基因工程技术.docx

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1、1、 简述获得目的基因常用的几种方法？P97-P130（1） 直接从染色体 RNA 中分别：仅适用于原核生物、叶绿体和线粒体基因的分别；（2） 人工合成:依据多肽链的氨基酸挨次，利用遗传密码表推定其核苷酸挨次再进展人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。（3） 从 mRN 合成 cDNA：承受肯定的方法钓取特定基因的 mRNA 再通过逆转录酶催化合成其互补 DNA(cDNA，除去RNA 链后，再用DNA 聚合酶合成其互补 DNAg，从而得到双链 DNA 这一方法通常可得到可表达的完整基因)。（4） 利用 PCF 合成:如目的基因两端的序列，则可承受聚合酶链反响(PCR)技术，在体外合成目的基因。

2、（5） 从基因文库中筛选:首先建立基因组或 cDNA 文库，利用探针从文库中筛选目的克隆。2、 分子克隆载体应具备哪些特点?克隆载体是能够通过限制性内切酶，将目的 DNA 片段整合进去，并且能够转入宿主细胞进展表达的生物 DNA。通常承受从病毒、质粒或高等生物细胞中猎取的 DNA 作为克隆载体，在载体上插入适宜大小的外源 DNA 片段，并留意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量生殖。常见的载体有质粒， 噬菌粒，酵母人工染色体。对载体的要求：能在宿主细胞中复制生殖，而且最好要有较高的自主复制力量。简洁进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。简洁插入外来核酸片

3、段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体 DNA 上要有适宜的限制性核酸内切酶位点。简洁从宿主细胞中分别纯化出来， 这才便于重组操作。有简洁被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能简洁被识别和分别出来。3、 简述 PCR 技术原理与主要过程。P79主要过程：PCR 由变性-退火-延长三个根本反响步骤构成:（1） 板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 94左右肯定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响做预备;（2） 模板 DNA 与引物的退火(复性)：模板 DN

4、A 经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合;（3） 引物的延长：DNA 模板-引物结合物在 Taq 酶的作用下，以 dNTP 为反响原料，靶序列为模板按碱基配对与半保存复制原理,合成一条的与模板 DNA 链互补的半保存复制链。重复循环变性-退火-延长三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟，23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。4、入噬菌体生物学特性。P42生物构造：入噬菌体是大肠杆菌的温顺型噬菌体，由外壳包装蛋白和入 -DNA组成。感染周期：吸附、注入、复制、包装、裂解。100 个

5、左右的拷贝，体内包装， 包装范围为原 DNA 的 75-105%，即 36-51kb溶原状态：入噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其 DNA 直接整合到宿主细胞的染色体 DNA 上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种状况为溶原状态。整合主要由入-DNA 上的 d 和 int 两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以依据需要转变入-DNA 或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶原状态。DNA 重组技术一般需要入噬菌体进入溶菌状态。5、入-DNA 载体的构建P42-43缩短长度。野生型入-DNA 包装的上限为 51kb，本身长度为 485k

6、b，只有当插入的外源 DNA 片段不大于 2.5kb 时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型入-DNA 的长度，可以提高装载量。其实野生型入-DNA 上约有 40-50% 的片段是复制和裂解所非必需的。依据切除的多少，可将入-DNA 分成两大类载体:插入型载体和取代型载体。删除重复的酶切位点:野生型的入-DNA 链上有 5 个 EcoRI 位点和 7 个 HindII 位点不利于重组操作，必需删除至 1-2 个，同时为便于各种来源的 DNA 片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。除了简洁的切割外，还需要承受定点突变技术去除或增加酶位点。加装选择标记:与质粒不同，野生型入-DN

7、A 上缺少适宜的选择标记，因此加装选择标记是入-DNA 克隆载体构建的重要内容。6、各种基因工程受体的特性P48-50大肠杆菌：遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长快速，培育简洁，重组子稳定:产构造简单、种类繁多的内毒素;适用于外源 DNA 的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是 DNA 重组试验和基因工程的主要受体菌枯草杆菌：遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长快速，培育简洁，不产内毒素:遗传欠稳定，载体受体系统欠完备:适用于原核生物基因的克降、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌。酵母菌：具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长快速，培育简洁，外源基因表达系统完善，遗传稳定;内

