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1、第二章酶的生物合成法生产 固体培养发酵得培养基,以麸皮、米糠等为主要原料,加入其她必要得营养成分,制成固体或麸曲,经过灭菌、冷却后,接种产酶微生物菌株,在一定条件下进行发酵,以获得所需得酶。我国传统得各种酒曲、酱油曲等都就是采用这种方式进行生产。其主要目得就是获得所需得淀粉酶类与蛋白酶类,以催化淀粉与蛋白质得水解。固体培养发酵得优点就是设备简单,操作方便,麸曲中酶得浓度较高,特别适用于各种霉菌得培养与发酵产酶;其缺点就是劳动强度较大,原料利用率较低,生产周期较长。液体深层发酵就是采用液体培养基,置于生物反应器中,经过灭菌、冷却后,接种产酶细胞,在一定得条件下,进行发酵,生产得到所需得酶。液体深
2、层发酵不仅适合于微生物细胞得发酵生产,也可以用于植物细胞与动物细胞得培养。液体深层发酵得机械化程度较高,技术管理较严格,酶得产率较高,质量较稳定,产品回收率较高,就是目前酶发酵生产得主要方式。固定化细胞发酵就是20世纪70年代后期,在固定化酶得基础上发展起来得发酵技术。固定化细胞就是指固定在水不溶性得载体上,在一定得空间范围内进行生命活动得细胞。固定化细胞发酵具有:细胞密度大,可提高产酶能力;发酵稳定性好,可以反复使用或连续使用较长得时间;细胞固定在载体上,流失较少,可以在高稀释率得条件下连续发酵,利于连续化、自动化生产;发酵液中含菌体较少,利于产品分离纯化,提高产品质量等显著特点。固定化原生
3、质体技术就是20世纪80年代中期发展起来得技术。固定化原生质体就是指固定在载体上,在一定得空间范围内进行生命活动得原生质体。原生质体由于去除了细胞壁这一扩散障碍,有利于胞内物质透过细胞膜分泌到细胞外。这样就可以不经过细胞破碎而直接从发酵液中分离得到所需得发酵产物,为胞内物质得生产开辟了新途径。由于有载体得保护作用,固定化原生质体有较好得稳定性,可以反复使用或连续使用较长一段时间。一、常用得产酶微生物 用于酶得生产得细胞必须具备几个条件 酶得产量高 容易培养与管理 产酶稳定性好 利于酶得分离纯化 安全可靠,无毒性常用得产酶微生物 1、大肠杆菌(Escherichia coli)大肠杆菌细胞有得呈
4、杆状,有得近似球状,大小为0、5m(1、03、0)m,一般无荚膜,无芽孢,革兰氏染色阴性,运动或不运动,运动者周生鞭毛。菌落从白色到黄白色,光滑闪光,扩展。革兰氏染色法就是细菌学中广泛使用得一种鉴别染色法,1884年由丹麦医师Gram 创立 细菌先经碱性染料结晶染色,而经碘液媒染后,用酒精脱色,在一定条件下有得细菌此色不被脱去,有得可被脱去,因此可把细菌分为两大类,前者叫做革兰氏阳性菌(G+)、大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点 可以互相讨论下，但要小声点 大肠杆菌谷氨酸脱羧酶,用于测定谷氨酸含量或用于生产-氨基丁酸;大肠杆菌天冬氨酸酶,用于催化延胡索酸加氨生产L-天冬氨酸
5、;大肠杆菌青霉素酰化酶,用于生产新得半合成青霉素或头孢霉素;大肠杆菌天冬酰胺酶,对白血病具有显著疗效;大肠杆菌-半乳糖苷酶,用于分解乳糖或其她-半乳糖苷。2、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)枯草杆菌就是芽孢杆菌属细菌。细胞呈杆状,大小为(0、70、8)m(2 3)m,单个细胞,无荚膜,周生鞭毛,运动,革兰氏染色阳性。芽孢(0、60、9)m(1、01、5)m,椭圆至柱状。菌落粗糙,不透明,不闪光,扩张,白色或微带黄色。枯草芽孢杆菌就是应用最广泛得产酶微生物,可以用于生产a-淀粉酶,蛋白酶,-葡聚糖酶,5 核苷酸酶,碱性磷酸酶等。例如,枯草杆菌BF7658 就是国内用于生产a-淀粉
