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1、DNA 提取过程中各种试剂的作用及原理 1溶液 I 溶菌液：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1,4糖苷键，因而具有 溶菌的作用。当溶液中 pH小于 8 时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止 DNA 受机械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合 Mg2、Ca2等金属离子，抑制 脱氧核糖核酸酶对 DNA 的降解作用（DNase 作用时需要一定的金属离子作 辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。2溶液 II NaOH SDS液：NaOH：核酸在 pH大于 5，小于 9 的溶液中，是稳
2、定的。但当 pH 12 或 pH 3 时，就会引起双链之间 氢键的解离 而变性。在溶液 II 中的 NaOH 浓度为 0.2mo1 L，加抽提液时，该系统的 pH就高达 12.6，因而促使染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性。SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚 细胞中的 核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为 R-O-SO3-R-蛋白质的复合物，使 蛋白质变性而沉淀 下来。但是 SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用 RNase 去除 RNA 时）受到
3、干扰。3.溶液 III-3mol L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc 的水溶液呈碱性，为了调节pH至 4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是 NaAc-HAc 的缓冲液。用 pH4.8 的 NaAc溶液是为了把 pH12.6的抽提液，调回 pH至中性，使变性的质粒 DNA 能够复性，并能稳定存在。而高盐的 3mol L NaAc 有利于变性的大分子染色体 DNA、RNA以及 SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与 SDS 蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。4 为什么用无水乙醇沉淀 DNA？用无
4、水乙醇沉淀 DNA，这是实验中最常用的沉淀 DNA 的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对 DNA 很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA 溶液是 DNA 以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去 DNA 周围的水分子，使 DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加 2 倍体积的无水乙醇与 DNA相混合，其乙醇的最终含量占 67左右。因而也可改用 95乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比 95乙醇昂贵）。但是加 95的乙醇使总体积增大，而 DNA 在溶液中有一定程度的溶解，因而 DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀
5、 DNA时可用95乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用 0.6 倍体积的异丙醇选择性沉淀 DNA。一般在室温下放置 15 30 分钟即可。5在用乙醇沉淀 DNA时，为什么一定要加 NaAc 或 NaCl 至最终浓度达 0.1 0.25mol/L？在 pH为 8 左右的溶液中，DNA 分子是带负电荷的，加一定浓度的 NaAc或 NaCl，使 Na+中和 DNA 分子上的负电荷，减少 DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成 DNA 钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分 DNA 形成 DNA 钠盐而聚合，这样就造成 DNA 沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时
6、，其效果也不好。在沉淀的 DNA 中，由于过多的盐杂质存在，影响 DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。6加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用 SDS与 KAc来处理？加进去的 RNase 本身是一种蛋白质，为了纯化 DNA，又必须去除之，加 SDS可使它们成为 SDS-蛋白复合物沉淀，再加 KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的 SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除 RNase。在溶液中，有人以 KAc代替 NaAc，也可以收到较好效果。7为什么在保存或抽提 DNA 过程中，一般采用 TE缓冲液？在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考
7、虑 DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa 7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作 DNA 的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与 Ca2产生 Ca3(PO4)2 沉淀，在 DNA 反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用 Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是 TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存 DNA 时，大都采用 Tris-HCl 系统，而 TE缓冲液中的 EDTA 更能稳定。氯仿的作用主要是使蛋白变
