《免疫沉淀、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《免疫沉淀、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀.docx（20页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、免疫沉淀是指用抗体把抗原(包括单体、复合物)沉淀下来，是一种抗原纯化、浓集 的方法；免疫共沉淀指用抗体把抗原复合物沉淀下来，常用来讨论蛋白质的相互作用免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP )免疫沉淀是采用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或 表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G ( ProteinA/G )或二抗偶联的agaose或 Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀 经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min ,在高温及还原剂的作用下，抗原与 抗体解离，离心收集上清，上清中包括
2、抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。基本试验步骤(1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上或者4。(：裂解 30min, 12,000g 离心 30 min 后取上清；(2 )取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将lMg相应的抗体和 10-50 pl protein A/G-beads加入到细胞裂解液,4。(：缓慢摇摆孵育过夜；(3 )免疫沉淀反应后，在4。(2以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离 心至管底；将上清当心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最终加入 15口1的2xSDS加
3、样缓冲液,沸水煮10分钟;(4 ) SDS-PAGE, Western blotting 或进行质谱分析。一、样品处理: 酶肽（Leupeptin ）（用H20配制成lmg/ml的储存液，分装，-20。（：保存）抑蛋白酶肽 （Aprotinin ）（用H20配制成lmg/ml的储存液，分装，-20保存）胃蛋白酶抑制剂 （Pepstatin ）（用甲醇配制成lmg/ml的储存液,分装,-2CTC保存）RIPA磷酸（酯）酶抑制剂激活的 Na3V04 （用 H20 配制成200mM 的储存液，见 Sodium Orthovanadate Activation Protoco ）NaF （ 200mM
4、的储存液，室温保存）留意：在预备做磷酸（酯）酶试验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂工作液配制：配制 100ml 的 modified RIPA buffe :1 .称取790mg的Tris-Base ,加到75ml去离子水中,加入900mg的NaCI ,搅拌, 直到全部溶解，用HCI调整PH值至I7.4 2.加10 ml 10%的NP-403 .加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清4 .加1 ml 100mM的EDTA ,用量筒定容到100ml , 2-8保存5 .理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应当在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶 肽，胃蛋白酶抑制齐IJ各100 pl; PM
5、SF, Na3VO4, NaF各500 pl ），但是PMSF在水溶液中 很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应当在使用前现加，其他抑制剂成分可以在 水溶液中稳定5天。各种成分在工作液中的终浓度：*Tris-HCI: 50 mM, pH 7.4* NP-40: 1%*去氧胆酸钠：0.25%* NaCI: 150 mM* EDTA: 1 mM* PMSF: 1 mM* 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽肩蛋白酶抑制剂:各1 pg/ml* Na3VO4:1 mM* NaF: 1 mM三、试验流程为：(1)转染后24-48 h可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰 上裂解30min,细胞
6、裂解液于4 ,最大转速离心30 min后取上清；(2 )取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加lpg相应的抗体加入到细胞裂解液，4缓慢摇摆孵育过夜；(3 )取lOpI protein A琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3,000 rpm离心 3 min ;(4 )将预处理过的10|jl protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中 4缓慢摇摆孵育2-4h ,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；(5 )免疫沉淀反应后，在以3,000 rpm速度离心3 min ,将琼脂糖珠离心至管 底；将上清当心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3 - 4次;最终加入
7、15|jl的2xSDS 样缓冲液，沸水煮5分钟；(6 ) SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白1 .用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培育板上的相宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml 冰冷的EBC裂解缓冲液中。2 .将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4。(：以最大速度离心 15 min03收集上清约30 ml/加入30pg的适当抗体,4摇动免疫沉淀物1 ho4加 入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose悬液，4摇动免疫沉淀物30 mino5 .用含900 mmol/L NaCI的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物
8、,再重复洗5次。 最终，用NETN洗一次。6 .吸出混合物的液体部分。加入800pl的lxSDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸 4 min07 .将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下 电泳过夜。8 .通过考马斯蓝染色观看蛋白质泳带。9从胶上切下目标带将其放到微量离心管中用1ml 50%乙睹洗两次每次3 mine10 .用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。11 .通过窄孔高效液相色谱分别肽。将收集的肽在AB1477A或494A机器上进行自 动Edman降解测序。四、留意的问题：(1)细胞裂解采纳温柔的裂解条件，不能破坏细胞内存在的全部蛋白质-蛋白质相互 作
