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1、碳源及碳氮比对异养反硝化微生物异养反硝化作用的影响碳源及碳氮比对异养反硝化微生物异养反硝化作用的影响农村生态环境2005, 21 (2) :4245RuralEcoEnvironment碳源及碳氮比对异 养反硝化微生物异养反硝化作用的影响傅利剑,郭丹钊,史春龙,黄为一(南京农业高校生命科学学院微生物学系/农业部农业环境微生物工程重点开放试验室，江苏南京210095)摘要:碳源(甘油和柠檬酸钠)及碳氮比对纯培育的异养反硝化菌HP1 (Pseudomono, salcaligenes)异养反硝化力量影响的试验表明,碳源种类对硝酸还原酶活性没有明显影响,对氧化亚氮还原酶 活性有影响.批式培育方式下最
2、适C/N为8,菌株HP1可以采用NO;作为唯一氮源进行反硝化作用，证明HP1至少有2种硝酸还原途径.连续培育方式下温度对菌株HP1异养反硝化作用中间产物的积累有影响，不同C/N时均有NH积累,C/N为3时还有N0;的积累.关键词:异养反硝化微生物;反硝化作用；碳源;C/N中图分类号:X172;Q935文献标识码:A文章编号：10015906(2005)02004204 E岱ectofcarbonsourceandC/Nratioonheterotrophicdenitrificationofpureculture. F A On, GUODan一zhao,巩建华,柯尊伟,李季.河北省藁城市蔬菜
3、种植区化肥施用与地下水硝酸盐污染争论J.农村生态环境,2004, 20(1):5659KesserOP, Kissi, BihariZ, etal. Biologicaldenitrificationinacontinuous?flowpilotbioreactorcontainingimmobilizedPseudo一 ilPlbasbutanovoracellsJ. BioresourceTechnol, 2003, 87(1) : 7580 BaumannB, vanderMeerJR, SnozziM, etal. Inhibitionofdenitri.ficationactivit
4、ybutnotofmRNAinductioninParacoccudenitrifi?cansbynitriteatasuboptimalpHJ. AntonievanLeeuwenhoek, 1997, 72(3) :183 189BaumannB, SnozziM, ZehnderAJB, etal. Dynamicsofdenitrifi一 cationactivityofParacoccudenitrifieansincontinuousculturedur?ingaerobicanaerobicchangesJ. JBact, 1996, 178(15):43674374史春龙.富养
5、分化湖泊底泥中反硝化微生物及其反硝化作用D.南京:南京农业高校,2002:4243格哈特.一般细菌学方法手册M.厦门高校生物学系微生物争论室译.厦门：厦门高校出版社，1989:625626李军,杨秀山，彭永臻.微生物与水处理M.北京:化学工业出版社，2002:378380SamuelsonM. Dissimilatorynitratereductiontonitrite,nitrousox一ide, andammoniumbyPseudomonasputrefaz，iensJ. ApplEnvironMicrobiol, 1985, 50(4) :812815作者简介:傅利剑（1979 ），男
6、,湖北武汉人,硕士生,主要从事富养分化湖泊，地下水中硝态氮的生物去除方面的研究.(上接第41页)SoilEcol, 1998, 10(3) :2392517FerrisH, VenetteRC, ScowKM. SoiImanagementtoenhancebae-terivoreandfungivorenematodepopulationsandtheirnitrogenmineralisationfunctionJ. ApplSoilEcol, 2004, 25(1):19一358BerkelmansR, FerrisH,TenutaM. Effectsoflong?termcropman
7、?agementonnematodetrophiclevelsotherthanplantfeedersdisap一pearafterlyearofdisruptivesoiImanagementJApplSoilEcol, 2003, 23(3) : 223, 2359BongersT, vanderMeulenH, KorthalsG. Inverserelationshipbe?tweenthenematodematurityindexandplantparasiteindexunderenrichednutrientconditionsJ. ApplSoilEcol, 1997, 6(