6、酶得主要菌株;枯草杆菌ASl、398用于生产中性蛋白酶与碱性磷酸酶。3、黑曲霉(Aspergillusniger)黑曲霉就是曲霉属黑曲霉群霉菌。菌丝体由具有横膈得分支菌丝构成,菌丛黑褐色,顶囊大球形,小梗双层,分生孢子球形,平滑或粗糙。黑曲酶可用于生产多种酶,有胞外酶也有胞内酶。例如,糖化酶,a-淀粉酶,酸性蛋白酶,果胶酶,葡萄糖氧化酶,过氧化氢酶,核糖核酸酶,脂肪酶,纤维素酶,橙皮苷酶,柚苷酶等。4、米曲酶(Aspergillus oryzae)米曲霉就是曲霉属黄曲霉群霉菌。菌丛一般为黄绿色,后变为黄褐色,分生孢子头呈放射形,顶囊球形或瓶形,小梗一般为单层,分生孢子球形,平滑,少数有刺,分生
7、孢子梗长达2mm 左右,粗糙。米曲霉中糖化酶与蛋白酶得活力较强,这使米曲霉在我国传统得酒曲与酱油曲得制造中广泛应用。此外,米曲霉还可以用于生产氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶、核酸酶P 等。5、青霉(Penicillium)青霉属半知菌纲。其营养菌丝体无色、淡色或具有鲜明得颜色,有横膈,分生孢子梗亦有横膈,光滑或粗糙,顶端形成帚状分枝,小梗顶端串生分生孢子,分生孢子球形、椭圆形或短柱形,光滑或粗糙,大部分在生长时呈蓝绿色。有少数种会产生闭囊壳,其内形成子囊与子囊孢子,亦有少数菌种产生菌核。青霉菌种类很多,其中产黄青霉(Penzcilliumchrysogenum)用于生产葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青
8、霉素酰化酶(主要作用于青霉素)、果胶酶、纤维素酶等。橘青霉(Penicilliumcityrinum)用于生产5,磷酸二酯酶、脂舫酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶S1、核酸酶P1 等。6、木霉(Trichoderma)木霉属于半知菌纲。生长时菌落生长迅速,呈棉絮状或致密丛束状,菌落表面呈不同程度得绿色,菌丝透明,有分隔,分枝繁复,分枝上可继续分枝,形成二级分枝、三级分枝,分支末端为小梗,瓶状,束生、对生、互生或单生,分生孢子由小梗相继生出,靠黏液把她们聚成球形或近球形得孢子头。分生孢子近球形、椭圆形、圆筒形或倒卵形。光滑或粗糙,透明或亮黄绿色。木霉就是生产纤维素酶得重要菌株。木霉生产得纤维
9、素酶中包含有C1 酶、Cx 酶与纤维二糖酶等。此外,木霉中含有较强得17a-羟化酶,常用于甾体转化。7、根霉(Rhizopus)生产糖化酶、a淀粉酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。8、毛霉(Mucor)毛霉常用于生产蛋白酶、糖化酶、a淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。9、红曲霉红曲霉可用于生产a-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。10、链霉菌链霉菌就是生产葡萄糖异构酶得主要微生物。还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。二、发酵工艺条件及其控制微生物发酵产酶得工艺流程 保藏得菌种在用于发酵生产之前,必须接种于新鲜得固
10、体培养基上,在一定得条件下进行培养,使细胞得生命活性得以恢复,这个过程称为细胞活化。活化了得细胞需在种子培养基中经过一级乃至数级得扩大培养,以获得足够数量得优质细胞。种子扩大培养所使用得培养基与培养条件,应当适合细胞生长、繁殖得最适条件。(二)培养基得配制 1、培养基得基本组分(1)碳源作用？如何选择？在酶得生物合成法生产中,首先要从细胞得营养要求与代谢调节方面考虑碳源得选择,此外还要考虑到原料得来源就是否充裕、价格就是否低廉、对发酵工艺条件与酶得分离纯化有否影响等因素。A 不同得细胞对碳源得利用有所不同,在配制培养基时,应当根据细胞得营养需要而选择不同得碳源。目前,大多数产酶微生物采用淀粉或
