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1、分析方法的验证XX 美亚药业有限公司内容提要n 法规要求n 分析方法验证的作用、适用范围及一般原则n 哪些检验项目需要方法验证？n 方法验证内容有哪些？n 方法确认n 再验证n 分析方法验证流程n 验证文件法规要求n 第十二条 质量控制的基本要求：（四）检验方法应经过验证或确认；n 第二百二十三条 检验应有物料和不同生产阶段产品的书面检验操作规程，阐述所用方法、仪器和设备。检验结果应有记录。1.企业应确保药品按照注册批准的方法进行全项检验。2.符合下列情形之一的，应对检验方法进行验证：(1)采用新的检验方法；(2)检验方法需变更的；(3)采用中华人民共和国药典及其它法定标准未收载的检验方法；(
2、4)法规规定的其它需要验证的检验方法。3.对不需要进行验证的检验方法，企业应对检验方法进行确认，以确保检验数据准确、可靠。分析方法n 分析方法是为完成检验项目而设定和建立的测试方法，它详细描述了完成分析检验的每一步骤。n 分析方法可采用化学分析方法和仪器分析方法。这些分析方法各有特点，同一分析方法可用于不同的检验项目，但验证内容会有不同。例如采用高效液相色谱法用于药品的鉴别和杂质定量检验应进行不同要求的方法验证。前者重点要求验证专属性，而后者则需要重点验证专属性、准确度和定量限。分析方法验证的作用n 只有经过验证的分析方法才可以可靠有效地用于控制药品质量，因此方法验证是制订质量标准的基础适用范
3、围n 适用于：物料，中间产品，过程控制和 成品的理化分析方法的验证.清洁验证方法的验证 n 不适用于化学药品的微生物方法方法验证的一般原则n 通常情况下，分析方法需进行方法验证。但外观、崩解时限、密度、重量、pH 值、硫酸盐、灰分、装量等不需进行方法验证。n 方法验证的内容应根据检验项目的要求，结合所采用分析方法的特点确定。n 同一分析方法用于不同的检验项目会有不同的验证要求。哪些检验项目需要方法验证？需验证的检验项目分为四类：n 鉴别试验 n 杂质的限度检查 n 杂质的定量测定 n 含量测定哪些检验项目需要方法验证？n 鉴别的目的在于判定被分析物是目标化合物，而非其它物质。故应具有较强的专属
4、性和耐用性。n 杂质检查主要用于控制主成分以外的杂质，如无机杂质，有机杂质等。杂质检查分为限度检(侧重专属性、检测限和耐用性)和定量测定(强调专属性、准确度、精密度、线性、范围、定量限和耐用性)。n 含量测定对准确度要求较高，因此应验证专属性、准确度和线性等要求。方法验证内容有哪些？验证项目 鉴别 杂质定性杂质定量含量测定专属性+线性-+范围-+准确度-+精密度-重复性-+精 密 度-中 间 精密度-+检测限-+-定量限-+-耐用性+专属性n 专属性系指在其他成分(如：杂质、降解产物、等)可能存在下，采用的方法能正确测定出被测物的特性。n 通常,鉴别反应、杂质检查、含量测定均应考察其专属性。如
5、一种方法不够专属，可由其它分析方法予以补充。例如检测具有旋光特性的活性物质,除采用高效液相色谱法外,还应增加旋光度的检查。专属性n 鉴别试验-含被测成分的供试品呈正反应，而不含被测成分的供试品以及结构相似或组分中的有关化合物，应均呈负反应。专属性（杂质和含量测定）n 方法1：在杂质可获得的情况下，可向试样中加入一定量的杂质，考察杂质与共存物质能得到分离和检出（考察测定结果是否受干扰）n 方法2：在杂质或降解产物不能获得的情况下，专属性可通过测定含有杂质或降解产物的试样，与另一个已验证的方法或药典方法比较结果。或对试样用强光照射，高温，高湿，酸（碱）水解或氧化的方法进行加速破坏，以研究可能的降解
6、产物和降解途径，并比对破坏前后检出的杂质个数。必要时进行峰纯度检查。线性n 线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，如杂质定量测定和含量测定均需验证线性。n 验证方法 可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试样品的方法进行测定，至少制备5 个浓度（通常选取50%、80%、100%、120%、150%）。每一个浓度的样品3 份，以应信测得的响应号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，用最小二乘法进行线性回归。范围n 指能达到一定精密度、准确度和线性的测试方法所适用的高低限浓度或量的区间。n 对于原料药的含量测定，范围应为测试浓度的80%120%n 杂质测定，范围应为测试浓度的
7、50%120%。准确度n 准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。一般用回收率表示。准确度应在规定的范围内测试。准确度-原料药含量测定n 方法1：用已知纯度的对照品或供试品进行测定。n 方法2：用本法所得结果与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较 n 如：测定含量的准确度,按标示量的80%,100%和120%配制三个浓度的溶液，每个浓度各分别制备3 份供试品溶液，进行测定。根据测定结果与配制浓度计算出平均回收率以及相对标准偏差。准确度-杂质定量测定n 方法1：可向原料药加入已知量杂质进行测定。n 方法2：如果不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较，如