8、2) : 19519910张荣祖，陈鹏,杨明宪,等.长白山北坡森林生态系统土壤动物初步调查J.森林生态系统争论，1980(1) : 133152殷秀琴,王海霞,周道玮.松嫩草原区不同农业生态系统土壤动物群落特征J.生态,2003, 23 (6) : 10711078ImazA, HernfndezMA, ArifioAH, etalDiversityofsoiInema一todesacrossaMediterraneanecotoneJ. ApplSoilEcol, 2002,20 (3):191一198岳天祥.生物多样性争论及其问题J生态,2001, 21 (3):462467郑师章，吴干红
9、,王海波,等.一般生态学M,上海:复旦高校出版社，1994:160作者简介:吴东辉（1971 ），男，黑龙江望奎人，博士生,主 要从事土壤动物生态 学争论.?纠rl_ _【sHIChun1 ongHUANGWe i 一yiODepartmentofMicrobiology, CollegeofLifeSciences, NanjingAgriculturalUni versity/KeyLaboratoryofMicrobiologicalEngineeringofAgriculturalEnvironment, Mini stryofAgriculture, Nanjing210095, C
10、hina). RuralEcoEnvironment, 20HD5, 21(2):4245Abstract:StrainHPIwasisolatedfromsedimentandidentifiedasPseudomonasa Icaligenes.Atestwascarriedouttode一termineeffectsofcarbonsourceandC/NratioondenitrificationofpurecultureResultsshowthatcarbonsourcehadlittleeffectonnitratereductaseactivity, butobviouseff
11、ectonnitrousoxidereductaseactivity, TheoptimalC/Nratiowas8inbatchdenitrificationtests, andwithC/Nratiosbeing<8or>8, theN20co ncentrationwaslowerundertheconditionofa一cetyleneinhibitionThestudyshowthatStrainHPlcouldgrowwithnitrateasitssolenitrogensource. ItWasconfirmedthatnitratewaspartlyconsume
12、dasnitrogensourcewhendenitrificationwascarriedout, andStrainHPIhadtwokindsofnitratereductaseatleast. Therewerealotofintermediatesaccumulatedincontinuous cu1tureat differentC/Nrat io. suchasni一nitriteaccumulatedatC/Nratioof20, Theobjectiveofthepresentstudywastop rovidemethodsforsubsequentresearch,Key
13、words:heterotrophicdenitrifier;denitrification;carbonsource;C/Nra tio反硝化作用是地球氮循环过程中一个重要的生物过程.它是在厌氧条件下,反硝化微生物采用氮氧化物作为电子受体,最终转化成氮气的生物过程J.由于这个生物学性质,反硝化作用在富养分化湖？白防治,高硝酸盐含量地下水治理和工业废水处理中已受到越来越多的重视,.对某一特定的菌株而言,进行完整的反硝化作用是特别简单的过程,包括一系列的还原反应和电子传递,受很多环境因素的影响,诸如0,温度，pH值,碳源（同时为异养反硝化微生物的电子供体），C/N（指碳源碳与硝态氮的摩尔比值,全
