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1、 生物技术类大实验实验指导书2009年9月1日刖 S 生物技术大实验 是为生物技术专业本科高年级学生开设的综合实验课程，是在普通生物学实验、生物化学实验、微生物实验、细胞生物学和遗传学实验的基础上的综合实验课程。该实验课程偏重于分子生物学实验教学，通过此实验课程，学生不仅学习到最基本的分子生物学技术，而且学习到前沿的生物技术。分子生物学实验技术突飞猛进，日新月异。分子生物学技术的广泛应用，在2 0世纪下半叶对生命科学的进步产生了举世公认的巨大推动作用，而且对人们的生活和整个社会的发展亦产生了巨大的冲击和影响。分子生物学技术已广泛渗透和应用到生物学、遗传学、细胞学、微生物学、进化学、肿瘤学、免疫
2、学、药理学、发育学、病毒学、神经生物学、生药学、法医学等与基础医学和临床医学有关的研究领域。2 1世纪将更是分子生物学技术快速发展的时期，山此引起的生物技术革命并将更加深刻地影响社会的发展。学生基本技能和动手能力的培养都离不开实验室，离不开实验课上的训练，很多理论上的原理都需要到实验课上去验证，很多理论上的知识都需要到实验课上去实践。而实验课教材或实验指导书是开好实验课的基本条件之一。虽然目前的分子生物学实验教材版本众多，但针对本科生的生物技术大实验教材尚无出版。为了加强本学科的教材建设，促进本学科实验课的开设，我们参考了国内外最新的有关分子生物学实验技术的专著，根据我校学生的特点及我们自己现
3、有的基础和条件，特选择了部分实验内容，并结合我们的经验与体会，汇编成了生物技术大实验实验指导书，以供参考。在使用过程中，可根据不同的层次适当增减。同时，对于新近产生和应用前景广阔的生物芯片技术、RNAi技术和蛋白质组研究等，限于我们目前的条件，只能作些演示或作为动态给以介绍，条件一经成熟，即行开设。由于分子生物学技术和生物技术的快速发展，加之我们是第一次这样系统地给学生开设生物技术大试验课程，许多工作还处于不断探索的过程中，难免有不妥和疏漏之处，恳切期望读者提出宝贵意见，以利不断修正完善。目 录注意：值日生的任务是协助实验准备及实验室卫生清扫，具体工作时间和任务由负责研究生安排（平时可能要做一
4、些实验准备，如预实验、配液等。要求必须提前3 0 分钟到实验室），老师监督并作为平时成绩考核。时间安排，每次课6-8 学时，周三8：5 0-1 5：5 0；周四 8：5 0-1 3：5 0,周六8：5 0-1 6：5 0；周日&5 0-1 6：5 0；有些实验时间可能增加，视实验任务而定。无特别安排暂定周六1 班和周日2 班，有变动商议后提前告知。实 验 1、从动物组织中提取基因组D N A （刘小龙，徐鹏如）【值日生：0 6-1 班 蔡 哈、陈作深、陈顺艳、邓大标；0 6-2 班 戴 殷、邓科源、邓修康、高甘梅】实 验 2、P C R 扩增基因特异片段（刘小龙，徐鹏如）【值日生：0 6-1
5、班蔡哈、陈作深、陈顺艳、邓大标；0 6-2 班戴殷、邓科源、邓修康、高甘梅】实验3、D N A 片段的回收及纯化（何伟璇，熊接华）【0 6-1 班 冯 剑 平、甘燕贞、霍嘉玲、李鉴清；0 6-2 班 邓 勇、黄晓灵、贾小艳、李慧莹】实验4、P C R 产物的T A 克 隆（何伟璇，熊接华）【0 6-1 班 冯 剑 平、甘燕贞、霍嘉玲、李鉴清；0 6-2 班 邓 勇、黄晓灵、贾小艳、李慧莹】实验5、感受态大肠杆菌细胞的制备（C a C L 2 法）与质粒转化（王瑞晓，汪元梅）【0 6-1 班 李宝红、李仕勇、林世亮、刘成模；0 6-2 班 胡 博、李丽坤、李晓鹏、李雯榕】实 验 6、P C R
6、法快速鉴定重组载体（菌落鉴定）（王瑞晓，汪元梅）【0 6-1 班 李 宝 红、李仕勇、林世亮、刘成模；0 6-2 班 胡 博、李丽坤、李晓鹏、李雯榕】实 验 7、质粒的提取和纯化（蔡伟光，肖敏）【0 6-1 班 刘 青、罗龙清、罗月明、王光真；0 6-2 班李炫、梁惠娟、梁礼健、梁勇】实 验 8、质 粒 D N A 的电泳和纯度检测（蔡伟光，肖敏）【0 6-1 班 刘 青、罗龙清、罗月明、王光真；0 6-2 班 李 炫、梁惠娟、梁礼健、梁勇】实验9、限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒.（杨林，柒启恩）【0 6-1 班 田 朝 阳、郭黎、王斌、王娟娟；0 6-2 班 林 鑫 城、饶靖、司徒昭韵、孙文