8、源性蛋白产物种类繁多且含量高;适用于外源 DNA 的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的争论，是 DNA 重组试验和基因工程重要的真核性受体菌。链霉菌：抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素；遗传不稳定生长相对缓慢;主要用于抗生素生产菌株的改进。7、基因克隆的根本原理P132基因克隆技术，又称重组 DNA 技术，是将 目的基因与具有自主复制力量的载体DNA 进展体外重组，获得的重组DNA 后导入受体细胞中表达相应蛋白， 以争论蛋白构造与功能及其与其他分子的相互作用。8、简述基因克隆的根本流程。DNA 克隆过程：目的基因的猎取，基因载体的选择

9、与构建，目的基因与载体的拼接，重组 DNA 分子导入受体细胞，筛选并无性生殖含重组分子的受体细胞(转化子)。（1） 目的 DNA 片段的获得：DNA 克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群 DNA 分子，这些 DNA 分子或来自于目的生物基因组 DNA 或来自目的细胞 mRNA 逆转录合成的双链cDNA 分子。由于基因组 DNA 较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的 DNA 小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。假设是基因序列而且比较小就可用人工化学直接合成。假设基因的两端局部序列，依据序列设计引物，从基因组 DNA 或 cDNA 中通过 PCR 技术可以获得目的基

10、因。（2） 载体的选择：基因克隆常用的载体有：质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒载体、单链DNA 噬菌体载体、噬粒载体及酵母人工染色体等。从总体上讲，依据载体的使用目的， 载体可以分为克隆载体、表达载体、测序载体、穿梭载体等。（3） 体外重组：体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割 DNA 分子形成有黏性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得一样的黏性末端，黏性末端彼此退火，通过 T4 DNA 连接酶的作用便可形成重组体，此为黏末端连接。当目的 DNA 片断为平端，可以直接与带有平端载体相连，此为平末端连接， 但连接效率比黏端相连差些。有时为

11、了不同的克隆目的，如将平端 DNA 分子插入到带有黏末端的表达载体实现表达时，则要将平端 DNA 分子通过一些修饰； 如同聚物加尾，加连接物或人工接头，PCR 法引入酶切位点等，可以获得相应的黏末端，然后进展连接，此为修饰黏末端连接。（4） 导入受体细胞：载体 DNA 分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制，重组载体中的目的基因伴同载体一起被扩增，最终获得大量同一的重组 DNA 分子。（5） 重组子的筛选：P152从不同的重组 DNA 分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。11、假设知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨

12、基酸序列组成，可以通过 何种方法克隆该基因？|答：可以通过合成核苷酸探针或设计简并 PCR 引物从 cDNA 文库或基因组文库中筛选。或者|利用相应的抗体从 cDNA 表达文库中筛选相应的克隆12、 YAC 载体具有什么样的功能性 DNA 序列？为什么在克隆大片段时， YAC 具有优越性？答： YAC 带有自然染色体全部的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA 复制起点，两个端 1 粒。YAC 能够容纳长达几百 kb 的外源 DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够削减完整基因组文库所需的克隆数目。13、怎样将一个平末端

13、DNA 片段插入到 EcoR1 限制位点中去？答：化学合成一些长为 10bp 含有 EcoRI 识别位点的短的 DNA 片段，然后与待克隆片段两端连接起来，假设用 EcoRI 切割这种连接片段，就会产生 EcoRI 的单链末端。这种片段就可以插入到任何 EcoRI 的限制性内切酶位点中。14、什么是 Western 印迹？它与 Southern 印迹有什么不同答： Western 印迹是将蛋白质经电泳分别后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进展检测。它与 Southern 的不同在于探针的性质不同，在Western 印迹中使用的探针是抗体蛋白质。15、说明限制性内切核酸酶的命名原则

14、要点。答：限制性内切核酸酶承受三字母的命名原则即属名种名株名的各一个首字母，再加上序号根本原则：34 个字母组成，方式是：属名种名株名 序号；首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写；其次字母：取种名的第一个字母，斜体小写；第三字母：1取种名的其次个字母，斜体小写；2假设种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替；第四字母：假设有株名， 株名则作为第四字母，是否大小写，依据原来的状况而定，但用正体，挨次号： 假设在同一菌株中分别了几种限制酶，则按先后挨次冠以 I， I， 1， .等，用正体.16、什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素影向？答：类限制酶虽然识别和切割的序列都具有

15、特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在肯定环境条件下表现出来的特异性。条件的转变，限制酶的特异性就会松动，识别而将这种因条件的转变会消灭其次活性的酶的右上角加一个星号表示，因此其次活性又称为星号活性。概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：1高甘油含量25%， v/v；2限制性内切核酸酶用量过高100U/ ugDNA；3低离子强度25 mmol/L；4高 pH8.0 以上； 5含有有机溶剂，如 DMSO，乙醇等；6有非 Mg2+的二价阳离子存在如 Mn2+， Cu2+， C02+， Zn2+17、什么是蓝白斑筛选法？答：这种方法是依据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在入载体的非必要区插入

