《2015年生物化学与分子生物学基本实验.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2015年生物化学与分子生物学基本实验.pdf（56页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 基 本 实 验实 验 一 蛋 白 质 的 盐 析 与 透 析 实 验 目 的 了 解 蛋 白 质 的 盐 析 与 透 析 的 原 理 和 意 义 实 验 原 理 血 清 中 的 蛋 白 质，用 盐 析 的 方 法，可 以 分 离 出 清 蛋 白、a、B球 蛋 白 和 Y-球 蛋 白 三 种。详 情 见 盐 析 技 术。另 选 择 适 宜 孔 径 的 半 透 膜，使 蛋 白 质 分 子 被 截 留，小 分 子 的 中 性 盐 透 出 而 达 分 离 的 目 的。但 透 析 时 正 负 离 子 透 过 半 透 膜 的 速 度 不 同，如 硫 酸 镂 中 的
2、NH4+的 透 出 较 快,膜 内 SCV一 剩 余 而 生 成 H2so欠 其 酸 度 足 以 使 蛋 白 质 变 性，因 此，除 盐 时 开 始 应 对 O.Umol-L-1的 NH4O H透 析。本 实 验 分 别 用 双 缩 胭 试 剂 和 Nessler试 剂 检 验 蛋 白 质 和 N H J的 存 在。仪 器 材 料 和 试 剂 药 品 仪 器 材 料：(1)离 心 管、试 管 及 试 管 架。(2)2 m l刻 度 吸 管、玻 璃 棒、小 烧 杯。(3)透 析 袋。(4)离 心 机。试 剂 药 品：(1)饱 和 硫 酸 镀 溶 液。(2)硫 酸 筱 粉 末。(3)双 缩 胭 试
3、 剂 称 取 CuSOr5H2。2.5 g,加 蒸 溜 水 少 许，微 热 溶 解 后 稀 释 至 100ml。另 取 酒 石 酸 钾 钠(NaKC4H4O6 H2O)10g和 KI 5 g,溶 于 500m l蒸 储 水 中，再 加 入 20%氢 氧 化 钠 3 0 0 m l,混 匀 后，慢 慢 加 入 硫 酸 铜 溶 液 中，加 蒸 储 水 至 1000ml。此 液 可 长 期 储 存。(4)Nessler试 剂 称 取 150g碘 化 钾 置 于 三 角 烧 瓶 中，加 蒸 储 水 100ml使 之 溶 解，再 加 入 110g碘，待 完 全 溶 解 后 加 140g 150g汞，用
4、力 振 摇 10分 钟 左 右，此 时 产 生 高 热，须 将 三 角 烧 瓶 放 入 水 中 继 续 摇 动，直 至 棕 红 色 的 碘 转 变 成 带 绿 色 的 碘 化 汞 钾 为 止。将 上 清 液 倾 入 2000ml容 量 瓶 中，并 用 蒸 储 水 洗 涤 瓶 内 的 沉 淀 数 次，将 洗 涤 液 一 并 倒 入 容 量 瓶 内，用 蒸 储 水 稀 释 至 刻 度，此 为 贮 存 液，储 于 棕 色 瓶 中 备 用。取 贮 存 液 1 5 0 m l,加 10%氢 氧 化 钠 7 0 0 m L混 匀 后 加 蒸 储 水 1 5 0 m l,混 匀，此 为 应 用 液，储 于
5、棕 色 瓶 中，如 混 浊 可 过 滤 或 静 止 数 天 后 取 上 清 液 使 用。本 试 剂 需 有 适 宜 的 p H值，调 节 至 用 1 mol/L盐 酸 20m l滴 定 时，需 本 试 剂 11.0ml 11.5ml时 为 宜。(5)血 清 样 本。实 验 内 容 1、取 2 m l血 清 加 入 离 心 管 中，再 加 入 2m l饱 和 硫 酸 锈 溶 液，用 玻 璃 棒 搅 匀，静 置 5 10分 钟 后，用 2000rpm离 心 5 分 钟，将 上 清 液 移 至 另 一 离 心 管 中，分 次 加 入 少 量 硫 酸 筱 粉 末，并 用 玻 璃 棒 搅 拌 至 有 少
6、 量 硫 酸 铁 不 再 溶 解 为 止，静 置 5 10分 钟 后，同 上 离 心，得 沉 淀 和 上 清 液。2、取 在 蒸 储 水 中 煮 沸 约 1 小 时 的 15mmX 60m m透 析 袋 一 条，一 端 打 结 后 检 查 是 否 漏 水，不 漏 则 将 水 倒 掉，加 入 用 3 m l蒸 储 水 溶 解 的 第 二 次 沉 淀 液，挂 于 盛 有 蒸 储 水 的 小 烧 杯 中，使 袋 内 外 的 液 面 处 于 同 一 水 平，透 析 约 3 0分 钟，每 隔 10分 钟 更 换 一 次 透 析 液。3、检 查 取 6 支 试 管，按 下 表 操 作。表 3-2-1试 剂