7、俊】实 验 1 0、外源基因表达载体的克隆（杨林，柒启恩）【0 6-1 班 田 朝 阳、郭黎、王斌、王娟娟；0 6-2 班 林 鑫 城、饶靖、司徒昭韵、孙文俊】实 验 1 1、外源基因在大肠杆菌中的表达（赵增阳，程晓）【0 6-1 班 徐 国 华、徐小珊、姚光宇、余凌冰；0 6-2 班涂子璐、徐建、许佳俊、杨志强】实 验 1 2、目标蛋白的P A G E 检 测（赵增阳，程晓）【0 6-1 班 徐 国 华、徐小珊、姚光宇、余凌冰；0 6-2 班涂子璐、徐建、许佳俊、杨志强】实 验 1 3、R N A 的提取及其纯度检测（李虹仪，程晓）【0 6-1 班 曾 国 章、曾秋丽、曾龙、张雨微；0 6-
8、2 班曾李、詹桂琴、周太刚、邹韵实 验 1 4、逆转录P C R （R T-P C R）扩增基因特异片段（限选）（李虹仪，程晓）【0 6-1 班曾国章、曾秋丽、曾龙、张雨微；0 6-2 班曾李、詹桂琴、周太刚、邹韵实验1、从动物组织中提取基因组DNA（-）实验目的通过实验掌握从动物组织中提取D N A 的基本原理和基本方法。（二）实验原理在 E D T A 和 S D S 等去污剂存在下，用蛋白酶K 笑话细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组D N A,用此法得到的D N A 长度为1 0 0-1 5 0 k b,适用于噬菌体构建基因组文库和D N A印迹分析。（三）试剂、材料、仪器与器材
9、1 .试剂与材料1）T r i s-H C L l m o l/L P H 8.0 5 0 m l配制方法：4 0 m l 双蒸水，6.0 5 7 g 固体T r i s 放入烧杯中溶解，用浓盐酸调P H 值到8.0,转移到5 0 m l容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4 c 保存备用。2）生理盐水：0.85%Na C L 1 0 0 ml配制方法：在 2 0 ml双蒸水中溶解0.85 g 固体Na C L,加水定容至1 0 0 ml,摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4 c 保存备用。3）EDT A 0.5
10、mol/L P H8.0 5 0 ml配制方法：将 9.0 8g 的 EDT A Na 2 2 H2 0 溶解于4 0 ml双蒸水，用 1 g 的 Na OH颗 粒（慢慢逐步加入）调 P H 值 到 8.0,用 5 0 ml容量瓶定容，如 果 EDT A 难溶，先 加 Na OIl溶解，然后逐步加EDT A Na 2 2 H2 0。4）T ES 缓 冲 液（释放DNA）1 0 0 ml配制方法：将 0.5 84 4 g 的 5 mol/lNa C l溶解于80 ml双蒸水,在分别加入1 ml的 0.5 mol/1 EDT A、0.2 ml的 T r i s-HC l（p H=8.0）,加定容至
11、1 0 0 ml,摇匀后,转到准备好的输液瓶中,贴上标签，高压灭菌后，降至室温，保存备用。5）1 0%S DS （变性剂破细胞壁）1 0 0 ml配制方法：将 1 0 g 的十二烷基硫 酸 钠（S DS）溶解于80 ml双蒸水于6 8加热溶解，用浓HC 1 调至P H=7.2,定容至1 0 0 ml,摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4 c保存备用。6）蛋白酶K（降解蛋白质）：2 0 mg/矶无菌三蒸水溶解。7）R NA 酶（降解R NA）（选配）配制方法：将胰 R NA 酸（R NA 酶 A）溶于 1 0 mmol/L 的 T r i s C L（P H7.5）、1 5 mmol/LN
12、a C L 中,配成1 0 mg/ml的浓度，于 1 0 0 加 热 1 5 mi n,缓慢冷却至室温，分装成小份存于-2 0。8）氯仿：异戊醇=2 4：1 1 0 0 ml按 2 4:1 的比例加入氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，贴上标签，4 保存备用。9）T E 缓 冲 液（溶解 DNA）P H8.0 5 0 ml配制方法：将 0.5 ml M lOmmol T r i s-HC l（P H8.0）、0.1 ml 的 0.5 mol/l EDT A （P H8.0）加入到 5 0 nli的容量瓶中，调 P H8.0 定容至5 0 nli 摇匀后，转到准备好的瓶中，贴上标签，高压灭菌后