16、一个带有大肠杆菌半乳糖苷酶的基因片段，携带有 lac 基因片段的入载体转入 lac 的宿主菌后，在含有 5溴4氯3引哚 D半乳糖苷Xgal平板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插人 lac或 lac 基因局部被取代 后，重组的噬菌体将丧失分解 Xgal 的力量，转入 lac 宿主菌后，在含有 5溴4氯3引哚D半乳糖苷xgal平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。18、蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性?答：蓝白斑筛选法消灭假阳性的缘由：-半乳糖苷酶的 N 末端是非必需的，可以进展修饰，并不影响酶的活性或肽的互补性。假设插入的外源 DNA 引起 肽的可读框的转变或者插入片段在正确的可读框

17、中含有终止密码的话，就形成白色噬菌斑。假设插入 DNA 的碱基数正好是 3 的倍数，或者插入的 DNA 中不含有终止子的话，仍会形成蓝白菌落。这种插入物的长度可达几百个碱基对蓝白斑筛选法原理：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖甘酶基因片段，在半乳糖甘酶基因区外又另外引入了一段含有多种单一限制性酶切位点的 dna 序列，这些位点上假设没有克隆外源性 dna 片段，在质粒导入 Lac 的大肠杆菌后质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，参加底物 Xgal 和诱导剂 IPTG 后出来蓝色菌落；假设在多克隆位点上插入外源基因，则使LacZ基因灭火，不能生成

18、半乳糖苷酶，结果菌落消灭白色，由于这种颜色标志，重组与非重组体的区分一目了然。 (2)假阳性的缘由： 不肯定就是目的基因19、什么是 cDNA 文库(complementDNAlibrary)?同基因组文库有何差异?答：1cDNA 文库是通过对一系列 mRNA 反转录并对特别的克隆予以筛选得到的，cdna 文库是以某一生物的总 mRNA 为模板，在无细胞系统中，在反转录酶作用下首先合成一条互补的 DNA 即第一链，破坏 RNA 模板后，在以第一链为模板合成其次链，得到双链的 DNA 即 cDNA，选用适合的载体，将合成的 cDNA 重组导入寄主细胞，经筛选得到的 cDNA 克隆群为 cDNA

19、文库2差异：基因组文库含有全部基因，cDNA 文库含有全部蛋白编码的构造基因，cDNA 文库小于基因组文库20、大肠杆菌作为基因工程受体菌具有哪些特点？真核基因在大肠杆菌中表达 存在哪些障碍？特点：大肠杆菌培育便利、操作简洁、本钱低廉，根底生物学、分子遗传学等方面的背景学问清楚，对其基因表达调控的分子机理也比较了解，而且历经二十年的基因工程实践，大肠杆菌已进展成为一种安全的基因工程试验体系，有多种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进展工业化批量生产。存在的障碍：第一，在大肠杆菌的 mRNA 的核糖体结合位点上，含有一个起始密码子及 16S 核糖体 RNA 3末端碱基互补序列，即 S-D 序

20、列，而真核上缺泛这个序列。其次，很多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白。第三、外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别， 并被当做“异已分子”降解掉。21、试述 5RACE 技术原理和方法PCR 用于扩增代表 mRNA 转录物某一单位点与其 3或 5末端之间区域的局部cDNA 称为快速扩增 cDNA 末端技术RACE。假设 mRNA 的一片段链内短序列，据此或设计基因特异引物，用原先存在的 poly(A)尾3末端或附加的同聚尾5末端互补的序列做末端引物

21、，就可以获得从未知末端直到区域的局部 cDNA 序列。为获得 5末端局部 cDNA 克隆需用基因特异引物，产物第一链产物，可用末端脱氧核苷酸转移酶及 dATP 加 poly(A)尾。通过 QT 引物和反转录使用的上游基因特异引物生成其次链 cDNA。22、大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？优点：大肠杆菌培育便利、操作简洁、本钱低廉，根底生物学、分子遗传学等方面的背景学问清楚，对其基因表达调控的分子机理也比较了解，而且历经二十年的基因工程实践，大肠杆菌已进展成为一种安全的基因工程试验体系，有多种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进展工业化批量生产。缺点：在通常状况下，细菌的 RNA

