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1、Western Blot详 解(原 理、试 剂、步 骤 及 问 题 解 答)W estern免 疫 印 迹(Western B l o t)是 将 蛋 白 质 转 移 到 膜 上，然 后 利 用 抗 体 进 展 检 测。对 表 达 蛋 白，可 用 相 应 抗 体 作 为 一 抗 进 展 检 测，对 基 因 的 表 达 产 物，可 通 过 融 合 局 部 的 抗 体 检 测。本 文 主 要 通 过 以 下 几 个 方 面 来 具 体 地 介 绍 一 下 Western B l o t技 术：一、原 理 二、分 类 i.放 射 自 显 影 i i.底 物 化 学 发 光 E C Li i i.底
2、物 荧 光 ECFiv.底 物 DAB呈 色 三、主 要 试 剂 四、主 要 步 骤 五、试 验 常 见 的 问 题 指 南 1.参 考 书 推 举 2.针 对 样 品 的 常 见 问 题 3.抗 体 4.滤 纸、胶 和 膜 的 问 题 5.M ark er的 相 关 疑 问 6.染 色 的 选 择 7.参 照 的 疑 问 8.缓 冲 液 配 方 的 常 见 问 题 9.条 件 的 摸 索10.方 法 的 介 绍 11.结 果 分 析 一、原 理 与 S o u th ern或 N o rth ern杂 交 方 法 类 似，但 Western B l o t承 受 的 是 聚 丙 烯 酰 胺
3、凝 胶 电 泳，被 检 测 物 是 蛋 白 质，“探 针”是 抗 体，“显 色”用 标 记 的 二 抗。经 过 分 别 的 蛋 白 质 样 品，转 移 到 固 相 载 体（例 如 硝 酸 纤 维 素 薄 膜）上，固 相 载 体 以 非 共 价 键 形 式 吸 附 蛋 白 质，且 能 保 持 电 泳 分 别 的 多 肽 类 型 及 其 生 物 学 活 性 不 变。以 固 相 载 体 上 的 蛋 白 质 或 多 肽 作 为 抗 原，与 对 应 的 抗 体 起 免 疫 反 响，再 与 酶 或 同 位 素 标 记 的 其 次 抗 体 起 反 响，经 过 底 物 显 色 或 放 射 自 显 影 以 检
4、测 电 泳 分 别 的 特 异 性 目 的 基 因 表 达 的 蛋 白 成 分。该 技 术 也 广 泛 应 用 于 检 测 蛋 白 水 平 的 表 达。二、分 类 w e s te rn显 色 的 方 法 主 要 有 以 下 几 种：i.放 射 自 显 影 i i.底 物 化 学 发 光 E C Li i i.底 物 荧 光 ECFiv.底 物 DAB呈 色 现 常 用 的 有 底 物 化 学 发 光 ECL和 底 物 DAB呈 色，体 同 水 平 和 试 验 条 件 的 是 用 第 一 种 方 法，目 前 发 表 文 章 通 常 是 用 底 物 化 学 发 光 ECLo只 要 买 现 成 的
5、 试 剂 盒 就 行，操 作 也 比 较 简 洁，原 理 如 下（二 抗 用 HRP标 记）：反 响 底 物 为 过 氧 化 物+鲁 米 诺，如 遇 到 H R P,即 发 光，可 使 胶 片 曝 光，就 可 洗 出 条 带。三、主 要 试 剂 1、丙 烯 酰 胺 和 N,N-亚 甲 双 丙 烯 酰 胺，应 以 温 热（以 利 于 溶 解 双 丙 稀 酰 胺）的 去 离 子 水 配制 含 有 29%(w/v)丙 稀 酰 胺 和 l%(w/v)N,N-亚 甲 双 丙 烯 酰 胺 储 存 液 丙 稀 酰 胺 29g,N,N-亚 甲 叉 双 丙 稀 酰 胺 1g,加 H20至 100mL)储 于 棕
6、 色 瓶，4 避 光 保 存。严 格 核 实 P H 不 得 超 过 7.0,因 可 以 发 生 脱 氨 基 反 响 是 光 催 化 或 碱 催 化 的。使 用 期 不 得 超 过 两 个 月，隔 几 个 月 须 重 配 制。如 有 沉 淀，可 以 过 滤。2、十 二 烷 基 硫 酸 钠 SDS溶 液：10%金 人)0.185口 5,101出 2 0 去 离 子 水 配 制，室 温 保 存。3、分 别 胶 缓 冲 液：L5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris 和 48mllmol/LHCL 混 合，加 水 稀 释 到 100ml终 体 积。过 滤 后 40C保 存。
7、4、浓 缩 胶 缓 冲 液：0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris 溶 于 40mlH20 中，用 约 48ml 1mol/L HCL调 至 pH6.8 加 水 稀 释 到 100ml终 体 积。过 滤 后 40C保 存。这 两 种 缓 冲 液 必 需 使 用 Tris碱 制 备，再 用 HCL调 整 P H 值，而 不 用 Tris.CL。5、TEMED原 溶 液 N,N,N N 四 甲 基 乙 二 胺 催 化 过 硫 酸 铁 形 成 自 由 基 而 加 速 两 种 丙 稀 酰 胺 的 聚 合。P H 太 低 时，聚 合 反 响 受 到 抑 制。10%(w/v)
8、过 硫 酸 胺 溶 液。供 给 两 种 丙 稀 酰 胺 聚 合 所 必 需 的 自 由 基。去 离 子 水 配 制 数 ml,临 用 前 配 制.6、SDS-加 样 缓 冲 液:pH6.8 0.5mol/L Tris 缓 冲 液 8ml,甘 油 6.4mL 10%SDS 12.8ml,筑 基 乙 醇 3.2ml,0.05%漠 酚 蓝 1.6mL H20 32ml混 匀 备 用。按 1:1或 1:2比 例 与 蛋 白 质 样 品 混 合,在 沸 水 终 煮 3min混 匀 后 再 上 样，一 般 为 20-25U1,总 蛋 白 量 100“g。7、Tris-甘 氨 酸 电 泳 缓 冲 液:30.
