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1、酸碱滴定分析法酸碱滴定分析法第六章第六章 药物安全性检查技术药物安全性检查技术01热原检查技术无菌和微生物限度检查技术02目录定 义热原是指能引起恒温动物和人体体温异常升高的致热物质。广义上包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。药剂中的“热原”通常是指细菌性热原，是微生物产生的代谢产物。热原吞噬细胞吞噬白细胞崩解，释放内源性致热原作用于体温调节中枢产热增加、散热减少体温上升家兔法家兔法热原检查热原检查鲎鲎（hou）试剂法试剂法细菌内毒细菌内毒素检查素检查除另有规定外，中国药典二部规定了静脉用注射剂均需进行热原或细菌内毒素的检查一热原的家兔检查法热原的家兔检查法由于家兔
2、对热原的反应与人基本相似，家兔法由于家兔对热原的反应与人基本相似，家兔法为各国药典规定的检查热原的法定方法为各国药典规定的检查热原的法定方法。此法是将此法是将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。状况、试验室条件和操作的规范性。一热原的家兔检查法热原的家兔检查法健康合格，体重健康合格，体重1.7
3、3.0kg，雌兔应无孕，预测体，雌兔应无孕，预测体温前七日应用同一饲料喂养病无异常；温前七日应用同一饲料喂养病无异常；对未使用过的家兔，或供试品判定为符合规定但对未使用过的家兔，或供试品判定为符合规定但组内升温达组内升温达0.6的家兔；或三周内未用过的家兔，的家兔；或三周内未用过的家兔，均应在实验前均应在实验前37日内预检体温，进行挑选；日内预检体温，进行挑选；对用过的家兔，如供试品判为符合规定，至少休对用过的家兔，如供试品判为符合规定，至少休息息48小时。如升温达小时。如升温达0.6则应休息两周以上；则应休息两周以上；使用次数不超过十次。使用次数不超过十次。对家兔的要求一热原的家兔检查法热原
4、的家兔检查法健康合格，体重健康合格，体重1.73.0kg，雌兔应无孕，预测体，雌兔应无孕，预测体温前七日应用同一饲料喂养病无异常；温前七日应用同一饲料喂养病无异常；对未使用过的家兔，或供试品判定为符合规定但对未使用过的家兔，或供试品判定为符合规定但组内升温达组内升温达0.6的家兔；或三周内未用过的家兔，的家兔；或三周内未用过的家兔，均应在实验前均应在实验前37日内预检体温，进行挑选；日内预检体温，进行挑选；对用过的家兔，如供试品判为符合规定，至少休对用过的家兔，如供试品判为符合规定，至少休息息48小时。如升温达小时。如升温达0.6则应休息两周以上；则应休息两周以上；使用次数不超过十次。使用次数
5、不超过十次。对家兔的要求一热原的家兔检查法热原的家兔检查法准备工作每每批供试品初试用批供试品初试用3只，复试只，复试5只。在检查前只。在检查前12日，日，家兔应处于同一温度环境中，实验室应为家兔应处于同一温度环境中，实验室应为1725，与饲养室温度相差不大于，与饲养室温度相差不大于3，并防止动物躁动，并防止动物躁动和避免噪声干扰。和避免噪声干扰。家兔在实验前至少一小时开始停止给食，并置于家兔在实验前至少一小时开始停止给食，并置于宽松装置中，直至实验完毕。宽松装置中，直至实验完毕。测温测温装置精密度应为装置精密度应为0.1。一热原的家兔检查法热原的家兔检查法准备工作测测温温探探头头或或肛肛温温计
6、计插插入入肛肛门门的的深深度度和和时时间间各各兔兔应应相相同同，深深度度一一般般约约6cm，时时间间不不得得少少于于一一分分半半钟钟，每每隔隔30分分钟钟测测量量一一次次，一一般般测测两两次次，两两次次体体温温之之差差不不超超过过0.2，以以平平均均值作为该兔正常体温值作为该兔正常体温。当当日日使使用用的的家家兔兔，正正常常体体温温应应在在38.039.6，且且同同组组各各兔兔间正常体温之差不得超过间正常体温之差不得超过1。试试验验用用的的注注射射器器、针针头头及及一一切切和和供供试试品品接接触触的的器器皿皿，应应置置烘烘箱箱中中250加加热热30min，或或180加加热热2h，也也可可用用其
7、其他他适适宜方法除去热原。宜方法除去热原。一热原的家兔检查法热原的家兔检查法检查法测家兔正常体温后测家兔正常体温后15min内，由耳静脉缓缓注入规内，由耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至定剂量并温热至38的供试品溶液，然后每隔的供试品溶液，然后每隔30min测体温测体温1次，连续测次，连续测6次。次。每每只家兔正常体温与注射供试品溶液后只家兔正常体温与注射供试品溶液后6次测量体次测量体温中最高的体温之差，即为该兔的升高温度。温中最高的体温之差，即为该兔的升高温度。如如3只家兔中有只家兔中有1只体温升高只体温升高0.6或以上，或或以上，或3只家只家兔体温升高均低于兔体温升高均低于0.6但升高总和达但