7、（滴）管 号 1 2 3 4 5 6袋 内 液 10 10 透 析 液 10 10 蒸 储 水 10饱 和 硫 酸 镂 一 10双 缩 胭 试 剂 1010 10Nessler 试 剂 1010 10混 匀 后 观 察 并 记 录 结 果。思 考 题 1、透 析 时 如 何 防 止 蛋 白 质 变 性？2、两 次 沉 淀 的 蛋 白 质 各 为 何 种 蛋 白 质？实 验 二 凝 胶 层 析 法 分 离 蛋 自 质 实 验 目 的 1、掌 握 凝 胶 层 析 法 分 离 蛋 白 质 的 原 理 和 方 法。2、了 解 核 酸-蛋 白 质 检 测 仪 和 部 分 收 集 器 的 工 作 原 理
8、和 使 用。实 验 原 理 凝 胶 层 析 法 主 要 是 根 据 混 合 物 中 各 种 分 子 的 分 子 量 不 同，通 过 固 定 相 凝 胶 时;分 子 的 扩 散 移 动 速 度 各 异 而 使 大 小 不 同 的 分 子 得 到 分 离 的 方 法。当 加 在 凝 胶 床 表 面 的 混 合 物 随 洗 脱 液 进 行 洗 脱 时，分 子 量 大 的 物 质 阻 滞 作 用 小，沿 凝 胶 颗 粒 的 间 隙 下 流，流 程 短、而 移 动 速 度 快,先 流 出 层 析 床，分 子 量 小 的 物 质 阻 滞 作 用 大，能 够 进 入 凝 胶 颗 粒 的 网 孔 内，流 程
9、长、而 移 动 速 度 慢，后 流 出 层 析 床。本 实 验 用 葡 聚 糖 凝 胶 G-75分 离 牛 血 清 清 蛋 白（分 子 量 67000）与 溶 菌 醐（分 子 量 13930）两 种 蛋 白 质，用 核 酸 一 蛋 白 质 检 测 仪 进 行 检 测 或 用 双 缩 胭 反 应 观 察 结 果。仪 器 材 料 和 试 剂 药 品 仪 器 材 料：（1）试 管 及 试 管 架。（2）层 析 柱 1.5 cm X 20cm的 玻 璃 管 柱。（3）大、小 烧 杯 和 玻 璃 棒、吸 管、滴 管、滤 纸。（4）部 分 收 集 器 和 核 酸 一 蛋 白 质 检 测 仪。试 剂 药 品
10、：（1）葡 聚 糖 凝 胶 G-75（商 品 名 为 Sephadex G-75）。（2）洗 脱 液 称 取 Tris 12.12g,KC1 1 5 g,先 用 少 量 蒸 储 水 溶 解，再 缓 缓 加 入 6.67ml浓 H C L 定 容 至 2 0 0 0 m L此 为 0.05 m容 L Tris-HCl缓 冲 液,其 p H值 为 7.5。（3）样 品 取 牛 血 清 清 蛋 白 和 溶 菌 酶 各 5.O m g,溶 于 1ml洗 脱 液 中。（4）10%NaOH 和 0.5%CuSC）4溶 液。实 验 内 容 1、葡 聚 糖 凝 胶 G-75的 制 备 取 适 量 葡 聚 糖
11、凝 胶 G-75加 入 0.05 mol-L-1 Tris-HCI缓 冲 液 中，充 分 混 匀 后，置 沸 水 浴 中 1小 时 或 室 温 下 5 小 时，使 其 充 分 溶 胀，倾 除 漂 浮 的 细 颗 粒，再 加 入 少 量 缓 冲 液，轻 轻 搅 动 后 倾 除 剩 余 的 细 颗 粒，备 用。2、装 柱 将 1.5cmX20cm的 玻 璃 管 柱 垂 直 固 定 于 铁 架 上，下 端 铺 垫 棉 花 或 玻 璃 棉，先 用 少 量 洗 脱 液 将 气 泡 赶 净，然 后 将 下 端 活 塞 关 闭，再 将 凝 胶 悬 液 倾 入 柱 中，同 时 微 启 活 塞，在 管 中 凝
12、胶 下 沉 的 同 时 继 续 加 入 凝 胶 悬 液，待 沉 至 约 15cm高 时，加 入 2 倍 柱 体 积 的 洗 脱 液 平 衡，然 后 在 柱 床 表 面 放 一 滤 纸 片，以 防 加 样 时 凝 胶 被 冲 起。注 意：在 装 柱 和 层 析 过 程 中，不 得 使 液 面 低 于 凝 胶 床 表 面，否 则，空 气 进 入 凝 胶 床 中 将 严 重 影 响 分 离 效 果。3、加 样 微 启 下 端 活 塞，使 柱 上 的 洗 脱 液 血 刚 好 下 降 到 凝 胶 床 表 面 时，关 紧 活 塞，用 滴 管 吸 取 待 分 离 的 样 品，缓 慢 地 加 到 凝 胶 床
13、表 面 匕 微 启 下 端 活 塞，使 样 品 进 入 凝 胶 床，关 闭 活 塞；再 按 同 样 方 式，反 复 加 入 少 量 洗 脱 液，以 洗 净 柱 内 壁 上 的 样 品 溶 液，然 后 加 入 适 量 的 洗 脱 液，约 高 出 床 表 面 3cm 5cm。4、洗 脱 用 洗 脱 液 连 续 洗 脱，流 速 为 25滴/分 钟。用 280nm紫 外 光 监 测，用 部 分 收 集 器 从 加 样 开 始 每 3 分 钟 收 集 1管 洗 脱 液，至 记 录 仪 出 现 二 个 峰 及 基 线 平 稳 后，停 止 洗 脱 并 关 机。5、双 缩 胭 反 应 观 察 结 果 每 个