9、3gTris,188g甘 氨 酸，lOgSDS,用 蒸 偏 水 溶 解 至 1000ml,得 0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘 氨 酸 电 极 缓 冲 液。临 用 前 稀 释 10倍。8、转 移 缓 冲 液：配 制 1L转 移 缓 冲 液，需 称 取 2.9 g 甘 氨 酸、5.8gTris碱、0.37g SDS,并 参 加 200ml甲 醇，加 水 至 总 量 1L,9、丽 春 红 染 液 储 存 液：丽 春 红 S 2 g 三 氯 乙 酸 30g磺 基 水 杨 酸 30g加 水 至 100ml用 时 上 述 储 存 液 稀 释 1 0 倍 即 成 丽 春 红 S 使 用
10、液。使 用 后 应 予 以 废 弃。10、脱 脂 奶 粉 5%(w/v)。II、NaN3 0.02%叠 氮 钠(有 毒，戴 手 套 操 作)，溶 于 磷 酸 缓 冲 盐 溶 液(PBS)。12、Tris 缓 冲 盐 溶 液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5),500mmol/LnaCl 13、Tween20(15)鼠 抗 人-MMP-9(16)鼠 抗 人-TIMPT。14、过 氧 化 物 酶 标 记 的 其 次 抗 体。15、NBT(溶 于 70%二 甲 基 甲 酰 胺，75mg/fnl)。16、BCIP(溶 于 100%二 甲 基 甲 酰 胺，50mg/ml)017、1
11、00mmol/LTris-HCL(pH9.5),18、100mmol/L NaCl.19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5),5mmol/L EDTA.(可 以 参 看 分 子 克 隆)四、主 要 步 骤 生 物 秀 为 您 搜 集 了 现 阶 段 几 乎 网 上 全 部 的 Western Blot的 中 英 文 资 料，仅 供 试 验 参 考，可 以 依 据 自 己 试 验 的 实 际 状 况 进 展 调 整：Western Blot PROTOCOL：点 击 杳 看 全 部 相 关 文 章 五、试 验 常 见 的 问 题 指 南 依 据 问 题 的 类 型 主 要 分 成 以
12、 下 几 类(以 下 资 料 权 作 参 考，请 勿 盲 目 仿 照！)：1.参 考 书 推 举A.对 初 学 者 看 什 么 资 料 比 较 好？解 答：抗 体 技 术 试 验 指 南 和 Antibodies（a laboratory manual,wrote by Ed Hariow,david lan e）两 本 书 不 错。2.针 对 样 品 的 常 见 问 题 B.做 线 粒 体 膜 UCP2蛋 白 的 Western Blot（以 下 简 写 成 Western B lo t）,提 取 线 粒 体 后 冻 存（未 加 蛋 白 酶 抑 制 剂），用 的 博 士 德 的 一 抗，开
13、头 还 有 点 痕 迹，现 在 越 来 越 差，上 样 量 已 加 到 1 2 0/z g,换 了 个 santa c l o z 的 一 抗 仍 不 行。是 什 么 缘 由？蛋 白 酶 抑 制 剂 单 加 PMSF行 吗？解 答：疑 心 是 样 品 问 题，可 能 是：1,样 品 不 能 反 复 冻 融；2,样 品 未 加 蛋 白 酶 抑 制 剂。同 时，建 议 检 查 Western B l o t过 程，提 高 一 抗 浓 度。对 于 加 蛋 白 酶 抑 制 剂 来 说，一 般 加 PMSF就 可 以 了，最 好 能 多 加 几 中 种 蛋 白 酶 抑 制 剂。C.细 胞 水 平 要 做
14、 Western B l o t,多 少 细 胞 提 的 蛋 白 够 Western Blot?解 答：一 般 地 5*1 0 6就 足 够 了。D.同 一 样 品 能 同 时 提 RNA又 提 蛋 白 吗，这 样 对 Western B l o t有 无 影 响？解 答：能，没 有 问 题，我 们 做 过。E.同 一 蛋 白 样 品 能 同 时 进 展 两 种 因 子 的 Western B l o t检 测 吗？解 答：固 然 可 以，有 的 甚 至 可 以 同 时 测 几 十 种 样 品。F.假 设 目 标 蛋 白 是 膜 蛋 白 或 是 胞 浆 蛋 白，操 作 需 要 留 意 什 么？