8、升高总和达1.4或以上，或以上，则另取则另取5只家兔复试，方法同上。只家兔复试，方法同上。一热原的家兔检查法热原的家兔检查法结果判定1.判为符合规定：判为符合规定：在初试在初试3只家兔中，体温升高均低于只家兔中，体温升高均低于0.6并且升并且升高总和低于高总和低于1.3在复试在复试5只家兔中，体温升高只家兔中，体温升高0.6或以上的家兔或以上的家兔不超过一只，并且初试与复试合并不超过一只，并且初试与复试合并8只家兔的体温只家兔的体温升高总和为升高总和为3.5或以下或以下一热原的家兔检查法热原的家兔检查法结果判定2.有下列情况者，复试一次：有下列情况者，复试一次：3只家兔只家兔1只体温升高只体温
9、升高0.6或以上或以上3只家兔升温均低于只家兔升温均低于0.6但升温总和达但升温总和达1.3或以或以上上一热原的家兔检查法热原的家兔检查法结果判定3.有下列情况者，判为不符合规定：有下列情况者，判为不符合规定：在初试在初试3只家兔中，体温升高只家兔中，体温升高0.6或以上的超过一或以上的超过一只只复试的复试的5只家兔中，体温升高只家兔中，体温升高0.6或以上的家兔超或以上的家兔超过一只过一只在初试与复试合并的在初试与复试合并的8只家兔中体温升高总和超过只家兔中体温升高总和超过3.5一热原的家兔检查法热原的家兔检查法结果判定4.出现负值的规定如下：出现负值的规定如下：当家兔升温为负值时，均以当家
10、兔升温为负值时，均以0计。计。一热原的家兔检查法热原的家兔检查法注意事项尽量使用热原测温仪测温，因为其感温探头在整个尽量使用热原测温仪测温，因为其感温探头在整个测温过程中都置于家兔肛门内，所测体温较正确，测温过程中都置于家兔肛门内，所测体温较正确，同时也避免了漏检现象。同时也避免了漏检现象。热原耐热性好，但在热原耐热性好，但在18034h，或，或200 60min，或或250 3045min可彻底破坏热原。因此耐热物品可彻底破坏热原。因此耐热物品如玻璃制品、注射器等均可用此法破坏热原。如玻璃制品、注射器等均可用此法破坏热原。热原实验室内外应保持安静，避免日光直射。热原实验室内外应保持安静，避免
11、日光直射。一热原的家兔检查法热原的家兔检查法注意事项捉拿家兔时，应一只手抓住颈部，一只手托其臀部，捉拿家兔时，应一只手抓住颈部，一只手托其臀部，避免其挣扎。整个过程中要避免家兔骚动以保持体避免其挣扎。整个过程中要避免家兔骚动以保持体温恒定。温恒定。注射时，先用注射时，先用75%酒精棉擦耳朵边缘，再由兔耳静酒精棉擦耳朵边缘，再由兔耳静脉缓缓注入规定剂量的供试液。注射完毕用手捏住脉缓缓注入规定剂量的供试液。注射完毕用手捏住针眼处，以助止血。针眼处，以助止血。试验过程中，要及时填写兔卡和原始记录。试验过程中，要及时填写兔卡和原始记录。家兔法家兔法热原检查热原检查鲎鲎（hou）试剂法试剂法细菌内毒细菌
12、内毒素检查素检查除另有规定外，中国药典二部规定了静脉用注射剂均需进行热原或细菌内毒素的检查一细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法主要来源主要来源 主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自溶主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素，其化学成分主要是后便会释放出内毒素，其化学成分主要是脂多糖脂多糖，这是一种大分子物质，分子量约为这是一种大分子物质，分子量约为106，其粒径约在，其粒径约在1 5纳米纳米。细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中含细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中含内毒素的量为内毒素的量为1至至100EU/ml。一细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒
13、素的鲎试剂检查法热源热源=内毒素内毒素？热热原原指指微微生生物物产产生生的的某某些些多多糖糖蛋蛋白白复复合合物物等等使使人体发热的物质，人体发热的物质，不仅仅是细菌内毒素。不仅仅是细菌内毒素。但但在在药药检检的的范范畴畴，细细菌菌内内毒毒素素是是主主要要的的热热原原物物质质，可可以以说说无无内内毒毒素素就就无无热热原原，控控制制内内毒毒素素就就是是控控制热原制热原。一细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法与热源对比内毒素检查法优势与热源对比内毒素检查法优势方便、快捷、经济；方便、快捷、经济；重现性好、灵敏度高；重现性好、灵敏度高；避免抗原的产生，克服生物测定的误差；避免抗原的产生，克