13、，降至室温，4 c 保存备用。2.仪器与器材移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴箱。（四）操作步骤1 .组织块解冻,取适量组织于P B S 溶液中清洗干净后放入装有5 0 0 微升P B S 的离心管中（1.5 ml）,用剪刀剪碎；1 2 0 0 0 r p m离心8mi n,取出弃上清;2,加入 0.4 5 ml T ES 混匀,再加入 5 0 u l S DS （1 0%）,2 0 u l 蛋白酶 K（2 0 mg/ml）,充分混匀后，于 5 6 保温4-6 h,每 2 h 摇 1 次，至体系透亮为好。3 .放置到室温，加入等体积饱和酚（5 0 0 u D,上下温柔翻转5 mi n
14、,1 2 0 0 0 r/m,离心lOmi n,分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的1.5 ml离心管。4 .加入等体积酚：氯仿：异 戊 醇（2 5：2 4：1）,上下温柔翻转5 mi n,1 2 0 0 0 r/m,离心 1 0 分钟,取上层转移到新的1.5 ml离心管中。5 .加入等体积氯仿：异戊醇（2 4：1）,上下温柔翻转5 mi n,1 0 0 0 0 r/m,离 心 1 0 分钟，取上层清液到一个新的1.5 ml离心管。6 .加 入 1/1 0 体积的Na A c（4 保存）,加入2 倍体积的-2 0 预冷的无水乙醇沉淀DNA,置于-2 0 C 中保存3 0 mi
15、 n或更久；观察现象。7 .1 2 0 0 0 r/m,离 心 1 0 分钟，弃乙醇。8.-2 0 保存的7 5%乙醇洗涤，1 2 0 0 0 r/m,离心5 分钟，去乙醉，5 5 干燥DNA。9 .加入适量T E溶解DNA （具体依DNA 的多少而定）（一般5 0 u L）,-2 0 保存备用。如果除去其中的R NA,可加5 口1 於2 5 6 人（1 0 1 8/1 1 1）,3 7 保温3 0 1 1 1 5，用苯酚抽提后，按步骤9 和 1 0 重沉淀D N A。（五）注意事项1 .要充分除去D N A 提取液中的苯酚，否则会影响以后的操作。2 .用酚-氯仿-异戊醇（体积比为2 5：2
16、4：1）抽提后取上清是不能将中间的蛋白质扰动，以防蛋白质污染。3 .酚-氯仿-异戊醇中的异戊醇是用来消除实验中可能产生的泡沫。4 .抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对D N A 的损伤。5 .取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。6 .乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起D N A 7 .离心后，不要晃动离心管，拿管要稳，斜面朝外。（六）思考题1 .操作4中的蛋白酶K有什么作用？2 .操作7中的乙醛有什么作用？3 .如何除去D N A 提取物中的R N A?实验2、PCR扩增基因特异片段(-)实验目的学习P C R 体外扩增的原理及其引物设计原则；了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响；掌握P C
17、 R 的基本操作。(-)实验原理P C R(p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n)是在体外进行的由引物介导的酶促D N A 扩增反应。在分子生物学研究中，广泛地应用于研究基因突变，获取加上酶切位点的目的基因和D N A序列测定等方面，是分子生物学中一项极为常用的技术。P C R 的原理是在模板D N A、引物和4种脱氧核糖核甘酸(d N T P)存在的条件下，依赖于D N A 聚合酶的体外酶促合成反应。两个引物分别位于靶序列的两端，同两条模板的3 端互补，由此限定扩增片段。P C R 反应由一系列的变性一退火延伸反复循环构成，即在高温下模板
18、双链D N A 变性解链，然后在较低的温度下同过量的引物退火，再在适中的温度下由D N A 聚合酶催化进行延伸。由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板，因此扩增产物的量以指数级方式增加。理论上，经过n次循环可使特定片段扩增到2 -1,考虑到扩增效率不可能达到1 0 0%,实际上要少些，通常经2 5 3 0 次循环可扩增I O,倍，这个量足够分子生物学研究的一般要求。1 PCR引物设计(1)Tm 值Tm 值是P C R引物设计中的一个重要参数，是指引物与模板之间精确互补并且在模板过量的情况下有5 0%的引物与模板配对，而另外5 0%的引物处于解离状态时的温度，Tm 值一般高于5 5。合适的