15、解 答：假 设 是 膜 蛋 白 和 胞 浆 蛋 白，所 用 的 去 垢 剂 就 要 温 存 得 多，这 时 最 好 加 上 N aF去 抑 制 磷 酸 化 酶 的 活 性。G.我 的 样 品 的 蛋 白 含 量 很 低，每 微 升 不 到 1 微 克，但 是 在 转 膜 时 经 常 会 觉 察 只 有 一 局 部 蛋 白 转 到 了 膜 上，就 是 在 转 膜 后 染 胶 觉 察 有 的 孔 全 部 的 蛋 白 条 带 都 在，只 是 颜 色 变 淡 了，有 什 么 方 法 可 以 解 决？解 答：你 可 以 加 大 上 样 量，没 有 问 题，还 有 转 移 时 你 可 以 用 削 减 电
16、流 延 长 时 间，多 加 5-1 0%甲 醇。H.想 分 别 的 蛋 白 是 分 子 量 260kd的，SDS-电 泳 的 分 别 胶 浓 度 多 大 适 宜？积 层 胶 的 浓 度 又 该 用 多 少？这 么 大 分 子 量 的 蛋 白 简 洁 作 Western Blot吗？解 答：260kd的 蛋 白 不 好 做，分 别 胶 用 6%,Stacking Gel 3.5%。I.假 设 上 样 量 超 载，要 用 什 么 方 法 来 增 加 上 样 量？假 设 需 要 加 大 上 样 量 使 原 来 弱 的 条 带 能 看 清 楚。解 答：可 以 浓 缩 样 品，也 可 以 依 据 你 的
17、 目 标 分 子 量 透 析 掉 一 局 部 小 分 子 蛋 白。一 般 地，超 载 30%是 不 会 有 问 题 的。假 设 己 经 超 了 不 少 了，而 且 小 分 子 量 的 也 要，可 以 考 虑 加 大 胶 的 厚 度，可 以 试 试 1.5mm的 comboJ.蛋 白 变 性 后 可 以 存 放 多 久？解 答：一 80,一 两 年 没 有 问 题。最 关 键 两 条：不 要 被 蛋 白 酶 水 解 掉；不 要 被 细 菌 消 化 掉（也 是 被 酶 水 解 了）。K.我 所 测 定 的 蛋 白 分 子 量 是 105KD,按 理 说 分 别 胶 应 当 承 受 7.5%,但 我
18、 所 查 资 料 却 要 求 分 别 胶 和 浓 缩 胶 均 承 受 11%的 配 方，不 知 为 何？解 答：上 述 您 提 到 的 两 种 凝 胶 均 可 以 使 用，由 于 105KD的 蛋 白 在 上 述 两 种 胶 的 线 性 区 分 范 围 内，但 需 留 意 条 带 位 置。L.接 下 来 我 预 备 承 受 DAB显 色 技 术，二 抗 是 生 物 素 化 的 多 克 隆 抗 体，三 抗 是 亲 和 素 生 物 素 体 系，不 知 承 受 这 样 的 方 案 后，封 闭 液 是 否 要 作 调 整，能 否 再 用 5%的 脱 脂 奶 粉 呢？好 似 有 资 料 说 脱 脂 奶
19、粉 会 影 响 亲 和 素 生 物 素 的 生 成，是 吗？解 答：不 能 使 用 脱 脂 奶 粉，由 于 脱 脂 奶 粉 中 含 生 物 素，用 B S A代 替 应 当 好 一 点.M.还 有 一 问 题，一 般 一 次 上 样 的 蛋 白 总 量 是 多 少，跟 目 的 蛋 白 的 表 达 量 有 关 系 吗？解 答：Western Blot 一 般 上 样 3 0-1 0 0微 克 不 等，结 果 跟 目 的 蛋 白 的 丰 度、上 样 量、一 二 抗 的 量 和 抚 育 时 间 都 有 关 系，也 与 显 色 时 间 长 短 有 关。开 头 摸 条 件 时，为 了 拿 到 阳 性 结
20、 果，各 个 步 骤 都 可 以 量 多 一 点 时 间 长 一 点，固 然 背 景 也 就 出 来 了。要 拿 到 好 的 结 果，假 设 抗 体 好 的 话 比 较 简 洁，抗 体 不 好 的 话 就 需 要 反 复 地 试 了，固 然 有 的 不 适 合 Western B lo t的 怎 样 做 也 不 行。所 以 拿 到 好 的 结 果 不 简 洁。N.做 组 织 样 品 的 w estern的 时 候，处 理 样 品 有 什 么 诀 窍 吗？还 有，您 用 过 大 牛 血 清 做 封 闭 剂 吗？浓 度 如 何？效 果 是 不 是 比 BSA好 一 点？解 答：必 需 进 展 研