8、性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇的作用是消除抽提过程中出现的泡沫。氯仿是强蛋白质变性剂，抑制 RNA 酶的活性，除去蛋白质污染。切力作用而降解螯合等金属离子抑制脱氧核糖核酸酶对的降解作用作用时需要一定的金属离子作辅基的存在有利于溶 会引起双链之间氢键的解离而变性在溶液中的度为加抽提液时该系统的就高达因而促使染色体与质粒的变性是离子型 质结合成为蛋白质的复合物使蛋白质变性而沉淀下来但是能抑制核糖核酸酶的作用所以在以后的提取过程中必须把它基因组 DNA-CTAB 法 CTAB 法原理(植物 DNA 提取经典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十
9、六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性.在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl),CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.注:CTAB溶液在低于 15 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于 15.基因组 DNA-CTAB 法 CTAB 提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;EDTA 螯合 Mg2+或 Mn2+离子,抑制 DNase 活性;NaCl
10、提供一个高盐环境,使 DNP 充分溶解,存在于液相中;CTAB 溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除 基因组 DNA-CTAB 法 CTAB 提取缓冲液的改进配方 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少 DNA 中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖.基因组 DNA 的提取核酸分离,纯化采用吸附材料吸附的方式分离 DNA时,应提供相应的缓冲体系采用有机(酚/氯仿)抽提时应充分混匀,但动作要轻柔离心分离两相时,应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点,在提取过程中辅以相
11、应的去杂质的方法基因组 DNA 的提取核酸分离,纯化 蛋白质的去除:酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS,异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离,纯化 多糖的去除:高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的 5M NaCl,高盐可溶解多糖.用多糖水解酶将多糖降解.在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2 体积),氯苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖.用 PEG8000 代替乙醇沉淀 DNA:在 500 L DNA 液中加入 200l 20%PEG8000(含 1.2 M NaCl),冰浴20min.核酸分离,纯化 多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:-巯基乙醇,抗坏血酸,
12、半胱氨酸,二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂:如 PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇),它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与 DNA 的结合 盐离子的去除:70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸,其它的杂质均被洗掉,达到纯化 DNA的目的另一种方式加入 1/10 体积的NaAc(pH5.2,3M),用预冷的乙醇或异丙醇沉淀 RNA 吸附或沉淀后应用 70%的乙醇洗涤,以除去盐离子等若长期储存建议使用 TE 缓冲液溶解 TE 中的 EDTA 能螯合Mg2+或 Mn2+离子,抑制 DNasepH值为 8.0,可防止 DNA 发生酸解。基因组 DNA 提取常见问题 切
13、力作用而降解螯合等金属离子抑制脱氧核糖核酸酶对的降解作用作用时需要一定的金属离子作辅基的存在有利于溶 会引起双链之间氢键的解离而变性在溶液中的度为加抽提液时该系统的就高达因而促使染色体与质粒的变性是离子型 质结合成为蛋白质的复合物使蛋白质变性而沉淀下来但是能抑制核糖核酸酶的作用所以在以后的提取过程中必须把它DNA 中含有蛋白,多糖,多酚类杂质 DNA 在溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反应 DNA 中残留有金属离子有 RNA 的存留原因对策重新纯化 DNA,过吸附柱去除蛋白,多糖,多酚等杂质重新沉淀 DNA,让酒精充分挥发增加 70%乙醇洗涤的次数(2-3 次)加入 RNase 降解 RN
14、A 问题一:DNA 样品不纯,抑制后续酶解和 PCR反应.DNA提取常见问题材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈,DNA 被机械打断外源核酸酶污染反复冻融。尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的 DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌将 DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融 问题二:DNA降解.DNA提取常见问题实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附或沉淀不完全洗涤时 DNA丢失。尽量选用新鲜(幼嫩)的材料动植物要匀浆研磨充分;G+菌,酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁.高温裂解时,时间适当延长(对于动物细胞,细菌可增加 PK的用量).增加吸附的时间,或低温沉淀小心操作 问题三:DNA提取量少.切力作用而降解螯合等金属离子抑制脱氧核糖核酸酶对的降解作用作用时需要一定的金属离子作辅基的存在有利于溶 会引起双链之间氢键的解离而变性在溶液中的度为加抽提液时该系统的就高达因而促使染色体与质粒的变性是离子型 质结合成为蛋白质的复合物使蛋白质变性而沉淀下来但是能抑制核糖核酸酶的作用所以在以后的提取过程中必须把它