9、用，多采纳非离子变性剂(NP40或Triton X-100)e每种细胞的裂解条件是不一样的， 通过阅历确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如 商品化的cocktailero(2)使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用(3)使用对比抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体：正常兔IgG在免疫共沉淀试验中要保证明验结果的真实性，应留意以下几点：Q)确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避开污染的发生；(2)要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；(3)确定
10、蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要 进行蛋白质的定位来确定。染色质免疫共沉淀技术(ChIP )真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,讨论蛋白质与DNA在染色质环 境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术 (chromatin immunoprecipitation assay, CHIP )是目前唯一讨论体内 DNA 与蛋白质 相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机 切断为肯定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富 集目的蛋白结合的DNA片段，通过对
11、目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相 互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来讨论组 蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范 围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的 高通量筛选；CHIP与体内脚印法相结合，用于查找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于讨论RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着CHIP的进一步完 善，它必将会在基因表达调控讨论中发挥越来越重要的作用。染色体免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation
12、 , ChIP )是基于体内分析进展 起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传信息讨论的主要方法。 这项技术关心讨论者推断在细胞核中基因组的某一特定位置会消失何种组蛋白修饰。ChIP 不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来讨论组蛋白的各种共价修饰 与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的进展和完善。采纳结合微阵列技术在染 色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深化分析癌症、心血管疾病以及中心神经系统 紊乱等疾病的主要代谢通路的一种特别有效的工具。染色质免疫共沉淀原理它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记 的生物抗体，染色
13、质被切成很小的片断，并沉淀下来。IP是采用抗原蛋白质和抗体的特异 性结合以及细菌蛋白质的prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用 开发出来的方法。目前多用精制的pro rein A预先结合固化在arg a rose的beads上，使 之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 试验最需要留意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合力量也不同，免染能结合未必能 用在IP反应。建议认真检查抗体的说明书。特殊是多抗的特异性是问题。其次，要留意溶 解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特殊是骨架蛋白，缓冲液必需要 使其溶
14、解。为此，必需使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗 体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也 产生与其它的蛋白结合的结果，抗原打算族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP胜利，也 是很多蛋白与抗体共沉的凄惨结果。再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液 必需加蛋白每抑制剂，低温下进行试验。每次试验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗 体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能 溶解抗原，过多则抗原被稀释。ChIP的一般流程甲醛处理细胞-收集细胞，超声破裂-加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复
15、合物 相互结合-加入ProteinA ,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀-对沉淀下来的复合 物进行清洗，除去一些非特异性结合-洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物-解交联, 纯化富集的DNA-片断-PCR分析。在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的 普及，大家也越来越倾向于Q-PCR 了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP （其实就是用ChIP的方法讨论细胞内蛋白与RNA的相互结合，详细方法和ChIP差不多, 只是试验过程中要留意防止RNase ,最终分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA ）; 还有ChlP-chip （其实就
16、是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP 的基础上有所转变，不同的公司有不同的做法，要依据公司的要求来预备样品1详细操作流程：第一天：（一 X细胞的甲醛交联与超声破裂。1、取出1平皿细胞（10cm平皿）, 加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1% （培育基共有9ml 2、37摄氏度孵育lOmin。3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后, 在室温下放置5min即可。4、吸尽培育基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心 管中（PBS依次为5ml , 3ml和3ml 预冷后2000rpm
