去离子水至加溶液摇匀放置后加入溶液摇匀放置后加入溶液去离子水定容摇匀后于处测定吸光度得芦丁含量与之间的回归方程山楂叶总黄酮的测定准确吸取待测液于容量瓶中步骤同上.资.料.2 正交试验 水平 A乙醇浓度 B 浸提温度 C 浸提时间 D
7、料液比 /%/%/h g/ml 1 50 50 1 1:10 2 60 60 1.5 1:15 3 70 70 2 1:20 实验号 A B C D 总黄酮量/mg 1 1 1 1 1 318.54 2 1 2 2 2 336.07 3 1 3 3 3 510.15 4 2 1 2 3 479.47 5 2 2 3 1 449.41 6 2 3 1 2 471.95 7 3 1 3 2 451.92 8 3 2 1 3 418.73 9 3 3 2 1 414.97 K1 1164.76 1249.93 1209.22 1182.92 K2 1400.83 1204.21 1230.51 12
8、59.94 K3 1285.62 1397.07 1411.48 1408.35 R 236.2 192.86 202.5 225.6 交试验的原理及方法掌握含量测定的原理和方法二实验原理利用正交试验法筛选最佳提取工艺以总黄酮量为指标芦丁为对照品进行含量测定以得出的最佳工艺做验证实验的结果做质量标准的研究三材料与仪器材料山楂叶芦丁标准品析缸电子天平四实验骤山楂叶总黄酮的提取用剪刀将干燥的山楂叶剪碎准确称取置于烧杯中称取份用来做正交试验根据正交试验要求加入一定浓度体积的乙醇回流提取一定时间趁热抽滤用乙醇洗涤合并滤液减压浓缩至体积小于用乙丁标准液准确吸取芦丁标准液于容量瓶中每瓶加去离子水至加溶液摇
9、匀放置后加入溶液摇匀放置后加入溶液去离子水定容摇匀后于处测定吸光度得芦丁含量与之间的回归方程山楂叶总黄酮的测定准确吸取待测液于容量瓶中步骤同上.资.料.由上图可得:影响山楂叶总黄酮提取率的因素由大至小排列顺序为A、D、C、B、,每个因素各水平之间大小排列为：A2A3A1、D3D2D1、C3C2C1、B3B1B2，则最佳工艺为 A2B3C3D3.3 验证实验 根据最佳工艺，60%乙醇回流提取 2h，料液比 1：20，进行验证实验，步骤同上，计算总黄酮量=557.1mg，计算每克山楂叶中总黄酮量为 11.1%。4 TLC 结果 吸附剂：聚酰胺板 显色剂：2%氯化铝甲醇溶液 展开剂：乙醇-甲酸-水（
10、4:0.01:1 v/v/v）交试验的原理及方法掌握含量测定的原理和方法二实验原理利用正交试验法筛选最佳提取工艺以总黄酮量为指标芦丁为对照品进行含量测定以得出的最佳工艺做验证实验的结果做质量标准的研究三材料与仪器材料山楂叶芦丁标准品析缸电子天平四实验骤山楂叶总黄酮的提取用剪刀将干燥的山楂叶剪碎准确称取置于烧杯中称取份用来做正交试验根据正交试验要求加入一定浓度体积的乙醇回流提取一定时间趁热抽滤用乙醇洗涤合并滤液减压浓缩至体积小于用乙丁标准液准确吸取芦丁标准液于容量瓶中每瓶加去离子水至加溶液摇匀放置后加入溶液摇匀放置后加入溶液去离子水定容摇匀后于处测定吸光度得芦丁含量与之间的回归方程山楂叶总黄酮的
11、测定准确吸取待测液于容量瓶中步骤同上.资.料.六、实验讨论 1 因为水浴锅控温不准确，所以去掉了正交试验中的提取温度这一因素，就成了 3 水平 3 因素了。2 抽滤时速度很慢，换大号的布氏漏斗或者在滤纸上加一层纱布，抽滤速度明显加快。3 TLC 结果显示，山楂叶中没有芦丁,但是有黄酮类化合物。交试验的原理及方法掌握含量测定的原理和方法二实验原理利用正交试验法筛选最佳提取工艺以总黄酮量为指标芦丁为对照品进行含量测定以得出的最佳工艺做验证实验的结果做质量标准的研究三材料与仪器材料山楂叶芦丁标准品析缸电子天平四实验骤山楂叶总黄酮的提取用剪刀将干燥的山楂叶剪碎准确称取置于烧杯中称取份用来做正交试验根据正交试验要求加入一定浓度体积的乙醇回流提取一定时间趁热抽滤用乙醇洗涤合并滤液减压浓缩至体积小于用乙丁标准液准确吸取芦丁标准液于容量瓶中每瓶加去离子水至加溶液摇匀放置后加入溶液摇匀放置后加入溶液去离子水定容摇匀后于处测定吸光度得芦丁含量与之间的回归方程山楂叶总黄酮的测定准确吸取待测液于容量瓶中步骤同上