14、服生物测定的误差；近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热原法近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热原法一细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法与热源对比内毒素检查法优势与热源对比内毒素检查法优势方便、快捷、经济；方便、快捷、经济；重现性好、灵敏度高；重现性好、灵敏度高；避免抗原的产生，克服生物测定的误差；避免抗原的产生，克服生物测定的误差；近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热原法近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热原法一细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法在药检中的应用在药检中的应用 细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法，细
15、菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法，已经广泛的被世界各国药典收载。已经广泛的被世界各国药典收载。成品检查成品检查药品安全性检查之一药品安全性检查之一 半成品（生产过程）检查半成品（生产过程）检查事前质控手段，避免事前质控手段，避免造成药品成批报废造成药品成批报废一细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法鲎的图片鲎的长相既像虾又像蟹，人称之为鲎的长相既像虾又像蟹，人称之为“马蹄蟹马蹄蟹”,是一类与三叶虫是一类与三叶虫(现在现在只有化石只有化石)一样古老的动物。一样古老的动物。鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。这种蓝色血液的鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。这种蓝色血液的提
16、取物提取物“鲎试剂鲎试剂”，可以准确、快速地检测人体内部组织，可以准确、快速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病；在制药和食品工业中，可用它对毒素是否因细菌感染而致病；在制药和食品工业中，可用它对毒素污染进行监测。污染进行监测。一细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法中国药典中国药典批准使用方法批准使用方法：供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。但当测定结果有争议时，除另有规定外，但当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法以凝胶法结果为准。结果为准。本节将着重介绍凝胶法法的操作与有关原理。本节将着重介绍凝胶法法的操作与有关原理
17、。测定测定方法方法凝胶法凝胶法 光度测定法光度测定法 浊度法浊度法 显色基质法显色基质法 一细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法凝胶法基本原理基本原理 内毒素（内毒素（LPS）激激 活活 凝固蛋白原凝固蛋白原 凝固蛋白凝固蛋白 （溶解状态）（溶解状态）（凝胶状态）（凝胶状态）凝固酶原凝固酶原凝固酶凝固酶一细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法凝胶法名词解释名词解释国家标准品及工作标准品国家标准品及工作标准品 国家标准品：国家标准品：（单位：（单位：EU/mlEU/ml）自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标
18、定细菌内毒素工作标准品的仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价；效价；工作标准品：工作标准品：经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度符经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度符复核、干扰试验及各种阳性对照；复核、干扰试验及各种阳性对照；一细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法名词解释名词解释鲎试剂鲎试剂 鲎鲎（hu）是一种海洋节肢动物，其血液）是一种海洋节肢动物，其血液中含有一种有核变形细胞，这种细胞的胞浆中含有一种有核变形细胞，这种细胞的胞浆中含有凝固酶原和凝固蛋白原。将此物质进中含有凝固酶原和凝固蛋白原。将此物质进行提取，经低温冷冻干燥而成的生物试剂即行提取，经低温冷冻干