19、引物选择应需考虑到以下因素，如 Ta q 醵的最适温度(TJ和 Tm 值等。最常用的Ta q 酶的最适温度(TJ范围为7 0 7 4 ,根据TE可以先确定一个合适的退火温度范围(Ta)。这个温度范围应不高于酶的最适反应温度，也不能比”2 5 更低。这是因为如果退火温度低于酶的最适反应温度时，酶的合成反应会非常缓慢，但片面考虑提高温度又会造成引物脱落而不能进行P C R扩增。所以Ta 的选择应满足TE-2 5 r Ta G=OAo即当引物3 末端为A时，即使有错配碱基也最不易延伸，所以引物设计时可将3,末端设计为A,以提高复制精确性。另一种理论是3,末端应设计为G或 C,因为G和 C的氢键多于A
20、与 T,能更好地与模板结合开始D NA 合成，当然对错配延伸效率方面就不能苛求了。总而言之，引物的3,末端不要考虑使用T。(5)引物无发卡结构 引物自身应无发卡结构。(6)二引物自身之间不能配对二引物自身不能配对是指同一对引物之间不能有配对的多个碱基，特别是在引物的3 末端。二引物间不能配对的道理与二引物本身不能配对相同，若发生这种情况会形成引物二聚体，造成扩增失败。一般引物自身配对形成茎环结构，茎的碱基对数不大于3,两条引物间配对碱基数小于5 个。(7)二引物的T m 值 引物设计时应注意使二引物的T m 值相近，否则二个引物必然不能同时达到最佳退火温度，将会影响P C R 扩增效果。能同时
21、达到最佳退火温度，将会影响P C R扩增效果。由于影响引物设计的因素比较多，所以常利用计算机来辅助设计，通常可用p r i m e r 5.0软件或其它P C R 引物设计程序来帮助设计。2 PCR反应条件1.P C R 缓冲液 常用的 1 X P C R 缓冲液为 l O m m o l /L T r i s-H C l p H 8.3(常 温),50 m m o l/L K C 1,1.5m m o l /L M g C l2o由试剂公司与T a q 酶一起提供。(DMg离子浓度：M g 离子浓度对P C R 反应影响很大，因为国葭 与引物-模板及产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的
22、生成、产物的忠实性、酶活力、产物的产量等诸多因素有关。M-一般使用浓度为0.5 2.5m m o l /L,必要时可以0.5m m o l /L 梯度间隔做M g 最适浓度试验。(2)d NT P：常用d NT P 浓度为2 0 n m o l/L(可用范围为2 0 2 0 0 u m o l/L)。d NT P 的用量与 P C R 产量及产物忠实性有关，d NT P 量过少时合成的产物减少。可以被T a q 酶接受的经过修饰的 d NT P 有以下几类:d i g T 1 d U T P、5b r o m o-d U T P、b i o t i n-1 1 d U T P b i o t.
23、i n-1 6d U T P、7d e a z a-d G T P 和次黄喋吟。但不是所有的聚合酶都能接受经过修饰的d NT P。(3)1 离子浓度：P C R 反应中K 离子的作用是促进T a q 酶活力与促进引物退火，一般使用浓度是50m m o l /L,但当K 离子浓度高于50m m o l /L时会抑制T a q 酶活力。(4)p H 值：P C R 反应中用的是T r i s-H C L 缓冲系统。T r i s-H C L 缓冲系统的特点是具有很高的温度系数(0.02 1p H/),2 0时 p H为 8.3的缓冲液在7 2 延伸反应时,实际p H 值降低 至 7.2。而 T r
24、 i c i n e 的温度系数较高，在扩增长片段时用T r i c i n e 系统。(5)保护剂：由于P C R 反应体系中蛋白的含量极低，所以加入的酶非常容易变性，通常需加入一定量的保护剂。如 5m m o l/L 的二硫苏糖醉(D T T),1 00u g/m l 的小牛血清白蛋白(B S A)或 0.01%的明胶。加入保护剂对P C R 循环数较多的扩增反应效果尤其明显。2 .模 板 P C R 模板可以是D N A 或 R N A,R N A 需反转录后再扩增。模板可以是基因组D N A或纯化的质粒D N A,当然两者的D N A 量在P C R 起始模板中相差很大。每个P C R
25、 反应中加入的模板数量可在IO?IO,分子之间，必要时可低至50 个分子，模板的量少时应酌情增加循环次数。小 于 l OOn g 的哺乳动物细胞基因组D N A(相当于约104个细胞)，经 3 0个循环，10%的反应物应能够在溟化乙锭染色的凝胶上看到一条主要产物带。使用较大量的模板时，循环数可减少；如果模板量很少，可能需要增加至45个循环反应.3 .引物浓度 常用引物浓度为0.1 0.5 u m o l/L。随着引物浓度的降低，P C R 反应的特异性提高但产物得率降低；随着引物浓度的升高，情况正好相反。4.P C R 反应中 的 醒 T a q 酶最早是从水生嗜热菌(t h e r m u