21、磨、匀 浆、超 声 处 理，蛋 白 质 溶 解 度 会 更 好，离 心 要 充 分，膜 蛋 白 需 用 更 剧 烈 的 方 法 抽 提，低 丰 度 膜 蛋 白 可 能 还 要 分 步 抽 提（超 速 离 心）。还 有 一 点 就 是 组 织 中 的 蛋 白 酶 活 性 更 强，需 要 留 意 抑 制 蛋 白 酶 的 活 性（参 加 PM S F 和 蛋 白 酶 抑 制 剂 cocktail）,封 闭 剂 一 般 5%脱 脂 奶 粉 较 常 用。假 设 一 抗 为 多 克 隆 抗 体，使 用 BS A也 是 不 错 的 选 择。0.您 是 否 可 以 介 绍 一 下 大 分 子 量 蛋 白 20
22、0KD,在 做 w estern要 留 意 什 么 呢？解 答：做 200kd蛋 白 的 Western B lo t时 要 留 意，分 别 胶 最 好 选 择 7%的；剥 胶 时 要 留 神：转 移 时 间 需 要 相 应 延 长；要 做 分 子 量 参 照（否 则 消 灭 杂 带 不 知 道 如 何 分 析）。P.有 什 么 方 法 可 以 提 高 上 样 量？解 答：可 以 浓 缩 样 品；增 大 上 样 体 积 来 增 大 上 样 量。Q.我 要 检 测 的 目 的 蛋 白 是 分 子 量 或 许 为 4 2 k d的 膜 蛋 白，膜 蛋 白 提 取 可 不 行 以 不 用 到 超 速
23、 离 心 机，有 没 有 直 接 用 低 温 高 速 离 心 机 就 可 以 的 提 到 膜 蛋 白 的 方 法，4 2 k d的 蛋 白 分 子 量 算 不 算 大？解 答：如 是 需 要 提 取 膜 蛋 白，（而 不 是 只 需 要 提 取 膜 蛋 白），可 以 用 Ripa b u f f e r提 取 膜 蛋 白 和 胞 浆 蛋 白，用 这 个 做 Western B l o t就 可 以 了。假 设 是 非 要 只 提 取 膜 蛋 白 就 要 用 到 超 速 离 心 机。4 2 k d不 算 大，也 不 算 小，所 以，可 以 依 据 一 般 的 转 移 方 法 实 施。R.蛋 白
24、的 上 样 量 有 没 有 什 么 具 体 的 要 求？解 答：上 样 量 要 依 据 试 验 的 要 求 来 定，假 设 要 求 是 定 量 和 半 定 量 的 Western B l o t则 上 样 量 要 均 等，假 设 只 是 要 定 性，则 没 有 太 大 的 关 系，尽 量 多 上 就 行 了，但 是 不 要 超 过 0.3fl g/mm2 oS.一 抗，二 抗 的 比 例 是 否 重 要？解 答：比 较 重 要，调 整 好 一 抗，二 抗 的 比 例，可 以 去 掉 局 部 非 特 异 的 本 底。3.抗 体 T.做 细 胞 信 号 传 导，要 做 磷 酸 化 某 因 子 We
25、stern B l o t,其 二 抗 有 何 要 求？解 答：对 二 抗 无 要 求，要 看 你 试 验 条 件 来 选 择，一 般 推 举 用 HRP标 记 的 二 抗。U.同 一 公 司 的 另 外 抗 体 用 这 个 稀 释 度 做 出 来 效 果 很 好，所 以 没 做 预 试，怕 费 时 间，用 什 么 样 的 稀 释 度 比 较 好 呢？我 用 的 ELL+plus试 剂 盒 显 色。转 膜 过 夜，一 抗 孵 育 也 是 过 夜 的，假 设 封 闭 也 过 夜 的 话 就 要 四 天 才 看 的 到 结 果 了。解 答：不 同 抗 体，即 使 是 同 一 公 司 的 抗 体，其
26、 最 正 确 的 抗 体 稀 释 度 也 是 不 一 样 的，需 要 你 试 验 摸 索。我 觉 得 转 膜 过 夜 好 似 没 有 必 要 吧，转 膜 的 目 的 也 就 是 将 蛋 白 转 到 膜 上 就 行 啦，何 必 铺 张 时 间 呢。至 于 具 体 的 转 膜 时 间，还 要 看 你 的 目 的 蛋 白 分 子 量 的 大 小；转 膜 的 设 备，是 半 干式，还 是 湿 式。一 抗 固 然 可 以 过 夜，假 设 你 想 所 短 Western Blot时 间 的 话，可 以 增 高 一 抗 的 孵 育 温 度，我 们 试 验 室 一 般 3 7 度，两 小 时 就 足 够 了；
27、你 可 以 参 照 抗 体 说 明 书。至 于 一 抗 和 二 抗 得 稀 释 度，你 可 以 一 抗 1：1500；二 抗 1：20220试 试。另 外 建 议 你 洗 膜 时，多 洗 几 次，最 好 是 在 封 闭；一 抗 和 二 抗 后 至 少 是 5x5min,跑 一 张 好 膜 不 简 洁，多 尽 点 心 吧，这 样 不 会 铺 张 你 的 时 间，只 会 节 约 你 的 时 间！V.免 疫 组 化 和 Western Blot可 以 用 同 一 种 抗 体 吗？解 答：免 疫 组 化 时 抗 体 识 别 的 是 未 经 变 性 处 理 的 抗 原 打 算 簇（又 称 表 位），有