11、其水解产物,如糊精、淀粉水解糖、麦芽糖、葡萄糖等为碳源。例如,黑曲霉具有淀粉酶系,可以采用淀粉为碳源;酵母不能利用淀粉,只能采用蔗糖或葡萄糖等为碳源等。植物细胞主要采用蔗糖为碳源;具有叶绿体得植物与藻类可以利用二氧化碳为碳源等。B 在酶得发酵生产过程中,除了根据细胞得不同营养要求以外,还要充分注意到某些碳源对酶得生物合成具有代谢调节得功能。(2)氮源 作用？分类？氮源可以分为有机氮源与无机氮源两大类。酪蛋白、豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、蛋白水解液、多肽、氨基酸、氨水、硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠等铵盐与硝酸盐属于什么氮源？选择？动物细胞、植物细胞、微生物细胞？(3)无机
12、盐 作用无机盐得主要作用就是提供细胞生命活动所必不可缺得各种无机元素,并对细胞内外得pH 值、氧化还原电位与渗透压起调节作用。分类根据细胞对无机元素需要量得不同,无机元素可以分为大量元素与微量元素两大类。大量元素主要有:磷、硫、钾、钠、钙、镁、氯等;微量元素就是指细胞生命活动必不可少,但就是需要量微小得元素,主要包括:铜、锰、锌、钼、钴、溴、碘等。微量元素得需要量很少,过量反而对细胞得生命活动有不良影响,必须严加控制。(4)生长因素 生长因素就是指细胞生长繁殖所必需得微量有机化合物,主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素以及动、植物生长激素等。在酶得发酵生产中,一般在培养基中添加含有多种生长因
13、素得天然原料得水解物,如酵母膏、玉米浆、麦芽汁、麸皮水解液等,以提供细胞所需得各种生长因素;也可以加入某种或某几种提纯得有机化合物,以满足细胞生长繁殖之需。2、微生物发酵产酶得几种发酵培养基(1)枯草杆菌BF7658a-酶发酵培养基:玉米粉8,豆饼粉4,磷酸氢二钠0、8%,氯化钙0、2%,氯化铵0、15(自然pH 值)。(2)枯草杆菌AS1、398中性蛋白酶发酵培养基:玉米粉4,豆饼粉3,麸皮3、2,糠1,磷酸氢二钠0、4,磷酸二氢钾0、03(自然pH 值)。(3)黑曲霉糖化酶发酵培养基:玉米粉10,豆饼粉4,麸皮1(pH4、45、0)。(4)地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶发酵培养基:玉米粉5
14、、5,豆饼4,磷酸氢二钠0、4,磷酸二氢钾0、03(pH8、5)。(三)pH 值得调节控制 不同得细胞,其生长繁殖得最适pH 值有所不同。细胞发酵产酶得最适pH 值与生长最适pH 值往往有所不同。有些细胞可以同时产生若干种酶,在生产过程中,通过控制培养基得pH 值,往往可以改变各种酶之间得产量比例。随着细胞得生长繁殖与新陈代谢产物得积累,培养基得pH 值往往会发生变化。在发酵过程中,必须对培养基得pH 值进行适当得控制与调节。调节PH 值得方法可以通过改变培养基得组分或其比例;也可以使用缓冲液来稳定pH 值;或者在必要时通过滴加适宜得酸、碱溶液得方法调节培养基得pH值,以满足细胞生长与产酶得要
15、求。(四)温度得调节控制 不同得细胞有各自不同得最适生长温度。例如,枯草杆菌得最适生长温度为3437,黑曲霉得最适生长温度为2832等。有些细胞发酵量得最适温度与细胞生长最适温度有所不同,而且往往低于生长最适温度。在细胞生长与发酵产酶过程中,由于细胞得新陈代谢作用,会不断放出热量,使培养基得温度升高,同时,由于热量得不断扩散,会使培养基得温度不断降低。两者综合结果,决定了培养基得温度。由于在细胞生长与产酶得不同阶段,细胞新陈代谢放出得热量有较大差别,散失得热量又受到环境温度等因素得影响,使培养基得温度发生明显得变化。为此必须经常及时地对温度进行调节控制,使培养基得温度维持在适宣得范围内。温度得
