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1、分子克隆技术质粒 DNA 和 DNA 插入片段的制备、连接反响以及重组质粒的转化克隆Clone是指通过无性生殖过程所产生的与亲代完全一样的子代群体。分子克隆Molecular Cloning是指由一个祖先分子复制生成的和祖先分子完全一样的分子群，发生在基因水平上的分子克隆 称基因克隆DNA 克隆。其根本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因外源基因组装到细菌质粒质粒是细菌染色体外的双链环 状 DNA 分子中，再将这种质粒重组质粒转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的 相应多肽或蛋白质。由于质粒具有不相容性，即同一类群的不同质粒 常不能在同一菌株内稳定共存
2、，当细胞分裂时就会分别进入到不同的 子代细胞中，所以来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒 复制出的外源基因也就是一个分子克隆。一质粒 DNA 的制备质粒是存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环DNA 分子， 它能赐予细菌宿主细胞某些特定的遗传表型。质粒并非细菌生长 所必需，但由于其编码一些对宿主细菌有利的酶类，从而使宿主细菌 具有抵抗不利自身生长的因素如抗药性等的力量。目前觉察的质粒主 要分为 F 质粒性质粒，R 质粒抗药性质粒，E.coli 质粒大肠杆菌肠毒素养粒。依据质粒在一个细胞周期内产生拷贝的数量，可 将质粒分为严紧型低拷贝，复制 1-2 次和松弛型高拷贝，复制10-200
3、次。由于质粒的不相容性细菌经分裂后就只留下了拷贝数较高的一种质粒，例如 R1 和 R2 两种抗药性质粒同属于一类，由于不相容性使它们不能共存于同一细菌中，但不同类群的质粒可以在一个细 菌中共存。质粒存在于细菌中，所以制备质粒 DNA 时，首先应将含有质粒的细菌在含有相应抗生素的液体培育基中生长至对数期,使质粒在细菌中得到扩增。通过离心收集细菌，经碱裂解细菌，使质粒和细菌染色体DNA 变性，然后再加中和液，使溶液 PH 值恢复到中性，这样质粒 DNA 又可以复性至自然双链构象状态，而细菌染色体DNA 不能或很难复性所以仍处在变性状态，这些变性的染色体 DNA 与变性蛋白质缠绕在一起， 易被离心去
4、处，而质粒 DNA 仍存在于水相中，再用无水乙醇沉质粒DNA，最终经离心即可得到质粒 DNA。二DNA 插入片段的制备DNA 插入片段是指我们所要争论或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得 DNA 插入片段是分子克隆过程中的第一步。目前有几种方法，如限制性内切酶直接分别法、文库筛选法、体外扩增法、人工合成法等，下面以逆转录 -DNA 聚合酶链式反响为例介绍获得外源基因 DNA 插入片段的方法。1、逆转录反响所谓逆转录，就是以 mRNA 为模板合成一条互补 DNA 链(即cDNA)的过程，在逆转录反响中所用的是逆转录酶，即以RNA 为模板的 DNA 聚合酶，它也具有 5-3DNA 聚合酶
5、活性，在合成的核苷酸链时也需要引物。由于真核基因组 DNA 由内含子和外显子组成，内含子不编码蛋白质，因此体外扩增基因组 DNA 会给某些争论造成困难，以 mRNA 为模板的基因扩增可避开这种问题的发生，因此从某种意义上来说，逆 转录反响更具有用性。制备cDNA 时，首先要从细胞中提取mRNA，以mRNA 为模板， 在 mRNA 的 poly(A)尾上结合 12-18 个寡聚dT片段作为合成的起始引物，在逆转录酶的作用下合成第一条cDNA 链。然后用 RNA 酶消化 DNA-RNA 杂交链中的 RNA，剩下的单链 DNA 的 3端往往有自发回折形成的发夹构造，正好可以作为合成其次条DNA 链的
6、引物。其次条 DNA 链的合成可以用 DNA 聚合酶，也可以用逆转录酶。双链DNA 合成后，用S1 核酸酶切去发夹构造，即获得平端的双链cDNA。2、DNA 聚合酶链式反响PCRPCR 技术是在模板DNA、引物和4 种脱氧核糖核酸存在下，DNA 聚合酶催化的一种体外酶促反响。PCR 技术的特异性取决于引物和模板 DNA 结合的特异性。反响由三个步骤组成：1、变性：通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，双链 DNA 解离成单链 DNA；2、退火：当温度突然降低时，使含量远远多于模板 DNA 的引物与模板 DNA 在局部形成杂交双链；3、延长：在 4 种 dNTP 底物和 Mg2+存在的条件下，D
7、NA 聚合酶由 5”-3”方向合成的与模板 DNA 互补的 DNA 链。以上反响为一个循环，通常进展 25-30 个循环，由此介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到大量复制，数量可达 2107-8 拷贝。PCR 引物打算 PCR 的特异性，引物的设计就显得尤为重要。下面以 DNA 序列设计引物为例介绍设计引物应考虑的几个方面：1、GC 比值：众所周知,碱基对中的 GC 之间有三条氢键，AT 之间有两条氢键，GC 和 AT 在引物序列中的合理比例是设定 PCR 中退火温度的重要依据。通常在一个引物中 GC 和 AT 各半即可。2、长度：通常 15-20bp 即可。由于目的不同，有时引物长些，