26、s a q u a t i c u s)中分离得到的，该酶的最适温度是7 2 ,在 9 4时相当稳定，半衰期长达3 8 m i n o 由于这种酶使用最早最广泛，文献中所列各项最适反应条件都是针对此前优化的，使用其它的聚合酶时按试剂盒使用说明书操作。(三)实验内容仪器和试剂1.仪 器 P CR 仪，微型水平电泳槽，电泳仪等。2.试剂(1)50X T AE电泳缓冲液(2)10X P CR 缓冲液:(3)4 种 d NT P 混和液 l O m m ol/L(4)P f uDNA 聚合醐(5U/P 1)(5)引 物(20uM)(6)10X澳酚蓝上样缓冲液方法和步骤1.在 P CR 仪上设置好程序。
27、2.在两个灭菌的0.5m l 离心管中，按下列顺序加样，建立20 口1 反应体系。总体积 20 u 1d d H2015u 110XP CR Buf f e r2u 1d NT P(10m M e a c h)0.5n 1P ri m e r 1(20 u M)0.5u 1P ri m e r 2(20 u M)0.5u 1模板 DNA(50n g)D16I n 1P f u DNA 聚 合 酶(2.5U)0.5 M 1对 照 水（空白对照）3.混匀，短暂离心.4.放在P CR 仪上进行P CR 反应。940c 变性3m i n,94C45秒，6 4 1 分钟，7 23分钟，20个循环。（用旧
28、式的P CR 仪进行基因扩增时还要求覆盖约50共1（一滴）液体石蜡油，改进后的P CR 仪已经不用液体石蜡油覆盖。）5.取 5 1 H P C R 反应液及1口1 上样缓冲液混合，进行琼脂糖电泳（5V/c m）,选择适当大小的DNA分子量标准（DL 2000）,检查扩增产物。紫外观察，必要时拍照。（四）注意事项1.P C R 是建立在一定量的模板和与之专一性互补配对的一对引物之上的，因此，在进行 P CR 前，模板的纯化和引物设计尤为重要。2.Mg?对 T a q DNA聚合酶的活性影响很大，有时按照试剂商提供的说明扩增不出目的基因时，不妨适当增加Mg 的浓度。（五）思考题1.P CR 的原理
29、是什么？2.P CR 中引物和T a qDNA聚合酶各有什么作用？3.P CR 中怎样预防出现假阳性结果？4.什 么 是 T m 值？有何用途？如何计算？5.引物设计应遵循什么原则？6 .你会使用哪种引物设计软件？实验3、DNA片段的回收及纯化实验目的了解琼脂糖凝胶电泳中回收D N A 片段的常用方法，掌握根据实际情况选用方法的原则,并用试剂盒从琼脂糖凝胶中回收P C R 产物D N A 片段。实验原理质粒、噬菌体等经酶切，电泳；P C R 产物经电泳后，常常需要对一些D N A 电泳片段进行回收和纯化，用于亚克隆、探针标记等。D N A 回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，
30、也有现成的试剂盒供应。1 .低熔点胶法低熔点胶是向普通琼脂糖的多糖链上引入羟乙基形成的，这一变化会使凝胶的熔化点与凝固点均降低。低熔点胶在3 0 时凝结、6 5 时熔化，这一温度尚不足以使D N A 分子变性。操作时可先灌一块普通的胶，然后用低熔点胶取代其中的回收部分。割下的胶加入T E 后于6 5 保温促使凝胶熔化，再加入等体积的酚抽提去除凝胶。低熔点胶的另一个特点是电泳回收后可以立即进行酶切连接、标记等酶反应，因为这类胶中不含有普通琼脂糖中抑制酶活性的硫酸盐等杂质，并且收集的胶条能在酶反应的合适温度（3 7）始终保持液体状态。2 .玻璃粉（乳）法将胶条割下加入N a i 溶液浸泡，剧烈振荡
31、数分钟促使溶胶。向胶液中加入经酸净化处理的极细玻璃粉（乳），室温反复倒转离心管使D N A 吸附于其上。离心收集玻璃粉后加入T E 并于3 7 保温,洗脱吸附于玻璃粉上D N A,再次离心收集含D N A 的上清液即可。玻璃粉法适用于回收0.4 I k b 的小分子片段，均有8 0%的回收率。3 .Q I A g e n 胶回收试剂盒 由于凝胶溶于含N a i 的溶胶液，D N A 能专一地与离心柱中纤维素结合。结合后的D N A 经洗涤除去杂质，最后在低盐缓冲液中经离心从纤维素上洗脱下来。4其他试剂盒，基本原理是，在高盐状态下，纯化树脂专一性地吸附D N A；而在低盐或水溶液状态下，D N