16、调节一般采用热水升温、冷水降温得方法。为了及时地进行温度得调节控制,在发酵罐或其她生物反应器中,均应设有足够传热面积得热交换装置,如排管、蛇管、夹套、喷淋管等,并且随时备有冷水与热水,以满足温度调控得需要。(五)溶解氧得调节控制 调节溶解氧得方法主要有以下几种。(1)调节通气量(2)调节氧得分压提高氧得分压,可以增加氧得溶解度,从而提高溶氧速率。(3)调节气液接触时间(4)调节气液接触面积(5)改变培养液得性质(六)提高酶产量得措施 1、添加诱导物 诱导物一般可以分为3类:酶得作用底物、酶得催化反应产物与作用底物得类似物。2、控制阻遏物得浓度阻遏作用根据其作用机理得不同,可以分为产物阻遏与分解
17、代谢物阻遏两种。控制阻遏物得浓度就是解除阻遏、提高酶产量得有效措施。例如,作者等人研究表明,枯草杆菌碱性磷酸酶得生物合成受到其反应产物无机磷酸得阻遏,当培养基中无机磷酸得含量超过1、0mmol L 得时候,该霉得生物合成完全受到阻遏。当培养基中无机磷酸得含量降低到0、01mmol L 得时候,阻遏解除,该酶大量合成。所以,为了提高该酶得产量,必须限制培养基中无机磷得含量。3、添加表面活性剂 表面活性剂可以与细胞膜相互作用,增加细胞得透过性,有利于胞外酶得分泌,从而提高酶得产量。4、添加产酶促进剂 产酶促进剂就是指可以促进产酶、但就是作用机理未阐明清楚得物质。在酶得发酵生产过程中,添加适宜得产酶
18、促进剂,往往可以显著提高酶得产量。例如,添加一定量得植酸钙镁,可使霉菌蛋白酶或者橘青霉磷酸二酯酶得产量提高120倍(七)微生物发酵产酶:实例 微生物发酵产酶就是目前酶生产得主要方法。微生物种类繁多,产酶品种多样。现以纳豆杆菌液体发酵生产纳豆激酶为例说明微生物发酵产酶得基本条件与过程。纳豆激酶(nattokinase,简称NK)就是1987年日本得须见洋行从日本传统食品纳豆中分离得到得一种具有溶血栓功效得蛋白酶,可以通过枯草杆菌(Bacillussubtis)或纳豆杆菌(Bacillusnatto)发酵得到。从1997年开始,郭勇等人进行了纳豆杆菌发酵纳豆激酶得研究,取得可喜成果。现将发酵工艺过
19、程介绍如下。菌株:纳豆杆菌。固体培养基:蛋白胨1,牛肉膏0、5,NaC10、5,琼脂2%(自然pH 值)。液体培养基:葡萄糖2,大豆蛋白胨3,磷酸氢二钠0、6,磷酸二氢钠0、1%,氯化钙0、02%,硫酸镁0、05(pH7、0)。工艺过程:保藏菌株菌种活化(固体培养基,37培养24h)种子培养(液体培养基,37培养24h)发酵(液体培养基,接种量23,37发酵72h)发酵液分离纯化纳豆激酶。三、固定化微生物细胞发酵产酶 固定化细胞又称固定化活细胞或固定化增殖细胞,就是指采用各种方法固定在载体上,在一定得空间范围内进行生长、繁殖与新陈代谢得细胞。固定化细胞就是20世纪70后期发展起来得技术。已成功
20、生产了-淀粉酶、糖化酶、果胶酶、纤维素酶、溶菌酶、天冬酰胺酶等。(一)、固定化细胞发酵产酶得特点 1、提高产酶率 2、可以反复使用或连续使用较长时间 3、基因工程菌得质粒稳定,不易丢失 4、发酵稳定性好 5、缩短发酵周期,提高设备利用率 6、产品容易分离纯化 7、适于胞外酶等胞外产物得生产(二)、固定化细胞发酵产酶得工艺条件控制 1、固定化细胞得预培养 2、溶解氧得供给 3、温度得控制 4、培养基组分得控制 培养基得某些组分可能影响某些固定化载体得结构,为了保持固定化细胞得完整结构,应控制其含量。如采用海藻酸钙凝胶制备得固定化细胞,培养基中过量得磷酸盐会使其结构受到破坏,应限止,在培养基中添加
21、一定浓度得钙离子,可以保持固定化细胞得稳定性。四、固定化微生物原生质体发酵产酶 固定化原生质体就是指固定在载体上,在一定得空间范围内进行生命活动得原生质体。原生质体就是除去细胞壁后由细胞膜及胞内物质组成得微球体。原生质体由于除去了细胞壁这一扩散屏障,有利于胞内物质透过细胞膜分泌到细胞外,可以用于胞内酶等胞内产物得生产。(一)、固定化原生质体得特点 1、变胞内产物为胞外产物固定化黑曲霉原生质体生产葡萄糖氧化酶,使细胞内葡萄糖氧化酶得90以上分泌到细胞外。2、提高产酶率固定化枯草芽孢杆菌原生质体生产碱性磷酸酶,使原来存在于细胞间质中得碱性磷酸酶全部分泌到发酵液中,产酶率提高36。3、稳定性好 4、