14、收 集 管 加 入 10%NaOH 10滴，0.5%CuSC42滴，观 察 并 记 录 结 果。思 考 题 1、洗 脱 过 程 中 为 何 要 控 制 流 速？2、第 一 次 分 离 结 束 后，能 否 利 用 原 层 析 柱 继 续 进 行 分 离？为 什 么？实 验 三 血 清 球 蛋 白 的 分 离 提 纯 实 验 目 的 1、掌 握 盐 析 法 分 离 提 纯 大 球 蛋 白 的 原 理 与 方 法。2、了 解 凝 胶 层 析 法 脱 盐 的 原 理 和 操 作。3、熟 悉 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 的 基 本 原 理 和 过 程。实 验 原 理 分 离 和 纯 化 蛋 白 质
15、是 研 究 蛋 白 质 化 学 及 其 生 物 学 功 能 的 重 要 手 段。可 利 用 蛋 白 质 分 子 量、溶 解 度 和 在 一 定 p H 条 件 下 所 带 电 荷 不 同 等 性 质 的 差 异，而 分 离 和 纯 化，盐 析 法 就 是 常 用 的 方 法 之 一。向 蛋 白 质 溶 液 中 加 入 中 性 盐(如 硫 酸 镇)，使 溶 液 的 离 子 强 度 发 生 改 变，从 而 使 蛋 白 质 表 面 的 电 荷 被 大 量 中 和，水 化 膜 被 破 坏 而 沉 淀 析 出。由 于 蛋 白 质 的 性 质 不 同，故 盐 析 时 所 需 中 性 盐 的 饱 和 度 亦
16、 异，用 下 式 计 算 达 到 所 需 饱 和 度 时 应 如 入 饱 和 中 性 盐 溶 液 的 体 积：i o 一/(S,-52)式 中 和 夕 分 别 代 表 需 加 入 饱 和 中 性 盐 溶 液 的 体 积 和 待 盐 析 蛋 白 质 溶 液 的 体 积，S 和 52分 别 代 表 待 盐 析 蛋 白 质 溶 液 中 该 中 性 盐 的 原 饱 和 度 和 所 需 达 到 的 饱 和 度。盐 析 法 分 离 蛋 白 质 多 在 低 温 下 操 作，所 得 蛋 白 质 沉 淀 并 不 变 性，但 含 有 大 量 中 性 盐 分 子,可 用 凝 胶 层 析 法 脱 盐。由 于 中 性
17、盐 分 子 的 分 子 量 较 小，在 凝 胶 层 析 过 程 中 的 阻 滞 作 用 较 大，而 蛋 白 质 分 子 的 分 子 量 较 大，阻 滞 作 用 较 小，从 而 达 到 分 离(参 见 实 验 凝 胶 层 析 法 分 离 蛋 白 质)。本 实 验 采 用 中 性 盐 硫 酸 铁 进 行 盐 析 分 离 血 清 y球 蛋 白，用 葡 聚 糖 凝 胶 G-25进 行 脱 盐，用 双 缩 版 试 剂 和 Nessler试 剂 分 别 检 验 蛋 白 质 和 N H4+,最 后 用 醋 酸 纤 维 素 薄 膜 电 泳 迸 行 比 较 鉴 定。仪 器 材 料 和 试 剂 药 品 仪 器 材
18、 料：(1)离 心 管、试 管 及 试 管 架。(2)2ml刻 度 吸 管、玻 璃 棒、烧 杯。(3)层 析 柱：l.lcrnXl2cm玻 璃 管 柱 及 架。(4)滴 管、滤 纸、反 应 板。(5)离 心 机 和 全 套 电 泳 器 材。试 剂 药 品：(1)兔 血 清。(2)PBS(磷 酸 盐 生 理 盐 水 缓 冲 液)0.2 mo卜 L，pH 7.2的 磷 酸 缓 冲 溶 液 中 加 入 氯 化 钠 至 015 moi(3)葡 聚 糖 凝 胶 G-25(商 品 名 为 Sephadex G-25)。(4)pH7.2饱 和 硫 酸 镀 溶 液 用 氨 水 将 饱 和 硫 酸 铁 溶 液
19、调 到 pH7.2。(5)Nessler试 剂 称 取 150g碘 化 钾 置 于 三 角 烧 瓶 中，加 蒸 储 水 100 m l使 之 溶 解，再 加 入 110g碘，待 完 全 溶 解 后 加 140g 150g汞，用 力 振 摇 1 0分 钟 左 右，此 时 产 生 高 热，须 将 三 角 烧 瓶 放 入 水 中 继 续 摇 动，直 至 棕 红 色 的 碘 转 变 成 带 绿 色 的 碘 化 汞 钾 为 止。将 上 清 液 倾 入 2000ml容 量 瓶 中，并 用 蒸 储 水 洗 涤 瓶 内 的 沉 淀 数 次，将 洗 涤 液 一 并 倒 入 容 量 瓶 内，用 蒸 储 水 稀 释