17、 5min收集细胞。6、倒去上清。依据细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2xl06个细胞。这样每lOOul溶液含1x106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设 MCF7长满板为5x106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4x106个细胞。因此每管 加入 400ul SDS Lysis Buffer0将 2 管混在一起,共 800ulo7、超声破裂：VCX750,25%功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。 （二X除杂 及抗体培育。8、超声破裂结束后，10 , 000g 4oC离心10mino去除不溶物质。留取3003做试验，其余保存于-80oC。
18、300ul中,lOOul加抗体做为试验组；lOOul不加抗体做为对比组；100ul加入 4ul5MNaCI（ NaCI终浓度为0.2M ）, 65oC处理3h解交联,跑电泳,检测超声破裂的效 果。9、在lOOul的超声破裂产物中,加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50x PIC0再各力口入 60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC 颠转混匀 lh。10、lh 后，在 4oC 静置 10min 沉淀,700rpm 离心 lmino11、取上清。各留取203做为input。一管中加入lul抗体，另一管中则不加抗体。 4oC颠转过夜。（
19、三检验超声破裂的效果。取lOOul超声破裂后产物，加入4ul5MNaCI , 65oC处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。其次天:(一)、免疫复合物的沉淀及清洗。12、孵育过夜后，每管中加入 60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA0 4oC 颠 转2h。13、40c静置lOmin后，700rpm离心Imin。除去上清。14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在40c颠转lOmin , 4oC静置lOmin沉淀，700rpm离心lmin，除去上清。 洗涤溶液： a.low salt wash buffer-one wash b
20、.highsalt wash buffer-one wash c.LiCI wash buffer-one wash d.TE buffer-two wash15、清洗完毕后，开头洗脱。洗脱液的配方：100ull0%SDS , 100ullMNaHC03 , 800ulddH20 ,共 1ml。每管加入250ul洗脱buffer,室温下颠转15min ,静置离心后，收集上清。重复洗涤 一次。最终的洗脱液为每管500ulo16、解交联:每管中加入20ul 5M NaCI ( NaCI终浓度为0.2M工混匀，65oC解交联过夜。第三天：(一 I DNA样品的回收17、解交联结束后，每管加入luIR
21、NaseA (MBI), 37oC孵育lh。 18、每管加入 10ul0.5MEDTA z20ullMTris.HCI( PH6.5 ) ullOmg/ml 蛋白酶 Ko 45oC 处理 2ho19、DNA片段的回收-omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于 100ulddH2Oo（二1 PCR 分析ChlP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成果卓著，同时它可以用于胚胎干细胞 和一些疾病如癌症、心血管疾病和中心神经紊乱的发生的机制。讨论人员还可以采用这项 技术开发一些治疗方法。目前ChlP-chip技术讨论主要集中于两个领域：及转录因子的结 合和条件特异性；组蛋白的修饰，组蛋白修饰蛋白和染
22、色体重建。ChlP-chip在描述转录结合因子动力学中的讨论、染色体结构组分的分布、在组蛋白 的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也特别广泛。ChlP-chip技术的优点是， 可以在体内进行反应；在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简洁影像； 使用特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点；直接或者 间接（通过蛋白质与蛋白质的相互作用）的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是：需 要一个特异性蛋白质抗体，有时难于获得；为了获得高丰度的结合片段，必需试验演示胞 内条件下靶标蛋白质的表达状况；调控蛋白质的基因的猎取可能需要限制在组织来源中。总之，ChlP-ch
23、ip技术的进展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系供应了 一个极为有力的工具。在将来的讨论中，将对芯片的构建进行改进，提高其有用性。使用 易于获得抗体，增加这种方法的可用性。CHIP-seq染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation , ChIP ）也称结合位点分 析法，是讨论体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组 蛋白特异性修饰位点的讨论。将ChIP与其次代测序技术相结合的ChlP-Seq技术，能够高免疫沉淀试验胜利与否，第一步处理样品特别关键。免疫沉淀试验本质上是处于自然 构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质
24、量打算了抗原抗体反应中的抗原的质 量，浓度以及抗原是否处于自然 构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体 -agarose beads孵育对免疫沉淀试验是否胜利特别关键。在这个环节中，除了要掌握全部 操作尽量在冰上或者4。完成外，最为关键的是裂解液的成份。用于免疫沉淀试验的样品一般是原代培育细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用 的RIPA裂解液为例（主要含有pH7.4左右的离子缓冲液，接近生理浓度下的NaCI,肯定 比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等）来说明其各主要成份的用途，进而关心我 们如何针对不同的试验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。a.缓冲液：离子缓 冲液常采纳
25、pH7.4的Hepes或者Tris-CI0b. NaCI浓度一般习惯用150 mM,这主要是由于150 mM接近生理浓度不会破坏蛋 白质之间的相互作用。然而细胞内部的NaCI浓度并不是均一的，局部NaCI的浓度可以低 到50 mM,150 mM的NaCI有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方 最佳的NaCI浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。c.甘油由于其粘性，可以对蛋白 质之间的相互作用起到一个很好的爱护作用。一般添加10%的甘油有助于稳定蛋白质之间 的相互作用。d.裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜，也同时破坏了很多细胞器的膜，从而释放了 其中储存的很多蛋白酶。而由于用于免疫