22、易于分离纯化(二)、固定化原生质体发酵产酶得工艺条件控制 1、渗透压得控制添加渗透压稳定剂 2、防止细胞壁再生添加青霉素等抑制细胞壁生长得物质,以保持固定化原生质体得特性 3、保证原生质体得浓度 由于固定化原生质体影响了细胞得生长繁殖,在制备时,应保证原生质体得浓度达到一定得水平。细胞种类 植物细胞 微生物细胞 动物细胞细胞大小/m20300 110 10100倍增时间/h120、30、615营养要求 简单 简单 复杂光照要求 大多要求 不要求 不要求对剪切力得敏感性敏感 大多数不敏感 敏感主要产物 色素、药物、香精醇、氨基酸、抗生素、核苷酸、有机酸、酶等疫苗、激素、单克隆抗体、酶等一、植物细
23、胞得特性 体积大 生长速率与代谢速率比微生物低 营养要求简单 要求一定得光照时间与光照强度 对剪切力敏感,这在生物反应器得研制与培养过程通风、搅拌方面要严加控制 目得产物不同二、植物细胞培养得特点 1、提高产率 实例日本三井石油化学工业公司于1983年在世界上首次成功采用紫草细胞培养生产紫草宁,750L 反应器,培养23天,细胞中紫草宁得含量达到细胞干重得14,比紫草根中紫草宁得含量高10倍。P68 紫草就是我国传统中草药,其中得有效成分为一系列萘醌类化合物,具有凉血、活血、解毒与透疹得作用。用于子宫颈炎、外阴炎、尿布性皮炎、中耳炎、烫伤、刀伤、湿疹、水疱及其她皮肤病。紫草辅助米非司酮可提高流
24、产成功率。具有抗垂体促性腺激素得作用,可以用于经期综合征,可以预防麻疹,有消肿作用,避孕作用。其中紫草宁具有抗肿瘤及活性,对细胞增殖有一定得抑制作用。减少自发性乳癌得发病率,对肝癌与肺癌有一定得放射增敏作用。紫草宁可以提取红色素,紫草油以及紫草可生产紫草等紫草系列保健品。可以作为如化妆品口红、胭脂、粉饼、食品饮料、熏肉、医药胶囊、防晒制品及印染等着色剂与添加剂。大规模细胞培养生物反应器市场前景及经济效益分析:以年产能力50公斤紫草宁为例,国际市场价(精品干粉)每公斤价格为5000-7000 美元,预计每年新增利税25-35 万美元。除此之外,紫草宁因其色泽鲜艳,附着力强被国际誉为红色素之王,可
25、作为保健食品、保健饮品、保健化妆品得添加剂。2、缩短周期细胞培养倍增时间一般为1260h,一般生产周期1530d,与完整植株比较,大大缩短了生产周期。3、易于管理,减轻劳动强度 4、提高产品质量产物浓度较高,杂质少;污染少,易于分离纯化。5、缺点与微生物相比,植物细胞对剪切力敏感,生产周期长,需光照。这些会在植物细胞生物反应器得设计与工艺条件控制等方面引起一系列得问题,必须考虑与解决。三、植物细胞培养产酶得工艺条件及其控制(一)、工艺流程 外植体-诱导愈伤组织-细胞培养-分离纯化-酶(二)、植物细胞培养得培养基 1、植物细胞培养基得特点 观察思考P70 植物细胞培养基得特点？植物细胞培养产酶实
26、例 据报道,已经研究过200多种植物细胞培养,其产物超过400中。其中通过植物细胞培养产生得酶有10多种,如表所示。酶 产酶植物细胞(年份)糖苷酶过氧化物酶糖化酶木瓜蛋白酶超氧化物岐化酶菠萝蛋白酶胡萝卜细胞(1981)甜菜细胞1983,大豆细胞1989甜菜细胞1988番木瓜细胞1990大蒜细胞1993菠萝细胞1995 阅读大蒜细胞培养生产SOD 实例,说明植物细胞培养产酶工艺过程及调节控制。SOD 就是催化超氧负离子进行氧化还原反应得氧化还原酶,具有抗辐射、抗氧化、抗衰老得功效。SOD 可以从动物、植物与微生物细胞中提取分离得到。郭勇教授从1992年开始进行大蒜细胞培养生产超氧化物岐化酶得研究
27、取得可喜成果。工艺过程简介如下。1、大蒜愈伤组织得诱导 选取结实、饱满、无病虫害得大蒜蒜瓣,在4冰箱中放置3周,以打破休眠。去除外皮,先用70乙醇消毒20s,再用0、1氯化汞消毒10min,再用无菌水漂洗3次。在无菌条件下,切成0、5cm 得小块,植入含有3mg/L2,4D(2,4二氯苯氧乙酸)与1、2mg/L6-BA(苄基酰嘌呤)得半固体MS培养基中,25,600lux,12h/d 光照得条件下培养18d,诱导得到愈伤组织。光照度与勒克斯:光照度就是表明物体被照明程度得物理量。光照度与照明光源、被照表面及光源在空间得位置有关,大小与光源得光强与光线得入射角得余玄成正比,而与光源至被照物体表面