14、文相同）等.各因素对微生物反硝化作用的影响是从不同方面体现出来的，有的影响 酶的合成，有的影响酶的活性J.影响结果可从中间产物或终产物的形 态,数量以 及酶的合成状况上表现出来.目前，国内对纯培育反硝化微生物的争论较少,本文争 论了异养反硝化微生物的代谢特征，为高硝酸盐含量地下水的治理供应科学依据.1材料与方法1.1 试验菌种菌株HP1 （Pseudomonasalcal igenes）,系南京农 业高校/农业部农业环境微生物 工程重点开放试验室分别自富养分化湖泊底泥.基金项目：上海市科技兴农重点攻关项目（农科攻字98第052号）收稿日期：20040622?通讯联系人第2期傅利剑等:碳源及碳氮
15、比对异养反硝化微生物异养反硝化作用的影响43 L2培育基1.2 . 1碳源测试培育基以Gihay培育基？中除碳源以外的其他成分作为基础培育基加入待测碳源（甘 油或柠檬酸钠），最终碳浓度为50mol?L,.配制厌氧培育基时1L培育基中加入 ImLl. 0g?L的刃天青指示剂和0. 3g半胱氨酸,在氮气爱护下配制并分装到Hun. gate试管中.凡厌氧培育基，皆按此方法配制. 1. 2. 2碳氮比测试培育基批式培育测定：以甘油为碳源,设定甘油一 C与N03- N的比值（摩尔比）分别 为 3:1, 6:1, 8:1, 10:1,20:1和50:1.连续培育测定：以柠檬酸钠为碳源，设定柠檬酸钠一 C与
16、N03N 的比值（摩尔比）分别为3:1,20:1.流加培育基和批式培育基成分相同.NO;为氮源 培育液:Giltay培育基中不加天冬酰胺，其他成分相同.1.3 试验设计柠檬酸钠是分别菌株HP1所选用的碳源,对菌株HP1进行碳源种类试验时,甘 油处理组是所选碳源中反硝化作用最强的，所以在碳源测试中选用甘油和柠檬酸 钠2种碳源.按上述要求配制好培育 基后接人活化菌株HP1,在25?下培育,定时取 样 测定N03N,NO;-N,NH4+-N,加乙快和不加乙快时 的N0.为测试碳源种类对氧化 亚氮还原酶活性的 影响，分别设置了加乙快和不加乙快处理组.它的原理是溶解于 溶液中的乙烘可抑制氧化亚氮还原 酶
17、，使反应产生的中间产物N0积累而不被进一 步 还原为N,对参加反硝化作用的其他酶没有影 响.通过比较2种处理N0的产量 可以得出氧 化亚氮还原酶的活性.C/N试验分别在批式和连？蛭C续培育条件下进行.批式培育选用甘油为碳源,而 连续培育选用柠檬酸钠为碳 源，这是由于用甘油配制Giltay培育基易产生沉淀,不利于连续培育的操作.1.4 方法恒化器的运行:稀释速率0. 045h,反应器置 于设定温度下培育.NO;测定采纳 Cu.Cd柱还原 法,N0;测定采纳苯磺酸-盐酸一 N-1.蔡乙二氨比色 法,NH;测定采 纳纳氏试剂比色法J. N, 0测定采用气相色谱法J,生物量的测定:发酵液5mL, 10
18、000r?min离心lOmin.取沉淀于105?下烘至恒重，以未接菌的空白培育基作对比. 2结果与争论2.1碳源对菌株HP1异养反硝化作用的影响碳源对菌株HP1异养反硝化作用的 影响见图1.由图1可知,HP1采用柠檬酸钠或甘油为碳源，在检测时间段内均有肯 定量的N03-残留，变化范围在3.92, 5.08mg?L,.N02积累量也无明显区别，变化趋 势全都.以柠檬酸钠为碳源时,N0;平均值为3. 92mg?L,以甘油为碳源时则为4. 30 mg?L,. 2种碳源条件下,NH4+的积累呈现明显不同的变化趋势,N0浓度的变化也有 较大差别.在不加乙快抑制时，柠檬酸钠试验组检测不到N,0,甘油试验组
19、在12h 为0.为g?L,随后开头下降，到18h为0. 13mg?L,.加乙快抑制时,2处理组N0浓度 在前13h均呈提升趋势;在随后的时间内，柠檬酸钠试验组开头下降，到15h趋于平 稳，N0浓度为14. 5mg?L,.甘油试验组则始终呈 提升趋势，到18hN0浓度达 24mg?L,. 5 6 7 t/ht/h十加乙快N20; +不加乙快N20;卜镂态氮;一矗一硝态氮;一*一亚硝态氮图1碳源对菌株HP1异养反硝化作用的影响g),越蛭ezFig. lEffectofcarbonsourceOndenitrificationofStrain 册U一_?E),越蛭)z一一一？g),趟蛭+zz?加mO
20、 g),越蛭1)z一 n?量)，越蛭e乙一,月g),蛰蛭+ lz?柏?加mO?加mO农村生态环境第21卷上述结果表明,碳源种类对硝酸还原酶没有明显影响，但对氧化亚氮还原酶有 影响.甘油为碳源 时氧化亚氮还原酶活性在试验开头时较低，这表现 在不加乙快抑 制时有NO被检测出，而以柠檬酸钠甘油为碳源时,加乙快处 为碳源时无N, 0的积累.理组17h前NO浓度低于柠檬酸钠为碳源时的浓度,至17h后NO浓度持续提升, 超过了柠檬酸钠为碳源时的浓度.作为异养反硝化菌株HP1的电子供体，甘油比柠 檬酸钠的效果好.至于NH;的积累，可能是菌体自溶后释放而来的,也可能是还原产 生的.在本试验中，由于测试时间短,