32、A被洗脱下来。此法简便快捷，可在几分钟内从P CR 反应液，或十几分钟内从普通琼脂糖凝胶中回收高纯度的P CR 产物，用于D N A测序及其它能促反应。其回收率分别为8 5%和 7 0%左右。该系统不仅用于纯化P CR 产物，还可以从反应液或普通琼脂糖凝胶中回收各种类型的D N A片段，适用范围从1 5 0 b p 到十几k b。实验内容试剂与器材试剂：琼脂糖、T AE电泳缓冲液、1 0 X D N A电泳样品缓冲液、P CR 产物、澳化乙锭（EB）、T r is T I Cl 饱 和 酚（p H 7.6）、酚/氯仿、氯仿、3 M N a Ac （p H 5.2）、无水乙醇、7 5%乙醇、无菌
33、水、超纯水或T E缓冲液仪器：台式高速离心机、水浴锅、电泳器材、电泳槽、紫外灯、手术刀、1.5 离心管、1 0 0 0 移液枪、l m l t ip 头实验步骤（冻融法）1 .紫外灯下仔细切下含待回收D N A的胶条，将切下的胶条（小于0.6 g）捣碎，置 于 1.5 m l离心管中；2 .加入等体积的T r is-H Cl 饱 和 酚（p H 7.6）,振荡混匀；3 .-2 0 放置 5 T 0 m in；4 .4 离 心 1 0 0 0 0 r p m X 5 m in,上层液转移置另一离心管中；5 .加 入 1/4 体积HQ于含胶的离心管中，振荡混匀；6 .-2 0 ,放置 5 T om
34、 in；7 .4 离 心 1 0 0 0 0 rPm X 5 m in,合并上清液；8 .用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清；9 .加 入 1/1 0 体积3 M N a Ac （p H 5.2）、2.5 倍体积预冷的无水乙醇，混匀；1 0 .-2 0 ,静置 3 0 m in；1 1 .4 离 心 1 2 0 0 0 r p m X 1 0 m in,弃上清，7 5%乙醇洗沉淀1-2 次，晾干；1 2 .加适量H2或 T E溶解沉淀。1 3 .电泳检测结果注意事项1 .低熔点胶回收D N A时，切除不含样品的凝胶，保证样品凝胶尽可能地要小。2 .室温低于2 5 c 时，纯 化 树 脂
35、（于 G S 结合液中）可能出现结晶或盐析，此时请务必预热，使其完全溶解后使用。3 .纯化树脂（于 G S 结合液中）为灰褐色粉状物质，静置时沉淀于瓶底，使用时要充分混匀。实验4、PCR产物的TA克隆实验目的掌握通过T A 连接克隆P C R 产物的原理和方法。实验原理通过P C R 的方法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的D N A 序列，获得的目的片断通常需要通过T A 克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚D N A 序列。由于在P C R 过程中，使用的D N A 聚合前不同，往往分为2 种情况：（1）使用不同的T a q 酶,在 P C R 扩增循环结束后，加
36、上7 2 1 0 分钟一个过程，T a q 酶可以在扩增产物的3 末端加上A,因此P C R 产物回收纯化后可以和T载体直接连接。（2）使用高保真的D N A 聚合酶，如pfu 酶，由于其不能在扩增产物的3 末端加上A,得到的D N A 序列为钝端，因此，需要在回收纯化后进行加A的过程，通常是以P C R 回收产物为模板，加上一定量的普通T a q 前和反应液，加入d A T P （或 d N T P）,7 2 1 0 分钟，然后将加A产物直接用于T A 连接。1.T A 克隆：在 P C R 的过程中所用的T a q D N A 聚合前会在P C R 产物的3 端额外添加个 A碱基，通过D
37、N A 连接酶与T载体上的T碱基互补配对让目地基因连接到T载体上。2.转化感受态：成功连接了目地基因的T载体以环状D N A 的形式存在，在热激过程中被感受态摄取到细胞内，以质粒的形式存在细胞质中，质粒能在大肠杆菌中传递复制，其上带有的A m p抗性基因使大肠杆菌获得A m p抗性，能在含有A m p的培养基上生长繁殖形成带有目地基因的菌落。实验仪器与试剂1 实验仪器：超净工作台，水浴锅或金属恒温版，P C R 仪，恒温摇床，培养箱，2、1 0、2 0 0 u l移液枪及相应t ip头2实验试剂：LB 液体培养基，LA 平板，T载体，D H 5a 感受态实验步骤1 .目的D N A 与 T载体
38、连接1）根据载体说明书上的说明添加连接体系。2）连接体系于1 6 C下连接4 h,置 4 c冰箱过夜。2.转化1）取-80 C 保存的感受态并迅速解冻2）加入连接产物，轻轻吹打混匀。3）冰浴 3 0min4）4 2 c 热激 9 0s,冰浴 lO min o5）加入2 00ul的 LB 液体培养基，3 7 c摇菌3 0min6）将菌液均匀涂布到LA 平板上，静 置 lO min 让其吸收，7）平皿倒置与3 7 C 培养箱中培养过夜。注意事项1 .Lig a t io n S o lut io n I 请于冰中融解。2 .在进行克隆时,V ec t o r D NA 和 In s er t D