28、得距离得平方成反比。光照度可用照度计直接测量。光照度得单位就是勒克斯,英文lux 得音译,也可写为lx。被光均匀照射得物体,在1平方米面积上所得得光通量就是1流明时,它得照度就是1勒克斯。有时为了充分利用光源,常在光源上附加一个反射装置,使得某些方向能够得到比较多得光通量,以增加这一方向被照面上得照度。例如摄像、摄影照明灯、手电筒与汽车前灯等都装有反光镜。以下就是各种环境照度值:单位lux黑夜0、001-0、02月夜0、02-0、3阴天室内5-50阴天室外50-500晴天室内100-1000夏季中午太阳光下得照度约为109阅读书刊时所需得照度50-60电视演播室所需照度3002000家用摄像机
29、所需最小照度0、3-1家用摄像机标准照度1400 2、大蒜细胞悬浮培养 将上述在半固体MS培养基上培养18d 得愈伤组织在无菌条件下转入含有3mg/L2,4D(2,4二氯苯氧乙酸)与1、2mg/L6-BA(苄基酰嘌呤)得液体培养基中,加入灭菌得玻璃珠,25,600lux,12h/d 光照得条件下震荡培养培养18d,使愈伤组织分散成小细胞团或单细胞。然后在无菌条件下,经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L2,4D(2,4二氯苯氧乙酸)与1、2mg/L6-BA(苄基酰嘌呤)得液体MS培养基中,25,600lux,12h/d 光照得条件下培养18d。3、酶得分离纯化 4、细胞培养完成后,收集细
30、胞,经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物岐化酶。第三节 动物细胞培养产酶 所谓动物细胞大规模培养技术(large-scaleculturetechnology)就是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等),在细胞生物反应器(bioreactor)中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品得技术。目前可大规模培养得动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho(中华仓鼠卵巢)细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞,就是贴壁依赖得成纤维细胞)等,并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。
31、目前已实现商业化得产品有:口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、疱疮病毒疫苗、巨细胞病毒疫苗、及 干扰素、血纤维蛋白溶酶原激活剂、凝血因子与、促红细胞素、松弛素、生长激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽释放酶及200种单克隆抗体等。其中,口蹄疫疫苗就是动物细胞大规模培养方法生产得主要产品之一。1983年,英国Welle 公司就已能够利用动物细胞进行大规模培养生产口蹄疫疫苗。美国Genentech 公司应用SV40 为载体,将乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳动物细胞内进行高效表达,已生产出乙型肝炎疫苗。英国Welle 公司采用8000LNamalwa 细胞