8、药典方法或经过验证的方法精密度n 精密度系指在规定的测试条件下，同一均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。n 精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示 精密度验证方法n 精密度可从重复性、中间精密度、重现性三个层次考察 n 重复性：在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度。n 验证方法：设计3 个不同浓度，每个浓度各分别制备3 份供试品溶液，进行测定3次，或将相当于100 的浓度水平的供试品溶液，用至少测定6 次的结果进行评价。精密度验证方法n 中间精密度：在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度。n 验证方法：同一批样品每位分析员准备六份
9、进行测量，计算两人之间平均值的差异精密度验证方法n 重现性:在不同实验室之间由不同分析人员测定结果之间的精密度。n 一般实验室不进行此项考察。只有当分析方法将被法定标准采用时，才进行重现性试验。检测限和定量限n 检测限:被测物能被检测出的最小值。(杂质限度检查时应验证)n 定量限:被测物能被准确测定的最小量，其测定结果应具有一定准确度和精密度。(杂质定量检查时应验证)检测限和定量限n 非仪器分析目视法：用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。n 信噪比法：用于能显示基线噪音的分析方法，即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地检测出的最低浓度或
10、量。一般以信噪比为3：1 时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。对于定量限典型信噪比为10:1。耐用性n 耐用性系指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。n 一般开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。经试验，应说明小的变动能否符合系统适用性试验要求，以确保方法有效。如果通过耐用性研究发现分析方法对某个或某些测试条件敏感或要求苛刻，则建议在方法中予以写明。耐用性n 典型影响耐用性的变动因素 n 1.被测溶液的稳定性 n 2.液相色谱法(HPLC)中的典型影响耐用性的变动因素（流动相的组成、流动相的pH 值、不同品牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温、流速等）耐用性-溶液的稳定性研究 n 溶
11、液的稳定性研究：用来证明样品溶液和标准品溶液在规定的储存条件下在一定时间内保持稳定。n 如果方法中没有规定有效期，样品溶液和标准品溶液需进行稳定性研究。n 研究方法：配制好的样品溶液和标准品溶液，在室温或其他条件下（如冰箱2-8C）储存适当的时间。每个间隔点，用新鲜配制的标准品溶液做对照，测定储存的样品溶液和标准品溶液。n 测定结果与初始结果进行比较，符合接受标准便可确认样品溶液和标准品溶液在规定的储存条件下在规定储存时间是稳定的。耐用性（HPLC）n HPLC 中的变动因素（及变化范围）n 流动相的组成：有机相的 5%,如:cAMP 规定流动相缓冲溶液与乙腈的比例为85:15,那么允许使用
12、90:10 至 80:20 范围的比例.n 流动相的pH 值：0.5,如果已知pH 值为关键影响因素,变化范围会更小。n 色谱柱：如可能，推荐使用同一品牌的填料可由不同供应商填充的色谱柱。可通过回顾实验分析次数或方法研究确定色谱柱的质量。n 柱温：5 耐用性n%Difference=100-100Rm/Rsn 其中：Rm 改变条件后的含量结果；n Rs 标准条件获得的含量结果。n 原料药含量差异不得大于1.5%。什么时候需要方法确认？n 适用于药典方法和其他已验证的法定标准。因为药典方法和其他法定标准被认为是验证过的分析方法，不需要验证，但需要通过方法确认来证明方法在该实验室条件下的适应性。n
13、 不适用于：实验室日常测试操作步骤不需要进行方法确认，例如（包括但不限于）干燥失重，炽灼残渣，各种湿法化学步骤如酸值和简单的仪器方法如PH 计，除非有特殊要求。再验证n 当原料药合成工艺发生改变时，可能引入新的杂质，杂质检查方法和含量测定方法的专属性就需要再进行验证n 当质量标准中某一项目分析方法发生部分改变时，如HPLC 测定含量时，检测波长发生改变，则需要相应的验证，证明修订后分析方法的合理性、可行性。再验证n 再验证原则：根据改变的程度进行相应的再验证。当这种改变到达一定程度时，则需要完整的验证。如分析方法完全改变时，则应视为新方法并需要完整的验证。n 方法再验证是对分析方法的完善过程，
14、应根据实际改变情况进行再验证，从而保证所采用的分析方法的可靠性。分析方法验证流程n 分析方法验证流程.doc验证文件n 验证方案内容n 方法验证的执行n 验证报告的起草与批准n 验证文件的保存验证方案内容 n 唯一的方案号.n 分析方法的版本号以及物料/产品的名称:n 验证的实验项目 n 验证的原则和目的 n 验证的参数以及接受标准 n 验证实验中所用标准品，检验样品信息 n 分析仪器的相关信息 n 所用仪器的信息，如已确认的情况下 n 方案起草者，复核人和批准者需签字确认方法验证的执行进行方法验证前，应确认如下条件已符合：n 从事分析方法验证的分析师是合格的分析师。n 所用分析仪器已通过验证
15、和校验。n 实验必须依据批准的方案进行。n 实验过程中任何失败的测试，过程中的偏差或异常均需复核和评估并查出原因。过程中的偏差或异常需通过正式的体系（如调查报告，验证报告中偏差的鉴定和批准）进行记录和批准.验证报告的起草与批准n 唯一的报告号.n 相关方案号 n 分析方法的版本号以及物料/产品的名称:n 验证的实验项目 n 验证实验中所用标准品，检验样品以及分析仪器的相关信息 n 结果汇总，并与方案中规定的接收标准进行评估 n 偏离方案的偏差汇总及处理结论 n 结论，需对方法验证是否成功进行正式描述。n 报告起草者，复核人和批准者需签字确认 验证文件的保存n 分析方法验证的方案与报告的存档 n 方案与报告均集中存档，并长期保存