39、NA 的摩尔比一般为:2 2 1 0,在本制品中,p MD 1 8-T V ec t o r 1 g l（5 0 n g）的摩尔数约为 0.03 p mo l,Co n t r o l In s er t D NA Ip l（5 0n g）的摩尔数约为0.1 5 p mo l。3 .克隆时使用的In s er t D NA 片 段（P C R 产物）尽量进行切胶回收纯化，切胶回收的P CR片段最好除去残存的引物等杂质。P CR 产物中的短片段D NA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响T A 克隆的效率。4 .按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过
40、2 0包。当进行转化的D NA 用量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化D NA 后再进行转化。5 .连接反应请在1 6下进行，温 度 升 高（2 6）较难形成环状D NA。6.连接效率偏低时，可适当延长连接时间至数小时。7 .感受态细胞可使用适合于p U C 系列载体的感受态细胞，如：JM1 09,D H5 a 等。8 .D NA 片段的立体结构、D NA 片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段D NA 的克隆效率（连接效率与转化效率）小于短片段D NA,在使用大片段D NA 的连接液进行转化时，建议采用电转化方法。【思考题】怎样提高P MD 1 8-T V ec t
41、 o r 的克隆效率？实验5、感受态大肠杆菌细胞的制备（Ca CL2 法）与重组D NA 转化实验目的掌握Ca Ck制备感受态大肠杆菌的方法和重组D NA 的化学转化法。实验原理转 化（t r a n s f o r ma t io n）:把外源D NA 分子导入到某-宿主细菌细胞的过程成为转化。感受态细胞（c o mp et en c e c ell）:受体细胞经过一 些特殊方法（电击法、C a C L 2 法等）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，处于容易吸收外源D N A 的状态即感受态，此时的细胞为感受态细胞。本实验通过冰冷的C a C k 溶液处理大肠杆菌，当细菌处于0的 C a C
42、k 低渗液中，细菌细胞膨胀成球形，使之处于短暂的“感受态”，在这期间，细菌能够摄取各种不同的外源D N A片段或基因，使受体细胞获得供体基因的某些性状。质粒D N A 的转化是重组D N A 技术中重要的一环。实验材料菌 株 Dll5a、BL21,重 组 质 粒 pNTE-GFP（?）、不是TA克隆产物？实验仪器与设备高 压 灭 菌 锅 超 净 工 作 台（2 个）恒 温 摇 床 低 温 离 心 机（广2 台）恒温水浴锅或恒温金属浴恒温培养箱 冰 箱（一般和低温）锥形瓶150Ml 4 个 微量取液器（200微升、1000微升）5 毫升移液器4 个灭菌离心管50ML 8 个 灭 菌 1.5mL离
43、心管一瓶 灭菌5ml吸头灭菌纸巾或滤纸若干 灭菌培养皿30个（90mm）灭菌培养管10个实验试剂1、1、0.IM CaCl2:灭菌去离子水配制,200ML,灭菌、4 c2、氨革青霉素（100mg/ml）：无菌水配制并过滤（0.22 口 m）除菌，分装保存于-203、LB平 板 LB培养液中加入1.5%琼脂粉，高压消毒（15磅 20min）,稍冷却后铺平板，6个,4 （1 个班）4、LB液体：100ML分装，4（可两个班共用）5、4.含抗生素LB平板 配方同上，高压消毒后，冷却至65左右，加入氨节青霉素，终浓度为50 1 0 0 u g/m l培养液，加入抗生素后立即倒平板，15个（1 个班），
44、做蓝白斑筛 选,100ul IPTG 和 15ul X-gaE实验步骤（）DH5a、BL21感受态细胞的制备1.将 DH5a、BL21细菌分别划线在LB平板上，37培养过夜。2.从 LB平板上挑取DH5 a、BL21单个菌落接种在5ml LB培养基中，37振荡培养过夜。（每个菌株各挑两个单菌落）3.次 日 取 0.5 T.0 in l上述菌液，接 种 于 50 m l新 鲜 LB培养液中，37振荡培养00600=0.4-0.5；（每个菌株接种两瓶）4.将菌液转移到预冷的50ml,410min,5.4 4000r/m in离心8m in,弃去上清液，倒置于灭菌的纸巾上，1 分钟流尽。6.沉淀的菌