20、 至 刻 度 此 为 贮 存 液，储 于 棕 色 瓶 中 备 用。取 贮 存 液 1 5 0 m l,加 10%氢 氧 化 钠 7 0 0 m L混 匀 后 加 蒸 储 水 1 5 0 m l,混 匀,此 为 应 用 液，储 于 棕 色 瓶 中，如 混 浊 可 过 滤 或 静 止 数 天 后 取 上 清 液 使 用。本 试 剂 需 有 适 宜 的 p H值，调 节 至 用 1 mol-L-1盐 酸 20m l滴 定 时，需 本 试 剂 H.0ml 11.5m l时 为 宜。(6)双 缩 胭 试 剂 称 取 CUSO46H2O 2.5 g,加 蒸 溜 水 少 许，微 热 溶 解 后 稀 释 至
21、100mL另 取 酒 石 酸 钾 钠(NaKC4H4CVH2O)10g和 K 1 5 g,溶 于 500ml蒸 储 水 中，再 加 20%氢 氧 化 钠 3 0 0 m l,混 匀 后，慢 慢 加 入 硫 酸 铜 溶 液 申，加 蒸 储 水 至 1000ml。此 液 可 长 期 储 存。(7)电 泳 缓 冲 液、染 色 液 和 漂 洗 液：同 蛋 白 质 醋 酸 纤 维 素 薄 膜 电 泳 定 量 测 定 实 验。实 验 内 容 1、盐 析(1)取 1支 刻 度 离 心 管，加 入 2.0m l血 清，再 加 入 2.0ml P B S,混 匀 后 滴 加(边 加 边 摇)2.0 m l饱 和
22、 硫 酸 镂 溶 液，混 匀 后 于 室 温 下 静 置 10分 钟，以 3000rpm离 心 10分 钟，弃 上 清。(2)向 沉 淀 中 加 入 P B S,使 其 溶 解 并 加 至 1.0ml,再 滴 加(边 加 边 摇)0.5m l饱 和 硫 酸 镀 溶 液，混 匀 后 于 室 温 下 静 置 1 0分 钟，同 上 离 心，弃 去 上 清。重 复 本 操 作 2 3次，沉 淀 物 为 初 步 纯 化 的 y球 蛋 白。2、脱 盐(1)装 柱：称 取 2.5g葡 聚 糖 凝 胶 G-2 5,倒 入 100ml烧 杯 中，加 蒸 储 水 50mL充 分 混 匀 后，置 沸 水 浴 中 1
23、小 时 或 室 温 下 5 小 时，使 其 充 分 溶 胀，静 置 冷 却 后 倾 弃 上 清 液，再 加 入 P B S lO m l,用 玻 璃 棒 轻 轻 搅 拌，将 L lc m X 1 2 cm的 璃 管 柱 垂 直 固 定 于 铁 架 上，下 端 铺 垫 棉 花 或 玻 璃 棉，先 用 少 量 洗 脱 液 将 气 泡 赶 净，然 后 将 下 端 活 塞 关 闭，再 将 溶 胀 后 的 葡 聚 糖 凝 胶 G-25悬 液 倾 入 柱 中，同 时 微 启 活 塞，在 管 中 凝 胶 下 沉 的 同 时 继 续 加 入 凝 胶 悬 液，待 全 部 凝 胶 倾 入 柱 内，且 液 面 接
24、近 凝 胶 面 时，关 闭 下 端 活 塞。为 使 凝 胶 面 平 坦，可 用 手 指 轻 轻 弹 动 层 析 柱，然 后 小 心 开 启 下 端 活 塞，以 10滴-minT的 速 度 用 2 倍 柱 体 积 的 洗 脱 液 平 衡，当 液 面 恰 好 与 凝 胶 面 重 合 时，立 即 关 闭 活 塞，然 后 在 柱 床 表 面 放 一 滤 纸 片，以 防 加 样 时 凝 胶 被 冲 起。注 意：在 装 柱 和 层 析 过 程 中，不 得 使 液 面 低 于 凝 胶 床 表 面，否 则，空 气 进 入 凝 胶 床 中 将 严 重 影 响 分 离 效 果。(2)脱 盐 向 盛 有 y 球 蛋
25、 白 的 离 心 管 内 加 入 1 0滴 P B S液，并 用 玻 璃 棒 轻 轻 搅 拌 使 其 全 部 溶 解，再 用 乳 头 吸 管 吸 取 y球 蛋 白 液，小 心 地 加 到 凝 胶 床 表 面 上，使 之 缓 缓 滴 入，微 启 下 端 活 塞，使 流 速 为 4 5 滴-min”,待 样 品 全 部 缓 慢 地 进 入 凝 胶 床，关 闭 活 塞。再 按 同 样 方 式，反 复 加 入 少 量 PB S液，以 洗 净 柱 内 璧 上 的 样 品 溶 液，然 后 加 入 适 量 的 P B S液，约 高 出 床 表 面 3cm 5cm,进 行 连 续 洗 脱。(3)收 集 用 1