19、燥而成的生物试剂即为为鲎试剂鲎试剂，专用于细菌内毒素检测。，专用于细菌内毒素检测。一细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法基本概念基本概念1细菌内毒素限值（细菌内毒素限值（L）指人对药品中细菌内毒素所能耐受的不致引起热指人对药品中细菌内毒素所能耐受的不致引起热原反应的某定量限值（原反应的某定量限值（L L）；）；计算公式：计算公式：L=K/ML=K/M K K：每公斤体重每小时最大可接受内毒素剂量，注射剂：每公斤体重每小时最大可接受内毒素剂量，注射剂K=5EU/K=5EU/(kg.h)M:M:每公斤体重每小时的最大供试品剂量；每公斤体重每小时的最大供试品剂量；以胸腺素以胸腺素1计算限
20、值为例：计算限值为例：L=5EU/(kg.h)(1.6mg60kg)=185.19 EU/mg 药典规定标准：小于药典规定标准：小于10EU/ml一细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法基本概念基本概念2确定最大有效稀释倍数（确定最大有效稀释倍数（MVDMVD）指供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀指供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测；释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测；计算公式：计算公式：MVD=MVD=cLcL/L L：供试品的：供试品的细菌内毒素限值细菌内毒素限值 c c：供试品溶液的浓度：供试品溶液的浓度 ：鲎试剂灵敏度：鲎
21、试剂灵敏度 以胸腺素以胸腺素1计算最大稀释倍数为例：计算最大稀释倍数为例：MVD=10EU/mg1.6mg/ml 0.25EU/ml=64（倍）（倍）一细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法方法步骤方法步骤 1.1.鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验3.3.凝胶适量试验凝胶适量试验2.2.干扰实验干扰实验目的：检查当所使用的目的：检查当所使用的鲎试剂灵敏度是否与标鲎试剂灵敏度是否与标示灵敏度有差异，是否示灵敏度有差异，是否影响检验结果影响检验结果目的：检查鲎试剂、供目的：检查鲎试剂、供试品配方、检查用的水试品配方、检查用的水等试验条件是否影响实等试验条件是否影响实验结果验结果目
22、的：检查供试品内毒目的：检查供试品内毒素是否合格素是否合格一细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法1.1.鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验（1）根据鲎试剂灵敏度的标示值（）根据鲎试剂灵敏度的标示值（），将细菌内毒），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，然后制成检查用水溶解，然后制成2 、0.5 和和0.25 共共4个个浓度浓度的内毒素标准溶液。的内毒素标准溶液。标示值（标示值（）：购买的鲎试剂所标示的标示灵敏度。也就是该）：购买的鲎试剂所标示的标示灵敏度。也就是该鲎试剂按照规定方法能检测到样品中内
23、毒素的浓度，单位：鲎试剂按照规定方法能检测到样品中内毒素的浓度，单位：EU/ml举例举例-注射用硫酸链霉素中细菌内毒注射用硫酸链霉素中细菌内毒素的检查素的检查一、试剂和样品一、试剂和样品鲎鲎试试剂剂（批批号号：040317 灵灵敏敏度度：0.25EU/ml；规规格格均均为为0.1ml/支；湛江海洋生物制品厂生产）支；湛江海洋生物制品厂生产）细细菌菌内内毒毒素素检检查查用用水水（批批号号：031229 规规格格：2ml/支支；湛江海洋生物制品厂生产）湛江海洋生物制品厂生产）细细菌菌内内毒毒素素工工作作标标准准品品（内内毒毒素素工工作作标标准准品品2004-2，160EU/支支，中国药品生物制品检
24、定所提供），中国药品生物制品检定所提供）注射用硫酸链霉素（规格：注射用硫酸链霉素（规格：1.0 g/1.0ml 批号：批号：20020523 生产厂家：大连美罗大药厂）生产厂家：大连美罗大药厂）0 0.1 1m ml l/支支规规格格鲎鲎试试剂剂原原安安瓿瓿1 18 8支支 0.1ml0.1ml内毒素检查内毒素检查用水用水4 4支支4 4支支4 4支支4 4支支2 2支支2.0 2.0 内毒素溶液内毒素溶液1.0 1.0 内毒素溶液内毒素溶液0.5 0.5 内毒素溶液内毒素溶液0.25 0.25 内毒素溶液内毒素溶液内毒素检查用水内毒素检查用水0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml
25、内毒素工作标准品或国家标准品内毒素工作标准品或国家标准品内毒素检查用水溶解内毒素检查用水溶解15min15min稀稀释释373711保温保温1h1h呈阳性呈阳性呈阴性呈阴性 复溶复溶细菌内毒素检查法凝胶法试验结果（阴、阳性）判定：试验结果（阴、阳性）判定：0 0.1 1m ml l/支支规规格格鲎鲎试试剂剂原原安安瓿瓿1 18 8支支 0.1ml0.1ml内毒素检查内毒素检查用水用水4 4支支4 4支支4 4支支4 4支支2 2支支2.0 2.0 内毒素溶液内毒素溶液1.0 1.0 内毒素溶液内毒素溶液0.5 0.5 内毒素溶液内毒素溶液0.25 0.25 内毒素溶液内毒素溶液内毒素检查用水内
26、毒素检查用水0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml内毒素工作标准品或国家标准品内毒素工作标准品或国家标准品内毒素检查用水溶解内毒素检查用水溶解15min15min稀稀释释373711保温保温1h1h呈阳性呈阳性呈阴性呈阴性结结果果有有效效计算鲎试计算鲎试剂灵敏度剂灵敏度 式中：式中：X X为反应终点浓度的对数值为反应终点浓度的对数值(lg)(lg)。反应终点浓度是指系。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当当cc在在0.50.52.02.0时，方可时，方可用于内毒素检查，并以用于内毒素检查，并以C C 为该为
27、该批鲎试剂灵敏度批鲎试剂灵敏度复溶复溶举例举例-注射用硫酸链霉素中细菌内毒注射用硫酸链霉素中细菌内毒素的检查素的检查2.0 2.0 内毒素溶液内毒素溶液1.0 1.0 内毒素溶液内毒素溶液0.5 0.5 内毒素溶液内毒素溶液0.25 0.25 内毒素溶液内毒素溶液内毒素检查用水内毒素检查用水+阳阳性性c=0.354EU/ml二细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法方法步骤方法步骤 1.1.鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验3.3.凝胶适量试验凝胶适量试验2.2.干扰实验干扰实验目的：检查当所使用的目的：检查当所使用的鲎试剂灵敏度是否与标鲎试剂灵敏度是否与标示灵敏度有差异，是否示
28、灵敏度有差异，是否影响检验结果影响检验结果目的：检查供试品配方、目的：检查供试品配方、检查用的水等试验条件检查用的水等试验条件是否影响实验结果是否影响实验结果目的：检查供试品内毒目的：检查供试品内毒素是否合格素是否合格二细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法2.2.干扰实验干扰实验编号编号内毒素浓度内毒素浓度/配制配制内毒素的溶液内毒素的溶液稀释稀释用液用液稀释稀释倍数倍数所含内毒所含内毒素的浓度素的浓度平行平行管数管数A A无无/供试品溶液供试品溶液2 2B B2/2/供试品溶液供试品溶液供试品溶液供试品溶液1 12 24 48 822110.50.50.250.254 44 44
29、 44 4C C2/2/检查用水检查用水检查用水检查用水1 12 24 48 822110.50.50.250.254 44 44 44 4D D无无/检查用水检查用水2 2举例举例-注射用硫酸链霉素中细菌内毒注射用硫酸链霉素中细菌内毒素的检查素的检查根据根据临床用药须知和化学药品说明书汇编临床用药须知和化学药品说明书汇编表明：表明：人体每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量为：人体每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量为：5.0EU；硫酸链霉素在人均体重硫酸链霉素在人均体重60kg，注射时间，注射时间1小时最大供试品剂小时最大供试品剂量为量为1.2g；p细菌内毒素限值：细菌内毒素限值：L=K
30、M=5.0EU/(kgh)1200mg/(60kgh)=0.25EU/mg举例举例-注射用硫酸链霉素中细菌内毒注射用硫酸链霉素中细菌内毒素的检查素的检查p确定最大有效稀释倍数确定最大有效稀释倍数(MVD)：MVD=CL=1000mg/ml 0.25EU/mg0.25EU/mg=1000倍倍二细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法2.2.干扰实验干扰实验按表制备溶液按表制备溶液A、B、C和和D，使用的供试品溶液应，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试
31、验项下操作。作。二细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法2.2.干扰实验干扰实验编号编号内毒素浓度内毒素浓度/配制配制内毒素的溶液内毒素的溶液稀释稀释用液用液稀释稀释倍数倍数所含内毒所含内毒素的浓度素的浓度平行平行管数管数A A无无/供试品溶液供试品溶液2 2B B2/2/供试品溶液供试品溶液供试品溶液供试品溶液1 12 24 48 822110.50.50.250.254 44 44 44 4C C2/2/检查用水检查用水检查用水检查用水1 12 24 48 822110.50.50.250.254 44 44 44 4D D无无/检查用水检查用水2 2二细菌内毒素的鲎试剂检查法细