22、聚合酶不能识别真核的启动子；很多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白；外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。23、常用的目的基因与载体的连接方法有哪些？答：外源 DNA 片段同载体分子连接的方法，即 DNA 分子体外重组技术，主要是依靠于核酸内切限制酶和 DNA 连接酶的作用.一般说来在选择外源 DNA 同载体分子连接反响程序时，需要考虑到以下三个因素：1试验步骤要尽可能地简洁易行；2连接形成的“接点”序列，应能被肯定的核

23、酸内切限制酶重切割，以便回收插入的外源 DNA 片段；(3) 对转录和转译程中密码构造的阅读不发生干扰。24、解释质粒，为什么质粒可作为基因载体。答：质粒是细菌拟核暴露 DNA 外的遗传物质。质粒：1具有较小的分子量。阅历说明，为了避开在 DNA 的纯化过程中发生链的断裂，克隆载体的分子大小最好不要超过 10Kb。pBR322 质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身 DNA 的纯化，而且可容纳较大的外源 DNA 片段；2具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组 DNA分子是否进入宿主细胞以及外源 DNA 分子是否插入载体分子形成了重组子。25、抗性基因是目前使用的最广泛的选

24、择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？ 并举两例说明其原理？答：氨苄青霉素抗性基因ampr、四环素抗性基因 tetr、氯霉素抗性基因Cmr、卡那霉素和霉素抗性基因 kanr氨苄青霉素抗性基因 ampr：青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反响 氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反响并催化b内酰胺环水解水解青霉素，从而解除了苄青霉素的毒性。四环素抗性基因 tetr： 四环素可与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻挡四环素进入细胞。26、YAC 载体具

25、有什么样的功能性元件？为什么它在克隆大片段时具有很大的优越性？答：YAC 带有自然染色体全部的功能元件，包括自主复制序列 ARS，一个着丝粒， 两个端粒，选择标记，筛选模型。优越性：YAC 能够容纳长达几百 Kb 的外源 DNA，这是质粒和粘粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够削减完整基因组文库所需的克隆数目。YAC 有敏捷性，可作为质粒在 E.coil 中增殖；与大片段连接时，可导入酵母，作为真正染色体在酵母复制中有丝分裂。27、一个抱负的载体应具备那些条件？（1） 能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制2具有适宜的限制性内切酶位点

26、。在载体上单一的限制性内切酶位点越多越好，这样可以将不同限制性内切酶切割后的外源 DN A 片段便利地插入载体3具有适宜的筛选标记。如抗药性基因等4在细胞内拷贝数要多。这样才能使外源基因得以扩增5载体的相对分子质量要小。这样可以容纳较大的外源 DNA 插入片段。载体的相对分子质量太大将影响重组体或载体本身的转化效率6在细胞内稳定性高。这样可以保证重组体稳定传代而不易丧失7具安全性28、目前常用的转基因方法有哪些，各有何特点？答：1.Ca 离子诱导的转化，Ca 离子与细胞外膜磷脂在低温下形成液晶构造，后者经过热脉冲发生收缩作用，使得细胞膜消灭空隙，细菌细胞此时的状态叫感受态。（2） 电穿孔转化：

27、将待转化的质粒或 dna 重组连接液加在电穿孔转换仪的样品池中，两级施加高压电场，在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙， 质粒或 dna 重组分子进入，特点是（3） 细菌原生质体的转化：革兰氏阴性菌如枯草杆菌接纳外源 dna 的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常用原生质体转化的方法转移质粒或重组 dna 分子， 酵母菌，霉菌，植物细胞也可用此法。29、转化、转染、转导的异同？Transformation (转化)：细菌接纳外源 DNA 而引入的基因标记。Transduction (转导)：指噬菌体将细菌基因从一种细菌中转移到另一种细菌中。一个携带自身以及宿主基因的噬菌体称为转导噬菌体。也可指逆转录病毒获得和转移真核基因。30、为什么 pUC 系列的载体与外源基因形成的重组体可以用蓝白斑试验进展筛选？答：pUC 系列载体带有大肠杆菌的 LacZ基因片段，在该基因内部含有多种限制性内切酶位点，在这些位点上假设没有克隆外源 DNA 片段，在质粒导入 Lac 的大肠杆菌后质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，参加底物 Xgal 和诱导剂 IPTG 后出来蓝色菌落；假设在多克隆位点上插入外源基因，则使LacZ基因灭火，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落消灭白色，由于这种颜色标志，重组与非重组体的区分一目了然。