21、后一种可能性 较大.2. 2批式培育时碳氮比对菌株HP1异养反硝化作用的影响异养反硝化作用所需作为电子供体的碳源的计算公式为：c (0C)=2. 86c (N03 一 N) +1. 71c (NO; N) + c (DO) (1)式中，c(OC)所需有机碳浓度,mol?L, ;c(N03-一 N):处理水中硝态氮浓度,mol?L, ;c(N02-一N):处 理水中亚硝态氮浓度,mol?L. ; c (DO):处理水中 溶解 氧浓度,mol?L,.由公式(1)可推导出在无氧条件下，反硝化作用所需碳与硝态氮和亚硝态氮 之和的理论比值为4.6:1(摩尔比).在异养微生物 生长代谢过程中，有机 碳除作
22、电子供体外，还作为碳源养分物用来合成微生物生长所需物质而被消耗，所 以实际需要的有机碳量大于由公式计算出的理论比值(4. 6:1).批式培育条件下 碳氮比对菌株HP1异养反硝化作用的影响见图2,试验结果符合 上述推论.由图2 可知,C/N为3:1时碳源不足，NO浓度低于其他试验组；当C/N为8:1时,N:0浓 度 在各试验组中最高；当C/N超过8:1时,NO浓度反而降低.可见在批式培育时HP1 培育的最适C/N为8:1.但为什么当C/N高于8时NO浓度反而下降 呢?上述试验证明甘油对菌株HP1 的异养反硝化没有明显抑制作用.菌株HP1在N03为氮源的培养液中生长60h后 氮的变化状况见表1.由
23、表1可知,HP1可采用N03作为唯一氮源进行异养反硝化 作用.当C/N高于8时,碳源相对过剩,要消耗 部分NOr作为氮源,作为电子受体 的NO相对减 少，因此还原产生的NO量降低.由此可见,菌株HP1对硝酸还原至少 有2种途径.353025曼2015烂 10 z 5图2C/N对菌株HP1异养反硝化作用的影响Fig. 2EffectofC/NondenitrificationofStrainHPl表1菌株HP1在NO;为氮源的培育液中生长60h后氮 的变化TablelChangeinnitrogenincultureofStrainllPlwithnitrateasnitrogensourcea
24、fter60hoursnig?L2. 3连续培育时碳氮比对菌株HP1异养反硝化作用的影响菌株HP1在连续培育中不同碳氮比时的生长 状况见表2.表2菌株HP1在不同碳氮比连续培育中的生长状况Table2EffectofC/NongrowthofStrainHPlincontin-hOBSculture1)以十重计.由表2可知,连续培育时有大量NH4+生成,温 度对其含量有明显影响,温度低时 NH4+浓度高.由于试验设计的温度范围不足以导致氨的挥发，因此温度对NH4+生 成的影响不是由氨的挥发引起的：当碳氮比较低时(3:1),培育液中能检测到NO的 存在,且温度高时N02-浓度高;但在碳氮比为20
25、:1时则检测不到N0;为何会有大 量NH4+的积累？缘由尚不清晰.至于N0;积累的缘由，有2种可第2期傅利剑等:碳源及碳氮比对异养反硝化微生物异养反硝化作用的影响45能:一是随着C/N降低,碳源相对不足,N0浓度相 对提升,可促进异养反硝化作 用的进行,所以有异养 反硝化作用的中间产物积累，Samuelson_l对pseud一 olnol 1, o, sputrefaciens的试验有类似结果；二是批式培 养试验证明当C/N为 3:1时碳源成为限制性因素，在连续培育时由于无法获得足够的碳源合成足够的 反硝化酶系,所以有中间产物积累.在C/N为20:1时状况恰好相反，因而检测不到 异养反硝化作用
26、的中间产物N03结语不同的碳源种类是通过影响硝酸还原酶以外的其他酶来影响反硝化作用过程 的，试验表明它至少 影响了氧化亚氮还原酶的活性.在所选择的碳源中，甘油作为 碳源时酶合成启动慢，但到17h后N, 0浓度超过了柠檬酸钠处理组.C/N对反硝化 作用的影响受培育方式,温度,所用碳源等多种因素的影响，需要通过多因子试验加 以进一步验证.反硝化作用是去除地下水中过度NO的较好 方法，但地下水中自然 反硝化作用受各种条件的限制，如反硝化微生物的数量，碳源，氧气等，反硝化作用 强度低.可将抽提的地下水通过生物反应器，向反应器中直接添加纯培育反硝化微 生物和合适的碳 源，掌握C/N和溶氧量，最大限度地强
27、化反硝化作用，将N03-还原 为N,削减中间产物的积累,达到显着去除NO;的目的.参考文献：1RevsbecbNP, SbrensenJDenitrifieationinsoilandsediment2 4 5 6 7 8 9 10M. NewYorkandLondon:PlenumPress, 1990:6573ZayedG. WinterJ. Removaloforganicpollutantsandofnitrate fromwastewaterfromthedairyindustrybydenitrificationJ. ApplMicrobiolBiotechnol, 1998, 49(4):469474