28、些 表 位 是 线 性 的，而 有 的 属 于 构 象 型；线 性 表 位 不 受 蛋 白 变 性 的 影 响，自 然 蛋 白 和 煮 后 的 蛋 白 都 含 有；构 象 型 表 位 由 于 受 蛋 白 空 间 构 造 限 制，煮 后 变 性 会 消 逝。假 设 你 所 用 的 抗 体 识 别 的 是 蛋 白 上 连 续 的 几 个 氨 基 酸，也 就 是 线 性 表 位，那 么 这 种 抗 体 可 同 时 用 于 免 疫 组 化 和 Western,而 假 设 抗 体 识 别 构 象 形 表 位，则 只 能 用 于 免 疫 组 化。一 般 抗 体 说 明 书 上 都 有 注 明 此 种 抗
29、体 识 别 的 氨 基 酸 区 间。（限 于 单 抗）W.Western Blot中 抗 体 的 重 复 应 用 问 题 解 答：抗 体 工 作 溶 液 一 般 不 主 见 储 存 反 复 使 用，但 是 如 抗 体 比 较 贵 重，可 反 复 使 用 2 3 次。稀 释 后 应 在 23 天 内 使 用，4 度 保 存，避 开 反 复 冻 融。4.滤 纸、胶 和 膜 的 问 题 X.NC膜 PVDF膜 尼 龙 膜 怎 样 鉴 别？解 答：尼 龙 膜 是 较 抱 负 的 核 酸 固 相 支 持 物，有 多 种 类 型；硝 酸 纤 维 素 膜 是 目 前 应 用 最 广 的 一 种 固 相 支
30、持 物，价 格 最 廉 价；PVDF膜 介 于 二 者 之 间。就 结 合 力 量 而 言：尼 龙 膜 结 合 DNA和 RNA力 量 可 达 480-600p g/cm2,可 结 合 短 至 10bp的 核 酸 片 段；硝 酸 纤 维 素 膜 结 合 DNA和 RNA力 量 可 达 80-100p g/cm2,对 于 200bp的 核 酸 片 段 结 合 力 量 不 强；PVDF膜 结 合 DNA和 RNA力 量 可 达 125300口 g/cm2.就 温 度 适 应 性 而 言：尼 龙 膜 经 烘 烤 或 紫 外 线 照 耀 后，核 酸 中 的 局 部 嗦 噬 碱 基 可 与 膜 上 的
31、正 电荷 结 合；硝 酸 纤 维 素 膜 依 靠 疏 水 性 相 互 作 用 结 合 DNA,结 合 不 结 实；PVDF膜 结 合 结 实，耐 高 温，特 别 适 合 于 蛋 白 印 迹。就 韧 性 而 言：尼 龙 膜 较 强；硝 酸 纤 维 素 膜 较 脆，易 裂 开；PVDF膜 较 强。就 重 复 性 而 言：尼 龙 膜 可 反 复 用 于 分 子 杂 交，杂 交 后，探 针 分 子 可 经 碱 变 性 被 洗 脱 下 来；硝 酸 纤 维 素 膜 不 能 重 复 使 用：PVDF膜 可 以 重 复 使 用。Y.在 做 Western B l o t时，PBDF膜 用 甲 醇 浸 泡 的
32、目 的？解 答：PVDF膜 用 甲 醇 泡 的 目 的 是 为 了 活 化 PVDF膜 上 面 的 正 电 基 团，使 它 更 简 洁 跟 带 负 电 的 蛋 白 质 结 合，做 小 分 子 的 蛋 白 转 移 时 多 加 甲 醇 也 是 这 个 目 的。Z.检 测 磷 酸 化 的 JN K和 非 磷 酸 化 的 JN K可 以 在 同 一 张 膜 上 吗？解 答：可 以。A A.转 膜 后 经 丽 春 红 染 色 的 条 带，为 什 么 大 蛋 白 分 子 的 一 端（即 点 样 空 的 一 侧）的 转 膜 好 象 不 是 很 好，为 什 么？解 答：这 是 正 常 的，大 分 子 的 蛋
33、白 转 移 的 慢，你 延 长 转 移 时 间 和 电 流，大 分 子 一 端 就 会 好 的 多，但 是 小 分 子 的 就 有 可 能 会 变 淡。B B.我 想 问 您 裂 解 细 胞 用 三 去 污 裂 解 法，还 是 用 上 样 缓 冲 液？解 答：用 上 样 缓 冲 液，这 样 有 几 个 好 处，可 以 提 取 总 蛋 白，同 时 又 可 以 让 磷 酸 化 酶 失 活。C C.承 受 tank s y s te m 有 什 么 讲 究？解 答：建 议 低 电 压，长 时 间，（一 般 tank S y ste m用 衡 压 好 点），如 28V 1 4-1 6 h rsD D.