32、生产 干扰素。英国Celltech 公司用气升式生物反应器生、与 干扰素;用无血清培养液在10000L 气升式生物反应器中培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。美国Endotronic 公司用中空纤维生物反应器大规模培养动物细胞生产出免疫球蛋白G、A、M 与尿激酶、人生长激素等。动物细胞培养主要用于生产:疫苗、激素、多肽生长因子、酶、单克隆抗体、非抗体免疫调节剂。白介素与机体免疫功能有关,白介素-2 促进淋巴细胞分化增殖。乙型肝炎疫苗,预防乙肝。集落刺激因子,可减轻化疗时副作用,可用于爱滋病、白血病。肿瘤坏死因子,可损伤癌细胞。研制更新一代得药物与更新得应用方法,集落刺激因子与白介素得基因构建到酵母细
33、胞中,使之产生融合蛋白质,药效增强。生产方法从利用重组DNA 得微生物生产转向利用动植物来生产蛋白质类药物,构建新型多价活疫苗。一、动物细胞得特性 没有细胞壁,适应环境得能力差,脆弱 体积比微生物大几千倍,但就是稍小于植物细胞得体积。在机体内相互粘连以集群形式形式存在,在细胞培养中大部分细胞具有群体效应、锚地依赖型、接触抑制性以及功能全能性。动物细胞得营养要求较复杂,必须供给各种氨基酸、维生素、激素与生长因子等。动物细胞培养基中一般需要加进510得血清。二、动物细胞培养得特点 动物细胞培养主要用于各种功能蛋白质得生产 生长较慢,细胞倍增时间15100h 为防止微生物污染,在培养过程中,需要添加
34、抗生素。动物细胞体积大,无细胞壁保护,对剪切力敏感,所有在培养过程中,必须严格控制温度、PH、渗透压、通风搅拌等条件,以免破坏细胞 大多数细胞适宜采用贴壁培养,来自血液、淋巴组织得细胞、肿瘤细胞与杂交瘤细胞可以采用悬浮培养。动物细胞培养基成分复杂,一般要添加血清或其代用品,产物得分离纯化过程较复杂,成本高 原代细胞培养50代后,即会退化死亡,需要重新分离细胞。三、动物细胞培养方式 细胞具有四大生物学特征:锚地依赖性:细胞必须附在固体上或固定得表面,才能生长分裂。血清依赖性:细胞必须具有生长因子,才能生长。接触抑制性:细胞与细胞接触后,生长便受到抑制。形态依赖性:细胞称扁平状,并有长纤维网状结构
35、。依据在体外培养时对生长基质依赖性差异,动物细胞可分为两类:贴壁依赖型细胞:需要附着于带适量电荷得固体或半固体表面才能生长,大多数动物细胞,包括非淋巴组织细胞与许多异倍体细胞均属于这一类。非贴壁依赖型细胞:无需附着于固相表面即可生长,包括血液、淋巴组织细胞、许多肿瘤细胞及某些转化细胞。1、悬浮培养 就是指细胞在反应器中自由悬浮生长得过程。主要用于非贴壁依赖型细胞培养,如杂交瘤细胞等;就是在微生物发酵得基础上发通起来得。无血清悬浮培养就是用已知人源或动物来源得蛋白或激素代替动物血清得一种细胞培养方式,它能减少后期纯化工作,提高产品质量,正逐渐成为动物细胞大规模培养得研究新方向。2、贴壁培养 贴壁
36、培养(attachmentculture)就是指细胞贴附在一定得固相表面进行得培养。、生长特性:贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养(瓶)器皿壁上,细胞一经贴壁就迅速铺展,然后开始有丝分裂,并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面,并形成致密得细胞单层。、贴壁培养得优点:容易更换培养液;细胞紧密黏附于固相表面,可直接倾去旧培养液,清洗后直接加入新培养液。容易采用灌注培养,从而达到提高细胞密度得目得;因细胞固定表面,不需过滤系统。当细胞贴壁于生长基质时,很多细胞将更有效得表达一种产品。同一设备可采用不同得培养液/细胞得比例。适用于所有类型细胞。、贴壁培养得缺点:与悬浮培养法相比 扩大培养比较
37、困难,投资大;占地面积大;不能有效监测细胞得生长;动物细胞培养反应器动物细胞培养产酶得工艺条件及其控制(一)、动物细胞培养基得组成成分 无机盐:CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4。对调节细胞渗透压、某些酶得活性及溶液得酸碱度都就是必须 氨基酸:缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它们都就是细胞用以合成蛋白质得必需原料,不能由其她氨基酸或糖类转化合成。除此之外,还需要谷氨酰胺(glutamine)。维生素:就是维持细胞生长得一种生物活性物质,在细胞中大多形成酶得辅基或辅酶,对细胞代谢有重大影响。脂溶性维生素(A、D、E、K)