45、体悬浮于20ml 0.Im ol/L 冷 CaCk内，冰浴中放置30min,44000r/min离心8 min。7.沉淀的菌体再悬浮于2ml 0.Im ol/L 冷 CaCk溶液，并置于冰浴中。8.冰上分装细胞于预冷的1.5ml离心管中，每管200微升或100微升。（如暂不用，感受态细菌可以在12.5%的无菌甘油-70C 保存半年）（-）重组DNA的转化1.取 3 支 1.5ml离心管，按下表加试剂和操作:_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _试 剂管 1管 2管 3连接产物10n 1质粒(100ng/u 1)1U 1H209H 110u 1感受态细胞200 u 1200 Hl20
46、0u 1注意：用大吸头温和吹打混匀或小心旋转试管混匀。2.冰浴中放置30min。3.42热冲击90s后，立即放入冰浴，放置25 分钟。4 .每管加入新鲜L B 培养液0.8 5 ml。5 .3 7 剧烈振摇培养6 0 min。（转速不低于2 2 5 R P M）6 .5 0 0 0 r/min离 心 I min,弃去上清液保留培养基1 0 0 2 0 0 口 1,充分悬浮细菌，分别涂布于含氨茉青霉素的L B 平板，加入的菌液用玻棒均匀推开。以上操作均需在无菌条件下进行。7 .平板倒置在3 7 温箱内培养过夜。（1 2 1 6 h）8 .次日观察各平板上菌落生长情况，并算出转化率即每微克D N
47、A 能转化多少个细菌。注意事项1 .为了提高转化率，本试验所用C a C k 为分析纯，所用培养基需用进口的胰蛋白栋和酵母浸出物。2 .制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴低温、无菌操作，悬浮细胞时应用大吸头温和吸、吹，注意制备感受细胞的O D 值控制在0.4 0.5。3 .4 2 热处理时间很关键，转移速度要快，且温度要准确，同时注意热处理过程中离心管不要摇动。4 .菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。5 .实验用的玻璃器皿、微量吸管及E p p en do r f管等，应彻底洗净并进行高压消毒，表面去污剂及其他化学试
48、剂的污染往往大幅度地降低转化率。【思考题】1 .影响C a C k 法转化率的关键因素有哪些？如何提高转化率？如何计算转化率？2 .涂布菌液时应注意什么？3 .感受细胞制备的注意问题是什么？实验6、PC R 法快速鉴定重组载体（菌液PC R）实验目的掌握菌液PC R 法快速鉴定重组载体的基本操作。实验原理菌液PC R 法快速鉴定重组载体的基本原理是挑取转化的单菌落摇菌，以菌液为摸板，通过针对目的D N A的特异引物或载体通用引物的特异扩增来鉴定外源片段是否重组。实验仪器和试剂1 .仪 器 PC R 仪 1 台，微型水平电泳槽1 个，电泳仪，离心机1 个，PC R 管若干灭菌的L A液体培养基2
49、 0 管（每管4 M L）2 .试剂（1）5 0 X T A E 电泳缓冲液,（2）1 0 X PC R 缓冲液，（3）4种 dN T P混和液1 0 m m o l/L,（4）Pfu D N A聚 合 酶（5 U/u 1）,（5）引 物（2 0 u M）,（6）1 0 X 浸酚蓝上样缓冲液（7）2 5 m M M g 离子溶液实验步骤1.挑取转化的单菌落接种到4 M L 的 L A 液体培养基中摇菌过夜或单菌落接种到2 0 0 微升的L A液体培养基中3 7 振摇培养4 5 小时。2.在 1 个灭菌的0.5 m l 离心管中，按下列顺序加样，建立2 0 u 1 PC R 反应体系。总体积 2
50、 0 n 1ddH 2 01 2 n 11 0 X PC R B u ffer (无 M g 离子)2 H 12 5 m M M g 离子1.5dN T P(1 0 m M ea c h)0.5 u 1Pr i m er 1 (2 0 n M)0.5 n 1Pr i m er 2 (2 0 u M)0.5 u 1模 板 D N A2 p 1T a q D N A 聚 合 酶(2.5 U)mi取培养过夜的转化菌液1 u 1 或培养4 5 小时的菌液4微升做模板混匀，短暂离心.3 .在 PC R 仪上设置好程序。4 .样品放在PC R 仪上进行PC R 反应。9 4 变性5 m i n,9 4 4