34、做 HSP WESTEN定 量，同 样 的 抗 体 免 疫 组 化 能 做 出,而 WESTEN却 不 能？解 答：这 多 半 是 抗 体 的 问 题，要 看 抗 体 的 说 明，是 否 能 做 Western B l o t和 IHC。E E.膜 一 般 要 如 何 处 理？解 答：一 般 用 甲 醇 泡 泡 就 可 以 了。F F.假 设 是 6 X 8 转 印 膜，要 加 多 少 一 抗？解 答：一 抗 的 稀 释 度 是 有 说 明 的，依 据 你 的 一 抗 看 看 就 知 道 了，但 是 那 么 大 的 膜 孵 育 体 积 一 般 最 少 为 3 5ml。G G.上 下 槽 缓 冲
35、 液 有 何 要 求，怎 样 才 能 到 达 最 正 确 效 果。解 答：无 要 求。H H.跑 电 泳 的 时 候 配 的 胶 总 是“缩”是 什 么 缘 由 呢？是 有 的 成 分 不 对 吗？解 答：没 什 么 问 题，就 是 你 胶 里 的 水 分 被 蒸 发 了。过 夜 时 拿 保 鲜 膜 包 起 来，在 里 面 加 点 水 保 持 湿 度 就 可 以 了。假 设 过 夜，胶 里 的 水 分 被 蒸 发，承 受 保 鲜 膜 包 上 也 可 以；也 可 能 母 液（3 0%聚 丙 酰 胺）有 问 题，你 可 以 重 配 制 一 份 观 看；能 够 替 换 的 试 剂，尽 量 换 一 下
36、，选 用 好 的 试 剂，避 开 找 问 题 麻 烦。脱 色 液 中 甲 醇 的 含 量 太 高 也 会 造 成 胶 缩。I I.膜、滤 纸、胶 大 小 有 何 讲 究？解 答：假 设 是 用 的 是 半 干 转，挨 次 为：阴 极 一 滤 纸 一 胶 一 膜 一 滤 纸。滤 纸 的 长 宽 分 别 比 胶 小 l 而 膜 的 长 宽 分 别 比 胶 大 确 定 禁 忌：上 下 两 层 滤 纸 由 于 过 大 而 相 互 接 触，这 样 会 短 路，电 流 不 会 通 过 胶 和 滤 纸。J J.蛋 白 质 的 分 子 量 跨 度 很 大，如 要 分 别 小 2 1 K D,中 至 6 6 K
37、 D,大 至 1 7 0 K D,可 以 一 次 做 好 吗？解 答：这 么 广 的 分 布 不 好 转 移，一 般 建 议：2 1 k d和 6 6 k d可 以 一 起 转，1 2%S D S-,湿 转 36V，3-5 h r s 就 可 以 了，可 以 依 据 你 试 验 室 的 阅 历 调 整；1 7 0 k d用 7%SDS-,4 8VlO h r s _ 1 6 h r soKK.不 能 很 好 地 将 大 分 子 量 蛋 白 转 移 到 膜 上，转 移 效 率 低 怎 么 样 解 决？解 答：可 以 考 虑：转 移 缓 冲 液 中 参 加 20%甲 醇（是 指 终 浓 度）（优
38、化 的 转 移 缓 冲 液，可 以 参 考 蛋 白 质 技 术 手 册），由 于 甲 醇 可 降 低 蛋 白 质 洗 脱 效 率，但 可 增 加 蛋 白 质 和 N C 膜 的 结 合 力 量，甲 醇 可 以 防 止 凝 胶 变 形，甲 醇 对 高 分 子 量 蛋 白 质 可 延 长 转 移 时 间；转 移 缓 冲 液 参 加 终 浓 度 0.1%SDS,也 是 为 了 增 加 转 移 效 率；用 优 质 的 转 移 膜，或 使 用 小 孔 径 的 NC膜（0.2微 米）；使 用 戊 二 醛 交 联；低 浓 度 胶，如 低 至 6%。太 大 时 还 可 以 考 虑 用 琼 脂 糖 胶；提 高
39、转 移 电 压/电 流；增 加 转 移 时 间。LL.如 何 选 择 最 适 宜 的 蛋 白 杂 交 膜？解 答：蛋 白 质 印 迹 杂 交 是 分 子 生 物 学 试 验 中 极 为 常 用 的 一 门 技 术。选 择 质 量 上 层、符 合 要 求、便 利 适 用 的 杂 交 膜 是 打 算 这 项 试 验 成 败 的 重 要 环 节。依 据 杂 交 方 案、被 转 移 生 物 大 分 子 的 特 性 以 及 分 子 大 小 等 等 因 素，我 们 要 量 体 裁 衣，从 杂 交 膜 的 材 质、孔 径 和 规 格 上 都 要 做 出 合 理 的 选 择。硝 酸 纤 维 素 膜：硝 酸 纤