26、沉淀试验的去垢剂作用比较温柔，因此蛋白酶的 活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑 制环境受到转变后从而恢复了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的 降解从而完成免疫沉淀试验特别关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶，通过 Protease Cocktail （多种蛋白酶抑制剂混合物）可以抑制蛋白酶。效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。ChlP-Seq的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP ）特异性地富集目的蛋 白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通 量测序
27、。讨论人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因 组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。技术应用该技术主要应用于：1.组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记2.转录调控分析 3.药物开发讨论 4.有丝分裂讨论 5.DNA损失与凋亡分析e.去垢剂对于免疫沉淀试验尤其是免疫共沉淀试验是一个特别关键的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果：- 细胞质/器膜的通透性：由于很多目的蛋白都定位在细胞器中，所以必需先将这些蛋 白释放出来，抗体才能与之反应。- 膜蛋白的释放：很多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度特别敏感，因此针对这类蛋 白
28、的免疫沉淀试验，需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。- 蛋白相互作用：不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样，需要 依据详细蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种 蛋白质现在很难精准猜测，所以一个更为切实可行的方法就是通过详细试验筛选合适的去 垢剂种类和浓度。二、抗体-agarose beads 孵育裂解细胞，离心并去除不行溶的膜组份后，上清可以储存在-80。保存3个月，但最好 能够使用新奇制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads孵育试验。抗体可以先加 入上清中与样品孵育数小时后再加入Protein A或者G beads孵育过夜
29、，也可以同时加入 抗体和Protein A或者G beads孵育过夜。一般选择lmg总蛋白（lmg/ml对应添力口1 ug 抗体,最高可以添加至5 ug抗体，过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选 择合适的阴性对比。一般选用加同样量的IgG,但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关 目的蛋白的一抗做对比。例如，做膜蛋白A的免疫沉淀，选择膜蛋白B来做阴性对比，只 要确认二者之间没有相互作用；而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀，则选择此外一个可溶 性蛋白D来做阴性对比。同时，为避开Protein A或者G beads有（非）特异性吸附从而 造成免疫沉淀试验结果的假阳性，一般在加入目的蛋白抗体之
30、前，预先将Protein A或者 G beads与细胞裂解液孵育数小时，然后取上清用于后续的抗体-agarose beads孵育。同时，Protein A或者G beads对不同类型的抗体亲和力不同，结合一抗的种属和Ig 亚型，选择合适的Protein A或者G beads也是打算免疫沉淀试验胜利与否的一个重要因 素。一般推举使用Protein A和Protein G beads的混合物，这样可以达到最佳试验效果, 而且省去了很多选择的苦恼。三、抗体-agarose beads复合物洗涤：除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对比外，去除免疫沉淀试验非特异性的 一个方法是对抗体-agaros
31、e beads复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一 样的配方，但去除甘油，以削减由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的试验要 求，还可以通过更改NaCI的浓度以及去垢剂的比例，种类来达到去除非特异性吸附的效 果。例如，针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀试验或者虽然是进行免疫共沉淀试验，但 蛋白质之间的结合比较牢靠，可以考虑使用低浓度（0.2-0.5% ）的SDS洗涤抗体 -agarose beads复合物，这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。四、鉴定免疫沉淀试验用途特别广泛（见IP： Q&A ）,而且基于最基本的免疫沉淀试验衍生出了 很多免疫沉淀相关试验手段（比如免疫共沉淀，
32、染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀）, 因此，免疫沉淀试验的鉴定方法主要视试验目的而定。我们在本手册中主要简洁概述常见的免疫沉淀之后的WB检测需要留意的试验环节。由于免疫沉淀试验使用目的蛋白抗体加Protein A/G beads与样品孵育，因此在最终离心 获得抗体-agarose beads复合物后，eppendorf管中主要含有抗体，目的蛋白， Protein A/G beads以及一些其它非特异性作用蛋白。其中，抗体和目的蛋白以及 Protein A/G beads三者之间是以非共价健结合在一起，只有Protein A/G与 agarose beads是共价结合在一起的。因此，最终经过
33、添加含筑基乙醇的加样缓冲液以及 煮沸变性并离心出去Protein A/G beads后，eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量 非特异性吸附蛋白。这样SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白，由于加样缓冲液 中含有疏基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重 链分子（55KD ）和轻链分子（25KD 因此，WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外, 假如所使用的二抗与用于免疫沉淀试验的抗体分子属于同一种属的话，还能检测到重链和 轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量特别大（lug ）,所以当目的蛋白的大小接近重链或 者轻链分子时，重链或者轻链分子的WB信号经常
34、由于信号过强而导致影响对目的蛋白的 WB结果推断。针对上述状况，通常有二种解决方法：a.选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀试验和WB试验，这样再选择一个种属交叉 反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB试验，就可以大大减弱重链和轻链分子的 WB信号。b.使用交联剂将抗体和Protein A/G beads交联，然后通过添加不含筑基乙醇的加样 缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarose beads复合物，最终离心去除抗体-agarose beads 复合物，上清中只留下目的蛋白。免疫共沉淀(Co- Immunoprecipitation, Co-IP )是采用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Pr