26、2支 小 试 管 收 集 洗 脱 液，每 收 集 1m l更 换 试 管，直 到 12支 管 都 收 集 完,关 闭 活 塞。(4)检 测 准 备 反 应 板 两 块，取 每 支 试 管 内 的 洗 脱 液，分 别 加 在 两 块 反 应 板 的 各 对 应凹 内 一 滴，再 向 一 反 应 板 各 凹 加 双 缩 腺 试 剂 一 滴,向 另 一 反 应 板 各 凹 加 Nessler试 剂 一 滴，记 录 各 凹 颜 色 变 化，以“一”或“+”表 示 不 呈 色 或 呈 色 深 浅。3、电 泳 将 双 缩 胭 反 应 呈 色 最 深 一 管 中 的 洗 脱 液 作 为 样 品，与 血 清
27、作 对 照，按 血 清 蛋 白 质 醋 酸 纤 维 素 膜 电 泳 定 量 测 定 实 验 中 的 操 作，进 行 电 泳，呈 色 后 迸 行 判 断。思 考 题 1、盐 析 过 程 中 各 上 清 和 沉 淀 中 主 要 含 何 种 蛋 白 质？2、盐 析 中 所 达 到 的 硫 酸 钱 饱 和 度 各 是 多 少？3、脱 盐 过 程 中，物 质 洗 脱 出 来 的 顺 序 如 何？为 什 么？实 验 四 酶 作 用 的 特 异 性 和 影 晌 酶 促 反 应 速 度 的 因 素 实 验 目 的 1、了 解 酶 的 催 化 特 异 性。2、了 解 温 度、pH、激 动 剂 和 抑 制 剂 对
28、 酶 促 反 应 速 度 的 影 响。实 验 原 理 作 为 生 物 催 化 剂 的 酶，具 有 高 度 的 特 异 性，如 唾 液 淀 粉 酶 只 能 催 化 水 解 a-1,4 葡 萄 糖 背 键，而 不 能 水 解 a-毗 喃 葡 萄 糖-1,2-供 灰 喃 果 糖 背 键，故 只 能 水 解 淀 粉 而 不 能 水 解 蔗 糖。淀 粉 和 蔗 糖 均 无 还 原 性，对 班 氏 试 剂 呈 阴 性 反 应；而 它 们 水 解 后 的 产 物 则 为 还 原 糖，与 班 氏 试 剂 共 热 时 可 产 生 红 棕 色 的 氧 化 亚 铜 沉 淀，据 此 可 检 验 它 们 有 无 水 解
29、。酶 促 反 应 速 度 受 许 多 因 素 的 影 响，如 温 度、pH、激 动 剂 和 抑 制 剂 等。上 述 诸 因 素 对 唾 液 淀 粉 醐 催 化 淀 粉 水 解 反 应 速 度 的 影 响，可 用 定 性 或 定 量 反 应 来 观 察。利 用 碘 与 淀 粉 及 其 不 同 程 度 水 解 产 物 反 应 的 颜 色，来 衡 量 酶 促 反 应 的 速 度，即 淀 粉（蓝 色）一 紫 色 糊 精（紫 色）红 色 糊 精（红 色）一 麦 芽 糖 及 少 量 葡 萄 糖（黄 色），颜 色 由 蓝 变 黄，表 示 能 促 反 应 速 度 由 低 到 高，此 为 定 性 观 察；亦 可
30、 利 用 夏 弗 尔 哈 德 曼 试 剂 测 定 淀 粉 水 解 物 中 还 原 糖 含 量，来 定 量 观 察 酶 促 反 应 的 速 度。夏 弗 尔-哈 德 曼 试 剂 中 含 有 硫 酸 铜、碘 酸 钾 和 草 酸 钾，在 碳 酸 氢 钠 和 碳 酸 钠 所 构 成 的 碱 性 环 境 中 加 热，还 原 糖 可 使 硫 酸 铜 中 的 Cu2+还 原 成 C/；当 加 入 硫 酸 后，试 剂 中 碘 化 钾 所 含 的 碘 离 子 被 碘 酸 氧 化 为 自 由 单 质 碘；而 b 可 将 生 成 Ci?的 氧 化 成 Cu2+,后 者 被 试 剂 中 的 草 酸 钾 络 合，从 而
31、使 上 述 反 应 不 能 逆 行，剩 余 的 碘 可 用 标 准 硫 代 硫 酸 钠 溶 液 滴 定；按 同 样 方 法 作 空 白 滴 定，所 消 耗 硫 代 硫 酸 钠 量 代 表 溶 液 中 总 碘 量。空 白 滴 定 时 与 有 还 原 糖 存 在 滴 定 时 所 消 耗 的 硫 代 硫 酸 钠 之 差，代 表 氧 化 C d+所 消 耗 b 的 量，亦 即 相 当 于 被 糖 还 原 生 成 的 Cu.数 量，此 C/的 量 与 还 原 糖 的 量 呈 正 比，故 滴 定 数 据 的 差 数 可 以 定 量 地 代 表 还 原 糖 的 数 量。反 应 如 下：Cu2+-Cu+r+i
32、o.r+H+一 七+E。+ci?+-草 酸 钾 络 合 iNa2s2O2+1 2-N al+N a2s4O6仪 器 材 料 和 试 剂 药 品 仪 器 材 料：（1）试 管 及 试 管 架 和 烧 杯。（2）1ml、2ml、5ml刻 度 吸 管 及 滴 定 管。（3）沸 水 浴、恒 温 水 浴 器。试 剂 药 品：(1)1%淀 粉 溶 液 和 1%蔗 糖 溶 液。(2)14 mo 1 L“氯 化 钠 溶 液。(3)磷 酸 盐 缓 冲 溶 液:pH5.8、pH6.2、pH6.6、pH7.0、pH7.4(参 见 附 录 七)(4)夏 弗 尔-哈 德 曼 试 剂：取 结 晶 硫 酸 铜 6.5 g,