40、 维 素 膜 是 蛋 白 印 迹 试 验 的 标 准 固 相 支 持 物。在 低 离 子 转 移 缓 冲 液 的 环 境 下，大 多 数 带 负 电 荷 的 蛋 白 质 会 与 硝 酸 纤 维 素 膜 发 生 疏 水 作 用 而 高 亲 和 力 的 结 合 在 一 起，虽 然 这 其 中 的 机 制 还 不 是 格 外 清 楚，但 由 于 硝 酸 纤 维 素 膜 的 这 个 特 性，而 且 易 于 封 闭 非 特 异 性 结 合，从 而 得 到 了 广 泛 的 应 用。在 非 离 子 型 的 去 污 剂 作 用 下，结 合 的 蛋 白 还 可 以 被 洗 脱 下 来。依 据 被 转 移 的 蛋
41、 白 分 子 量 大 小，要 选 择 不 同 孔 径 的 硝 酸 纤 维 素 膜。由 于 随 着 膜 孔 径 的 不 断 减 小，膜 对 低 分 子 量 蛋 白 的 结 合 就 越 结 实。但 是 膜 孔 径 假 设 小 于 0.1mm,蛋 白 的 转 移 就 很 难 进 展 了。因 此，我 们 通 常 用 0.45p m 和 0.2|j m 两 种 规 格 的 硝 酸 纤 维 素 膜。大 于 20kD的 蛋 白 就 可 以 用 0.45口 m 的 膜，小 于 20kD的 蛋 白 就 要 用 0.2|j m 的 膜 了，假 设 用 0.45口 m 的 膜 就 会 发 生 Blowthrop g
42、h”的 现 象。从 膜 的 质 地 上 来 看，最 重 要 的 指 标 就 是 单 位 面 积 上 能 够 结 合 的 蛋 白 的 量。硝 酸 纤 维 素 膜 的 结 合 力 量 主 要 与 膜 的 硝 酸 纤 维 素 的 纯 度 有 关，市 场 上 有 些 硝 酸 纤 维 素 膜 通 常 会 还 有 大 量 的 醋 酸 纤 维 素，因 而 降 低 了 蛋 白 的 结 合 量。S&S公 司 承 受 的 是 1 00%纯 度 的 硝 酸 纤 维 素，保 证 了 最 大 的 蛋 白 结 合 量，可 达 80-150p g/cm2o由 于 100%的 纯 度,因 而 也 大 大 削 减 了 非 特
43、异 性 的 结 合，降 低 杂 交 背 景，无 需 高 严 谨 度 的 洗 脱 步 骤。其 次，膜 的 强 度 和 韧 性 也 是 需 要 考 虑 的 因 素。常 规 的 硝 酸 纤 维 素 膜 比 较 脆，漂 洗 一 两 次 就 会 破 损，不 能 反 复 使 用。PVDF转 移 膜：PVDF是 一 种 高 强 度、耐 腐 蚀 的 物 质，通 常 是 用 来 制 造 水 管 的。PVDF膜 可 以 结 合 蛋 白 质，而 且 可 以 分 别 小 片 段 的 蛋 白 质，最 初 是 将 它 用 于 蛋 白 质 的 序 列 测 定，由 于 硝 酸 纤 维 素 膜 在 Edman试 剂 中 会 降
44、 解，所 以 就 查 找 了 PDVE作 为 替 代 品，虽 然 PDVF膜 结 合 蛋 白 的 效 率 没 有 硝 酸 纤 维 素 膜 高，但 由 于 它 的 稳 定、耐 腐 蚀 使 它 成 为 蛋 白 测 序 抱 负 的 用 品，始 终 沿 用 至 今。PVDF膜 与 硝 酸 纤 维 素 膜 一 样，可 以 进 展 各 种 染 色 和 化 学 发 光 检 测，也 有 很 广 的 适 用 范 围。这 种 PVDF膜，灵 敏 度、区 分 率 和 蛋 白 亲 和 力 在 精 细 工 艺 下 比 常 规 的 膜 都 要 高，格 外 适 合 于 低 分 子 量 蛋 白 的 检 测。但 PVDF膜 在
