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1、ICS11.220B41DB22吉林省地方DB22/T31112020猫杯状病毒检测实时荧光RT-PCR法DetectionmethodofrealtimequantitativeRT-PCRforFelinecalicivirus2020-03-16发布2020-03-30实施吉林省市场监督管理厅发布DB22/T31112020前言按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。由吉林省畜牧业管理局提出并归口。起草单位：吉林农业大学、吉林省畜牧兽医科学研究院。主要起草人：胡桂学、王开、郭衍冰、姜雪、黄海龙、呼延含蓉、赵艳丽、程荣华、伊淑帅、牛江婷。IDB22/T
2、31112020猫杯状病毒检测实时荧光RT-PCR法1范围规定了猫杯状病毒实时荧光RT-PCR检测方法的试剂和材料、仪器设备、样品、试验步骤、结果判定和废弃物处理的技术要求。适于猫杯状病毒核酸的检测。2规范性引文件下列文件对于文件的应是必可少的。凡是注日期的引文件，所注日期的版适于文件。凡是注日期的引文件，其最新版（包括所有的修改单）适于文件。GB/T6682分析实验室水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫3缩略语下列缩略语适于文件。Ct循环阈值（Cyclethreshold）Cdna互补脱氧核糖核酸（ComplementaryDeoxy
3、ribonucleicacid）DMEM改良Eagle培养基（DulbeccosmodificationofEaglesmedium）ORF开放阅读框（OpenReadingFrame）RNA核糖核酸（Ribonucleicacid）RT-PCR反转录聚合酶链式反应（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction）4原理根据猫杯状病毒衣壳蛋白ORF2的保守区基因序列，设计引物和探针。探针在5端记FAM荧光素作为报告荧光基团，3端记Eclipse作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基
4、团所吸收，仪器检测到荧光信号；反应进入延伸阶段时，Taq酶发挥53的外切核酸酶功能，将探针降解。探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。5试剂和材料5.1试剂1引物和探针名称序列53浓度mol/L上游引物FCTGACTTCAAATTTCATCTC0.20下游引物RTGGGAATTAAGTCAGAGG0.20探针(FAM)ATCTATGCTCACTCATGGATCTGTC(Eclipse)0.40DB22/T3
5、1112020除有特殊说明外，所有实验试剂均为分析纯。实验水应符合GB/T6682中一级水的要求。5.1.1DMEM培养液。5.1.2液氮。5.1.3RNA提取试剂盒。5.1.4反转录试剂盒。5.1.5阳性对照，为猫杯状病毒的细胞培养物或非感染性体外转录RNA。5.1.6阴性对照，为含猫杯状病毒的细胞培养液。5.1.7无RNA酶的水（Rnasefreewater）。5.1.8Taq酶。5.2材料5.2.1无菌拭子。5.2.2离心管，1.5mL、15mL和50mL。5.2.3吸头，200L1000L、20L200L、2L20L和0.5L10L。5.2.4无RNA酶吸头，200L1000L、20L
6、200L、2L20L和0.5L10L。5.2.5无RNA酶离心管，0.2mL和1.5mL。5.2.6研钵。5.2.7荧光定量PCR反应管,根据荧光PCR仪要求选择单管、八连排管或96孔荧光反应板。5.3引物和探针引物及探针时配制成表1中浓度，置-20保存，6个月。表1引物序列和浓度6仪器设备6.1冰箱，-202，-802。6.2高速冷冻离心机，12000r/min以上。6.3可调移液器，200L1000L、20L200L、2L20L和0.5L10L。6.4天平，感量0.01g。6.5恒温水浴锅，控温范围为室温至100。6.6荧光定量PCR扩增仪。7样品7.1样品的采集2试剂剂量Rnasefre
7、ewater8.5L模板2.0L上游引物F0.5L下游引物R0.5L探针1.0LTaq酶12.5L总体积25.0LDB22/T311120207.1.1将无菌拭子（5.2.1）在口腔和鼻腔，刮取分泌物，将拭子插入离心管（5.2.2）中，加盖并记，冷藏送检。7.1.2组织样品主要采集气管和肺脏，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，做好记，冷藏送检。7.2样品的处理7.2.1口鼻拭子的处理拭子样品600LDMEM（5.1.1）浸润后，3000r/min离心（6.2）15min，取上清液500L（6.3、5.2.4）于1.5mL无RNA酶离心管（5.2.5）中。7.2.2组织处理采取少于500mg（6.
8、4）的组织样品，在研钵（5.2.6）加液氮（5.1.2）研磨，收集于1.5mL无RNA酶的离心管（5.2.2）中。8试验步骤8.1模板的制备8.1.1RNA提取试剂盒（5.1.3）提取样品RNA，操作方法按说明书进行。8.1.2采反转录试剂盒（5.1.4、6.5）制备待检样品的cDNA作为模板，操作方法按说明书进行。8.1.3阳性对照（5.1.5）、阴性对照（5.1.6）均按照待检样品操作方法进行。8.2反应体系在荧光定量PCR反应管（5.2.7）中依次加入表2所示的试剂后，盖紧管盖，震荡混匀，瞬时离心。表2反应体系8.3反应程序将荧光定量PCR反应管放入荧光定量PCR扩增仪（6.6），记录样
9、品摆放顺序。循环参数设置见表3。在第二步55退火10s处设置收集荧光信号。3反应步骤温度时间s循环数次第一步95301第二步9554055107220DB22/T31112020表3反应程序9结果判定9.1结果分析条件设定读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为，同仪器可根据仪器型号进行调整。9.2质控9.2.1阴性对照无Ct值，并且无扩增曲线。9.2.2阳性对照的Ct值应35，并出现特定的扩增曲线。9.2.3如阴性对照和阳性对照满足以上条件，试验视为无效。9.3结果描述及判定9.3.1阴性判定无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无猫杯状病毒核酸，判为阴性。9.3.2阳性判定9.3.2.1Ct值35，出现特定的扩增曲线，表示样品中存在猫杯状病毒核酸，判为阳性。9.3.2.235Ct40，应进行重复试验。如果重复试验的Ct值40，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性。10废弃物处理10.1检测的样品及接触物，应收集后高压灭菌处理，防止污染措施应符合GB/T27401的规定。10.2检测过程中的废弃物及个人防护，应符合GB19489的规定。_4