35、otein A或G特异性地结合到免疫球蛋 白的Fc片段的现象开发出来的方法。其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗爰好蛋白的抗 体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G ,若细胞中有 与爱好蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：目的蛋白一爰好蛋白一抗爱好 蛋白抗体一Protein A或G,经变性聚丙熔酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫 印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与爱好蛋白自然结合的， 符合体内实际状况，得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体 内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。免
36、疫共沉淀优点(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于自然 状态；(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避开人为的影响；(3)可以分别得到自然状态的相互作用蛋白复合物免疫共沉淀缺点(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用；(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；(3 )必需在试验前猜测目的蛋白是什么，以选择最终检测的抗体，所以，若猜测不正确，试验就得不到结果，方法本身具有冒险性。一原理：免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation )是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础 的用于讨论蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质
37、在完整细胞内生理性相互作用 的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的很多蛋白质 -蛋白质间的相互作用被保留了下来。假如用蛋白质X的抗体免疫沉淀X ,那么与X在体 内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose 的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后, beads上的pro rein A就能吸附抗原 达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一 种特定蛋白质的新的作用搭档。其优点为：(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于自然状态；(2 )蛋白 的相互作用是在自然状态下进行
38、的，可以避开人为的影响；(3 )可以分别得到自然状态的 相互作用蛋白复合物。缺点为：(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互 作用；(2 )两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；(3 ) 必需在试验前猜测目的蛋白是什么，以选择最终检测的抗体，所以，若猜测不正确，试验 就得不到结果，方法本身具有冒险性。二、预备工作：预冷PBS , RIPA Buffer，细胞刮子(用保鲜膜包好后，埋冰下),离心机1 .用预冷的PBS洗涤细胞两次，最终一次吸干PBS ;2 .加入预冷的RIPA Buffer(lml/107个细胞、10cm培育皿或150cm2培育瓶,O.5m
39、l/5xlO6个细胞、6cm培育皿、75cm2培育瓶）3 .用预冷的细胞刮子将细胞从培育皿或培育瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4 , 缓慢晃动15min （ EP管插冰上，置水平摇床上）4 . 4 , 14000g离心15min ,马上将上清转移到一个新的离心管中5 .预备Protein A agarose ,用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建 议减掉枪尖部分，避开在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6 .每1ml总蛋白中加入lOOpI Protein A琼脂糖珠（50% ）, 4摇摆10min （ EP管 插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7 . 4
40、 , 14000g离心15min ,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠 子8 . （Bradford法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1 ： 10倍以 上，以削减细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-2（rc保存一个月）9 .用PBS将总蛋白稀释到约1 |jg/|jl ,以降低裂解液中去垢剂的浓度，假如爰好蛋白 在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应当稍高（如10 |jg/|jl）10 .加入肯定体积的兔抗到5003总蛋白中，抗体的稀释比例因爰好蛋白在不同细胞 系中的多少而异11 . 4乙缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h ,激酶或磷酸酯酶活性分析
41、建议用2 h室温孵育12 .加入lOOpI Protein A琼脂糖珠来捕获抗原抗体复合物，4缓慢摇动抗原抗体混 合物过夜或室温lh ,假如所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 过渡抗体（兔抗鼠IgG , 兔抗鸡IgG ）13.14000rpm瞬时离心5s ,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的 RIPA buffer洗3遍，800川/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内 部的结合，可以使用PBS14 .用60pl 2x上样缓冲液将琼脂糖珠.抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量 依据上样多少的需要而定（60 pl足够上三道）15 .将上样样品煮5min ,以
42、游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼 脂糖珠，上清也可以临时冻-2（TC ,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。RIPA Buffer配制：基础成分：Tris-HCI （缓冲液成分，防止蛋白变性）NaCI （盐份，防止非特异蛋白聚集）NP-40 （非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液;避光保存）留意: 预备激酶（致活酶）试验时，不要加去氧胆酸钠，由于离子型去污剂能够使酶变性，导致 活性丢失。RIPA蛋白酶抑制剂 苯甲基磺酰氟（PMSF ）（用异丙醇配制成200mM的储 存液，室温保存）EDTA （钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH7.4）亮抑