45、 使 用 之 前 必 需 用 纯 甲 醇 进 展 浸 泡 饱 和 1-5秒 钟。离 子 交 换 型 转 移 膜：硝 酸 纤 维 素 和 PVDF膜 是 靠 疏 水 作 用 结 合 蛋 白 的，还 有 一 类 膜 是 依 据 离 子 交 换 的 方 式 结 合 生 物 大 分 子 的。由 DEAE(二 乙 氨 乙 基)修 饰 的 纤 维 素 制 成 的 DEAE阴 离 子 交 换 膜 同 样 可 以 作 为 蛋 白 质 印 迹 的 固 相 支 持 物。DEAE可 以 有 效 的 结 合 阴 离 子 基 团，包 括 那 些 高 于 其 等 电 点 的 蛋 白 质。在 PH10以 下，DEAE基 团
46、 都 能 带 电 荷，在 低 离 子 强 度 的 转 移 液 中 结 合 蛋 白 分 子。其 最 适 的 p H 环 境 为 5-7 DEAE膜 可 以 用 于 蛋 白 多 糖、病 毒、酶 以 及 血 红 蛋 白 的 争 辩。这 种 0.45/m孔 径 的 DEAE膜，除 了 可 以 做 Western Blotting外，还 可 以 用 于 核 酸 结 合 争 辩。还 有 一 种 离 子 交 换 型 膜 是 竣 甲 基(CM)修 饰 的 纤 维 素 膜，它 可 以 结 合 蛋 白 和 多 肽 分 子，以 及 其 他 的 一 些 带 正 电 荷 的 样 品，最 适 结 合 p H 范 围 在
47、4-7。结 合 的 多 肽 分 子 可 以 从 C M 膜 上 洗 脱 下 来，用 于 氨 基 酸 系 列 分 析 或 微 测 序。5.Marker的 相 关 疑 问 MM.我 用 的 是 可 视 marker(BIO,RAD)，但 是 电 泳 总 跑 不 全 8 条 带，请 问 什 么 缘 由？怎 样 改 善？胶 用 过 8%,10%,1 2%,都 是 这 样。marker是 买 的。解 答：一 般 来 说，是 小 分 子 量 Marker跑 走 了，增 加 胶 浓 度 或 削 减 电 泳 时 间 试 试 看。固 然 梯 度 胶 也 是 不 错 的 选 择。NN.用 的 是 Roche mo
48、lecular Biochemicals 公 司 的 由 lOOkd,75kd,45kd,30kd,20kd,1Okd组 成 的 marker 开 头 做 Western Blot时 还 能 够 看 到 marker,固 然 也 仅 能 观 察 其 中 最 多 三 条 带。用 80V进 展 SDS-电 泳，用 恒 压 10V45min转 印 的。前 几 次 做 Western Blot时 没 有 进 展 丽 春 红 染 色，但 尽 管 用 了 此 方 法 也 仅 能 看 到 marker有 一 条 大 约 是 3OKD的 条 带 消 灭。再 就 是 把 70KI)和 130KD两 个 目 的
49、蛋 白 同 时 在 一 块 胶 上 进 展 分 析，用 培 育 基 样 品 进 展 分 析，没 有 用 间 接 法，而 是 直 接 用 融 合 蛋 白 C 端 的 V 5 表 位 的 酶 联 抗 体(Anti-V5-HRP),但 就 是 出 不 来 结 果，我 很 茫 然。感 谢 您 过 赐 予 教 导！解 答：1、“我 用 的 是 Roche molecular Biochemicals 公 司 的 由 lOOkd,75kd,45kd,30kd,2Okd,lOkd组 成 的 marker。开 头 做 Western Blot时 还 能 够 看 到 marker,固 然 也 仅 能 观 察 其
50、 中 最 多 三 条 带。”有 的 时 候，Prestained Marker放 久 了 效 果 就 会 变 差，电 泳 是 条 带 不 清 楚，集 中。但 是 你 的 问 题 可 能 还 有 其 他 的 方 面 的 问 题，可 能 是 蛋 白 跟 膜 结 合 的 不 严 密。转 移 是 多 加 点 甲 醇。2、“前 几 次 做 Western Blot时 没 有 进 展 丽 春 红 染 色，但 尽 管 用 了 此 方 法 也 仅 能 看 到 marker有 一 条 大 约 是 30KD的 条 带 消 灭。”转 移 时 半 干 法 建 议 用 恒 流，你 这 样 的 也 就 30kd-50kd