33、溶 于 100ml蒸 储 水 中，为 甲 液。取 酒 石 酸 钾 钠 12g、无 水 碳 酸 钠 20g、碳 酸 氢 钠 25g溶 于 500ml蒸 储 水 中，为 乙 液。取 碘 化 钾 10g、碘 酸 钾 0.8g、草 酸 钾 18g溶 于(2 0 0-3 0 0)m l蒸 储 水 中，为 丙 液。将 乙 液 加 入 甲 液 中 混 匀 后，再 将 其 加 入 丙 液 中，混 匀 后 稀 释 至 1000ml。(5)14 mol!?硫 酸：取 蒸 储 水 约 2 5 0 m l,置 于 1000ml容 量 瓶 内，缓 缓 加 入 比 重 1.84的 浓 硫 酸 2 8 m L随 加 随 摇
34、，混 匀 后 定 容 至 1000ml。(6)0.0054 m o H?硫 代 硫 酸 钠 溶 液：取 硫 代 硫 酸 钠(Na2S2O3-5H2O)约 2 5 g,溶 于 已 沸 过 的 蒸 储 水 中，稀 释 至 1000ml。此 溶 液 浓 度 约 为 0.1 4 mokL，其 准 确 浓 度 用 下 述 方 法 标 定。用 分 析 天 平 准 确 称 取 碘 酸 钾(0.15-0.18)g,溶 于 5 0 m l蒸 储 水 中，加 入 15%碘 化 钾 10ml及 64 mol-L-1硫 酸 1 0 m l,放 置 3 分 钟 后 稀 释 至 150ml.用 以 上 配 制 的 硫 代
35、 硫 酸 钠 溶 液 滴 定 至 溶 液 呈 黄 色 时.，加 1%淀 粉 溶 液 5m l作 指 示 剂，继 续 滴 定 至 蓝 色 完 全 退 去，即 为 终 点，记 录 所 用 硫 代 硫 酸 钠 溶 液 的 体 积。用 15%碘 化 钾 溶 液 10m l作 一 空 白 滴 定，用 此 结 果 校 正 上 述 滴 定 的 结 果。用 下 列 公 式 计 算 所 配 制 硫 代 硫 酸 钠 溶 液 的 浓 度，并 将 其 浓 度 调 整 至 0.14 mo卜 L L硫 代 硫 酸 钠 的 标 定 浓 度(4m ol-L1)=碘 酸 钾 的 克 数/所 用 硫 代 硫 酸 钠 毫 升 数/
36、碘 酸 钾 分 子 量/6000o用 前 取 凋 整 好 的 标 准 0.14 mol-L 硫 代 硫 酸 钠 溶 液 5 0 m l,稀 释 至 1000m l,即 为 硫 代 硫 酸 钠 应 用 液，其 浓 度 为 0.0054m oH;1(7)碘 液：称 取 碘 1 g,碘 酸 钾 2 g,溶 于 300m l蒸 得 水 中。实 验 内 容 1、酶 作 用 的 特 异 性(1)稀 释 唾 液：实 验 者 先 用 水 漱 口，然 后 含 一 口 蒸 储 水 于 口 中，2 分 钟 后 吐 入 小 烧 杯 内，用 滤 纸 过 滤 后，取 滤 液 1ml加 蒸 储 水 稀 释 至 5 0 m
37、L混 匀。(2)取 3 支 试 管，按 下 表 操 作 表 3-2-2试 剂 管 号(滴)1 2 31%淀 粉 溶 液 10 101%蔗 糖 溶 液 10稀 释 唾 液 5（煮 沸 10）5 5混 匀 后 置 38 恒 温 水 浴 中 3 0分 钟。(3)取 出 各 管，各 加 入 煮 沸 的 班 氏 试 剂 约 2 m L 煮 沸 2 分 钟，放 试 管 架 上 冷 却，观 察 并 己 录 结 果，解 释 之。2、定 量 观 察 温 度、pH、激 动 剂 和 抑 制 剂 对 酶 促 反 应 速 度 的 影 响(1)稀 释 唾 液：同 上。(2)取 12支 试 管，按 下 表 操 作。表 3-
38、2-3管 号 试 剂-0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11%淀 粉 溶 液 ml 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4氯 化 钠 溶 液 ml 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2(CuSO4)2 m l缓 冲 溶 液 pH 6.6 5.8 6.2 6.6 7.0 7.4 6.6 6.6 6.6 6.6 6.6 6.6蒸 镭 水 ml 3 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5保 温 10分 钟 38 38 38 38 38 38 38 38 38 38 38 38稀 释 唾 液 ml0.5 0.5 0.5 0.