8、但太短会影响引物的特异性。3、方向：设计出的引物永久是 5”-3”方向,所以正向引物是与一股模板 DNA 序列相全都的，而反向引物则与这股模板 DNA 序列相互补。4、酶切位点：假设想克隆所放大的 DNA 片段，通常在引物的 5” 端设计适当的限制性酶切位点，使进一步的克隆工作更简洁。一对引 物可用一种或两种酶切位点，这取决于设计者，两种不同的酶切位点 使克隆具有方向性。5、启始和终止密码：假设想表达所放大的 DNA 片段，所用的克隆载体又不含启始密码和终止密码，应将其设计在引物的酶切位点之 后，特异性 DNA 序列之前。6、其它：假设表达的融合蛋白用亲合层析方法纯化，可将必要的序列设计在引物
9、中以使所表达的融合蛋白易于纯化。【易生物找仪器、试剂、效劳，尽在易生物 ebioe 】三连接反响将载体质粒 DNA 和外源基因 DNA 在 DNA 连接酶的作用下，双链 DNA 片段相邻的 5”端磷酸与 3”端羟基之间形成磷酸二酯键，形成重组质粒，这是分子克隆技术的核心步骤。在连接反响进展之前，质粒 和外源基因 DNA 分别用同样的限制性内切酶消化，使它们成为含有同样粘性末端或钝端的线性 DNA，这是连接成功的先决条件。下面介绍连接反响的程序。1、模板 DNA 的预备在进展 DNA 重组以前，通常要先将 DNA 分子用限制性内切酶消化，使两种 DNA 分子的末端产生一样的粘性末端或平齐末端。通
10、常按以下比例进展：1. 双蒸溜水 适量2. 10 酶缓冲液 1/10 容量3. DNA 多少 l4. 限制性内切酶 1/10 容量每微克 DNA 用 1-10 单位 总容量依据 DNA 分子量来确定，通常 10-100l。混合后 37温育 30-120min。2、连接反响在 DNA 连接酶的作用下，将外源基因DNA 片段和线性质粒DNA 连接起来构成重组质粒的过程。通常按以下比例进展：1. 双蒸溜水 适量2. 10 酶缓冲液 1/10 容量3. 质粒 DNA 适量4. DNA 插入片段 适量5. 限制性内切酶 1/10 容量(每微克 DNA 用 1-10 单位) 总容量依据 DNA 分子量来确
11、定，通常 10-20l。混合后置 14-16水浴 6-12 小时。留意通常 DNA 插入片段的量是载体 DNA 的 3 倍，这需依据 DNA 分子量计算，而不取决于浓度。四重组质粒的转化DNA 插入片段和质粒 DNA 在体外连接形成重组质粒后，需要被导入到细胞内才能进展扩增和表达。承受重组DNA 分子的细胞称作受体细胞或宿主细胞。受体细胞分为原核细胞如大肠杆菌和真核细 胞如酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞。原核细胞即可作为基因复 制扩增的场所，也可作为基因表达的场所；真核细胞一般用作基因表 达系统。 般 将 重 组DNA分 子 导 入 原 核 细 胞 的 过 程 称 为 转 化transforma
12、tion，而将重组DNA 分子导入真核细胞的过程称为转染transfection。1、感受态细胞的制备未经处理的大肠杆菌很难过纳重组 DNA 分子，但当将大肠杆菌用物理或化学方法处理后，细胞对摄取外来DNA 分子变得敏感了，这种经过处理而简洁承受外源 DNA 分子的细胞叫做感受态细胞competent cell。将重组 DNA 分子和感受态大肠杆菌细胞相混合，使 DNA 分子进入大肠杆菌细胞中，实现了重组 DNA 分子的转化。受体细胞是重组基因增殖的场所，对受体细胞也应具有几个要求：1简洁接纳重组DNA 分子；2对载体的复制扩增无严格限制；3不存在特异的内切酶体系降解外源 DNA；4不对外源D
13、NA 进展修饰。由于载体的不同，所具备的筛选标志不同，所用的受体细胞也不同，因此可依据所用的载体选择适宜的受体细胞。将大肠杆菌放入低渗的CaCl2溶液中，使细胞处于膨胀状态，从而获得大肠杆菌感受态细胞，4可保存 1-2 周，假设需长期保存，可加甘油至终浓度为 15%，置-70备用。2、转化将重组质粒置于感受态细胞溶液中，使重组质粒吸附于感受态细 胞的外表，冰浴一段时间，细胞膜处于收缩状态。然后快速将感受态 细胞置于 42，使细胞在热环境中膜通道开放，重组质粒由膜外高浓度区向膜内集中，经过 45 秒时间后，再将感受态细胞放回冰浴中，膜通道关闭，重组质粒转入大肠杆菌。 3、转化细胞的筛选和菌株的保
14、存（1） 转化细胞的筛选作为载体的质粒都含有一种或两种 抗生素的耐药基因，当把这种质粒转入大肠杆菌后，此菌便获得了抵抗这种抗生素的力量。目前分子克隆所用的克隆载体多含氨苄青霉素的耐药基因，所以涉及最多的是氨苄青霉素筛选。当将氨苄青霉素参加培育基中后，只有含质粒的细菌能够生存,而不含质粒的细菌则死亡。另外，在某些质粒中含有 LacZ 基因，多克隆酶切位点位于 LacZ 基因内部，当没有外源基因插入 LacZ 基因中时，LacZ 基因的启动子可使此基因编码半乳糖甘酶，从而催化底物 X-gal 发生化学反响，菌落变成蓝色；当外源基因与质粒发生连接时，LacZ 基因失活，菌落呈白色，同时该质粒还含有氨苄青霉素耐药基因，依据此特性，白色菌 落含有重组质粒。（2） 质粒和菌株的保存质粒可以在-20冰冻长期保存。菌株可在含 20-50%甘油培育液中-20或-70保存。易生物试验技术频道 - 生物试验技术资料库！