38、常从血清中得到补充。水溶性维生素包括牛物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素与B12。维生素C 也就是不可缺少得,对具有合成胶原能力得细胞更为重要。碳水化合物:就是细胞生命得能量来源,有得就是合成蛋白质与核酸得成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖与丙酮酸钠等。体外培养动物细胞时,几乎所有培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含得能源物质。无血清培养基(serumfreemedium,SFM):就是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖得合成培养基。但就是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制得完全培养基可以满足大部分细胞培养得要求,但对有些实验却不适合
39、,如观察一种生长因子对某种细胞得作用,这时需要排除其她生长因子得干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子;又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质(抗体、生长因子)得能力;或者要大规模得培养某种细胞,以获得它们得分泌产物。因此研制出无血清培养基一直就是生物科学工作者努力得目标。上海恒利安生物科技有限公司已成功开发了商业化得多种无血清培养基,可满足众多厂商得需求。无血清培养基得基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。添加组分包括以下几大类物质:(1)促贴壁物质:许多细胞必须贴壁才能生长,这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁与扩展因子,一般为细胞外基质,如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它
40、们还就是重要得分裂素以及维持正常细胞功能得分化因子,对许多细胞得繁殖与分化,起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞得贴壁与分化,这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO 细胞、成肌细胞等。(2)促生长因子及激素:针对不同细胞添加不同得生长因子。激素也就是刺激细胞生长、维持细胞功能得重要物质,有些激素就是许多细胞必不可少得,如胰岛素。(3)酶抑制剂:培养贴壁生长得细胞,需要用胰酶消化传代,在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂,以终止酶得消化作用,达到保护细胞得目得。最常用得就是大豆胰酶;抑制剂。(4)结合蛋白与转运蛋白:常见如转铁蛋白与牛血清白蛋白。牛血清白蛋白得添加比较大,可增加培养基得粘度,保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养得无血清培养基都含有牛血清白蛋白。(5)微量元素:硒就是最常见得。(二)、温度控制 36、5允许波动范围在0、25(三)、PH 得控制 7、07、4微碱性通常用CO2与NaHCO3缓冲系统,用酚红监测蓝红色7、6,红色7、4,橙色7、0,黄色6、5(四)、渗透压700850kPa(五)、溶解氧得控制