39、5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5(3)充 分 混 匀 后，各 管 在 原 温 度 下 继 续 保 温 2 0分 钟。(4)在 保 温 期 间，另 取 12支 试 管 同 样 标 号，各 加 入 2 m l夏 弗 尔-哈 德 曼 试 剂，保 温 达 2 0分 钟 时，立 即 由 各 管 吸 取 2 m l分 别 加 入 上 述 相 应 号 码 的 试 管 中，混 匀 后 向 各 管 加 入 液 体 石 蜡 5 滴 置 沸 水 浴 中 15分 钟，取 出 后 冷 却 至 室 温，此 过 程 均 勿 摇 动。(5)向 各 管 中 加 入 14 m o i 硫 酸 2 m l
40、,轻 摇 至 不 产 生 气 泡 为 止，此 时，管 内 液 体 应 为 蓝 色。若 不 呈 蓝 色，需 加 入 淀 粉 溶 液 2 3 滴 作 为 指 示 剂。(6)经 2 分 钟 后，以 0.0054 m o H/硫 代 硫 酸 钠 滴 定 各 管 至 液 体 蓝 色 刚 刚 消 退 为 止。(7)滴 定 空 白 管 与 滴 定 各 管 所 消 耗 硫 代 硫 酸 钠 溶 液 之 差，即 相 当 于 各 管 的 还 原 糖 所 还 原 铜 的 数 量。以 此 差 值 为 纵 坐 标，温 度 和 p H 为 横 坐 标，分 别 绘 制 温 度 和 p H对 酶 促 反 应 速 度 影 响 的
41、 曲 线 图 及 激 动 剂 和 抑 制 剂 对 酶 促 反 应 速 度 的 影 响。3、定 性 观 察 温 度、pH、激 动 剂 和 抑 制 剂 对 酶 促 反 应 速 度 的 影 响。(1)稀 释 唾 液：同 上。(2)取 12支 试 管，按 下 表 操 作。表 3 2 4试 剂 管 号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11%淀 粉 溶 液 ml 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4氯 化 钠 溶 液 ml 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2(CuSO4)2 m l缓 冲 溶 液 pH 6.6 5.8 6.2 6.6 7.0 7.4 6.6 6.6 6.
42、6 6.6 6.6 6.6蒸 镭 水 ml 3 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5保 温 10分 钟 38 38 38 38 38 38 38 38 38 38 38 38稀 释 唾 液 ml一 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5(3)充 分 混 匀 后，各 管 在 原 温 度 下 继 续 保 温 2 0分 钟。(4)将 各 管 取 出，分 别 滴 加 碘 液 1滴，混 匀 后 观 察 比 较 各 管 的 颜 色 并 记 录。思 考 题 1、实 验 中 哪 些 条 件 必 须 准 确 一 致
43、？在 实 际 操 作 中 应 注 意 哪 些 事 项？2、影 响 酶 促 反 应 速 度 的 主 要 因 素 有 哪 些？实 验 五 琥 珀 酸 脱 氢 酶 的 作 用 及 丙 二 酸 的 竞 争 性 抑 制 作 用实 验 目 的 了 解 在 无 氧 情 况 下 观 察 脱 氢 酶 作 用 的 简 单 方 法 和 的 的 竞 争 性 抑 制 作 用。实 验 原 理 琥 珀 酸 脱 氢 酶 能 催 化 琥 珀 酸 脱 氢 生 成 延 胡 索 酸，而 与 琥 珀 酸 的 化 学 结 构 相 似 的 丙 二 酸，能 与 琥 珀 酸 竞 争 酶 分 子 的 活 性 中 心，并 与 之 结 合，从 而
44、抑 制 酶 的 活 性，升 高 其 K m值，抑 制 程 度 取 决 于 琥 珀 酸 和 丙 二 酸 两 者 的 浓 度 比。本 实 验 在 隔 绝 空 气 的 条 件 下，利 用 甲 烯 蓝 接 受 氢 后 退 色 的 程 度，来 判 断 肌 肉 组 织 中 琥 珀 酸 脱 氢 能 的 作 用 和 丙 二 酸 对 酶 活 性 的 抑 制。仪 器 材 料 和 试 剂 药 品 仪 器 材 料：(1)试 管 及 试 管 架。(2)烧 杯、乳 钵、剪 刀、镶 子、纱 布。(3)上 皿 天 平、恒 温 水 浴。(4)石 英 砂、冰 块。试 剂 药 品：(1)0.24 mol L 和 0.024 mo卜