32、菌内毒素的鲎试剂检查法2.2.干扰实验干扰实验前提：前提：A和和D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。效。按下列计算系列溶液按下列计算系列溶液C和和B的反应终点浓度的几何平的反应终点浓度的几何平均值（均值（Es和和Et）。）。Es=lg-1（Xs/4)Et=lg-1（Xt/4)式中式中 Es、Et分别为系列溶液分别为系列溶液C和溶液和溶液B反应终点浓度反应终点浓度的对数值的对数值(lg)。二细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法2.2.干扰实验干扰实验当当Es
33、在在0.52(包括包括0.5 和和2）及）及0.5Es2Es（包括（包括0.5Es和和2Es）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，的进一步稀释，再重复干扰试验。再重复干扰试验。注：注：A为供试品溶液；为供试品溶液；B为干扰试验系列；为干扰试验系列；C为鲎试为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。为阴性对照。二细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法方法步骤方法步
34、骤 1.1.鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验3.3.凝胶适量试验凝胶适量试验2.2.干扰实验干扰实验目的：检查当所使用的目的：检查当所使用的鲎试剂灵敏度是否与标鲎试剂灵敏度是否与标示灵敏度有差异，是否示灵敏度有差异，是否影响检验结果影响检验结果目的：检查供试品配方、目的：检查供试品配方、检查用的水等试验条件检查用的水等试验条件是否影响实验结果是否影响实验结果目的：检查供试品内毒目的：检查供试品内毒素是否合格素是否合格二细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法3.3.凝胶适量试验凝胶适量试验编号编号内毒素浓度内毒素浓度/配制内毒素的配制内毒素的溶液溶液平行管数平行管数 A A无无
35、/供试品溶液供试品溶液2 2 B B2/2/供试品溶液供试品溶液2 2 C C2/2/检查用水检查用水2 2 D D无无/检查用水检查用水2 2 二细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法3.3.凝胶适量试验凝胶适量试验结果的判断及处理：结果的判断及处理：1.若阴性对照溶液若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳的平行管均为阴性，供试品阳性对照性对照B的平行管均为阳性，阴性对照溶液的平行管均为阳性，阴性对照溶液C的平的平行管均为阳性，试验有效；行管均为阳性，试验有效；二细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法3.3.凝胶适量试验凝胶适量试验结果结果判定判定 +编号编号内毒素浓
36、度内毒素浓度/配制内毒素的配制内毒素的溶液溶液平行管数平行管数 A A无无/供试品溶液供试品溶液2 2 B B2/2/供试品溶液供试品溶液2 2 C C2/2/检查用水检查用水2 2 D D无无/检查用水检查用水2 2 二细菌内毒素的鲎试剂检查法细菌内毒素的鲎试剂检查法3.3.凝胶适量试验凝胶适量试验结果的判断及处理：结果的判断及处理：1.若溶液若溶液A的两个平行管均为阴性，判供试品符合的两个平行管均为阴性，判供试品符合规定；规定；2.若溶液若溶液A的两个平行管均为阳性，判不符合规定；的两个平行管均为阳性，判不符合规定；3.若溶液若溶液A的两个平行管一管为阳性一管为阴性，的两个平行管一管为阳性
37、一管为阴性，另取另取4支进行复试。复试时，若所有平行管均为支进行复试。复试时，若所有平行管均为阴性，则符合规定，否则不符合规定。阴性，则符合规定，否则不符合规定。举例举例-注射用硫酸链霉素中细菌内毒注射用硫酸链霉素中细菌内毒素的检查素的检查结果结果判定判定 +编号编号内毒素浓度内毒素浓度/配制内毒素的配制内毒素的溶液溶液平行管数平行管数 A A无无/供试品溶液供试品溶液2 2 B B2/2/供试品溶液供试品溶液2 2 C C2/2/检查用水检查用水2 2 D D无无/检查用水检查用水2 2 举例举例-注射用硫酸链霉素中细菌内毒注射用硫酸链霉素中细菌内毒素的检查素的检查结果结果判定判定 +编号编号内毒素浓度内毒素浓度/配制内毒素的配制内毒素的溶液溶液平行管数平行管数 A A无无/供试品溶液供试品溶液4 4 不符合规定不符合规定01热原检查技术无菌和微生物限度检查技术02目录