45、 L 琥 珀 酸 溶 液。(2)0.24 mol-L1 和 0.024 mol-L-1 丙 二 酸 溶 液。以 上 四 种 溶 液 均 先 用 0.054 mol-L-1氢 氧 化 钠 溶 液 调 节 至 p H 7.0,再 用 0.014 mol-L-1氢 氧 化 钠 溶 液 调 节 到 pH7.4,然 后 用 蒸 储 水 稀 释 到 所 需 浓 度。(3)0.14m ol-lJpH 7.4磷 酸 盐 缓 冲 溶 液。(4)0.02%甲 烯 蓝 溶 液。(5)液 体 石 蜡。实 验 内 容 1、肌 肉 提 取 液 的 制 备 称 取 新 鲜 肌 肉 组 织 1 0 g,剪 成 小 碎 块，放
46、 入 烧 杯 中，用 冰 冷 的 生 理 盐 水 洗 3 次，再 用 0.14 mol-L pH 7.4的 磷 酸 盐 缓 冲 液 洗 涤 1 次，弃 去 液 体，移 入 置 于 冰 块 中 的 乳 钵 内，加 适 量 的 石 英 砂，研 磨 成 糜 状，然 后 加 入 20m l冰 冷 的 上 述 缓 冲 液，混 匀 后 用 双 层 纱 布 过 滤，滤 液 置 冰 浴 中 备 用。2、取 5 支 试 管，按 下 表 操 作。表 3 2 5试 剂(m l)管 号 1 2 3 4 5肌 肉 提 取 液 30 30 30 300.24 mol-L-1 琉 珀 酸 10 10 10100.024 m
47、 olTL 琥 珀 酸 100.24 mol-L-1 丙 二 酸 10 100.024 mol-L1 丙 二 酸 一 10 蒸 储 水 10 40甲 烯 蓝 4 4 4 4 43、将 各 管 摇 匀，每 管 滴 加(斜 执 试 管，沿 管 壁 缓 缓 加 入)一 层 液 体 石 蜡 于 溶 液 上，以 隔 绝 空 气。然 后 置 37 水 浴 中 保 温，随 时 比 较 记 录 各 管 中 甲 烯 蓝 的 退 色 情 况。思 考 题 1、为 什 么 实 验 中 要 用 液 体 石 蜡 隔 绝 空 气？2、丙 二 酸 对 琥 珀 酸 脱 氢 酶 的 活 性 有 何 影 响？实 验 六 酮 体 的
48、 生 成 和 氧 化 实 验 目 的 1、了 解 酮 粉 法 测 定 酮 体 的 原 理 和 操 作。2、验 证 酮 体 生 成 和 氧 化 的 部 位。实 验 原 理 脂 肪 酸 在 肝 脏 中 经 氧 化 生 成 的 乙 酰 C o A,经 缩 合 可 生 成 乙 酰 乙 酸，然 后 进 一 步 还 原 成-羟 丁 酸 或 脱 竣 生 成 丙 酮。乙 酰 乙 酸、羟 丁 酸 和 丙 酮 统 称 酮 体。主 要 在 肝 脏 产 生，被 脑 和 肌 肉 组 织 利 用。乙 酰 乙 酸 及 丙 酮 在 碱 性 条 件 下 与 亚 硝 基 铁 氟 化 钠 NazFe(NO)(CN)51 反 应，生
49、 成 紫 色 化 合 物，该 法 对 乙 酰 乙 酸 的 反 应 比 对 丙 酮 灵 敏 15 2 0倍。本 实 验 以 辛 酸 钾 为 底 物，分 别 与 肝 组 织、肌 肉 组 织 和 肝 与 肌 肉 组 织 的 混 合 物 在 一 起 保 温,然 后 用 酮 粉 法 分 别 测 定 其 酮 体。仪 器 材 料 和 试 剂 药 品 仪 器 材 料-：(1)试 管 及 试 管 架。(2)手 术 剪、表 面 皿、滤 纸、滴 管。(3)0.5ml、1ml、5ml 刻 度 吸 管。(4)恒 温 水 浴 器。试 剂 药 品：(1)0.154 mo1-L”氯 化 钠 溶 液。(2)0.14mol-L磷
50、 酸 盐 缓 冲 溶 液:pH7.4,(3)辛 酸 钾 溶 液 取 14 mol L-1氢 氧 化 钾 溶 液 10ml加 入 100ml容 量 瓶 中，然 后 再 加 入 幸 酸 1.5 8 m l,使 其 充 分 混 匀，加 蒸 镭 水 5 0 m l,再 加 上 述 缓 冲 液 至 刻 度，混 匀，即 为 贮 备 液(0.14 mol-L-1)。临 用 时 将 此 贮 备 液 用 上 述 缓 冲 液 稀 释 为 0.0024 mol-L1.(4)10%三 氯 乙 酸 溶 液。(5)酮 粉 称 取 亚 硝 基 铁 氟 化 钠 1 g,无 水 碳 酸 钠 2 0 g和 干 燥 硫 酸 镂 2