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1、实验一蔗糖密度梯度离心分离实验一、实验目的I .熟悉蔗糖密度梯度离心原理2 .熟练掌握蔗糖密度梯度离心操作技术二、实验原理溶液的密度自上而下逐渐变化的分布状态称为密度梯度。在超速离心技术中，样品的密度应该分布在溶液的密度梯度范围内。三、材料、试剂及仪器1.试剂2 0%、4 0%、6 0%、8 0%的蔗糖溶液；墨汁。2 .仪器烧杯，普通离心机，试管若干。四、实验步骤1 .梯度液的制备（1）制备出不同浓度的蔗糖溶液，浓度间隔相同，分别是浓度为2 0%、4 0%、6 0%、8 0%的蔗糖溶液。（2）每个浓度量取相同的体积，按浓度依次减小的顺序逐个缓慢铺入离心管中，制成不连续阶梯密度梯度。（3）此离心
2、管在2 0-2 5 C静 止 2-3 h,通过重力作用即成接近线性的蔗糖密度梯度液。若用细铁丝轻敲离心管，静置时间可以缩短至0.5-l h。温度低时所需静置的时间较长,温度高的时候则较短。为减少对流，静置后应将离心管置于冰浴中备用。2 .蔗糖密度梯度离心向已形成密度梯度的离心管中加入半滴墨汁，加入离心管中离心,3 0 0 0 r/m i n 离 心 l O m i n,观察实验现象。五、结果与分析蔗糖密度梯度离心和差速离心有什么区别？实验二双水相相图的制备一、实验目的1 .了解双水相萃取的原理和发展历史、趋势2 .掌握用浊点法制作双水相系统相图的方法二、实验原理某些亲水性高分子聚合物的水溶液超
3、过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分占很大比例，即形成双水相。常见的双水相系统可分为两类，即双聚合物体系和聚合物/盐体系。双水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是研究双水相萃取的基础。相图是一根双节线，当成相组分的配比在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后溶液澄清透明，称为均相区；当配比在曲线的上方时，能自动分成两相，称为两相区；若配比在曲线上,混合后，溶液恰好由澄清变为浑浊。连接双节线上的两点的直线称为系线，它由三点确定，即 M（初始混合物组成情况）、T C h 相组成情况）、B（下相组成情况），其中T/B互为共扼相。系线越长，两相间的差别越大，当系线长度趋向零时，两相差别消失。
4、系线上系统的总浓度不同，但均分成组成相一 “同体积不同的两相，两相体积服从杠杆规则：V T /V B=B M/MT三、材料、试剂及仪器1.试剂P E G 4 0 0；硫酸铉。2 .仪器漩涡振荡器、微量滴管装置、电子天平。四、实验步骤1.双水相系统的制作（1）精确配制4 3%（g/m l）的（N H O zS O,溶液,并测定其密度。（2）精确称取P E G 4 0 0 液体0.7 g 于试管中，按表格中所列第一号数据，用吸管加入0.5毫升水，缓慢滴加已配制好的（N H 3 S O,溶液，并在混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现浑浊为止，记录（N H J 2 s o l的加入
5、量，根据密度求出重量。（3）按下表列出的第2号数据加入水，使其澄清，继续向试管中滴加（N li a S O,溶液，使其再次达到浑浊。如此反复操作，计算每次达到浑浊时P E G 4 0 0 和（N H,）zS O,在系统总量中的百分含量。序加水量加（N H J 2 s纯（N H）2 s o l纯（N H d）2 s 0,溶液累计P E G 4 0 0（N H,）2S 0 42.相图的绘制号(m l)溶液量（m l）新 增 量（g）累 积 量（g）总量（m l）重量百分比重量百分比1234567以P E G 4 0 0 的重量百分比浓度为纵坐标，（N H M S O,的重量百分比浓度为横坐标作图，
6、即得到一条双节线的相图。五、注意事项1 .微量滴定管在使用前必须先洗涤干净，否则容易产生气泡或发生堵塞现象。洗涤时，不用去污粉，可用倍酸洗液或洗涤液先浸泡一段时间后，用一根细长的刻度移液管刷刷洗刻度处，最后用蒸储水反复冲洗数次。2.清洗干净的微量滴定管必须先用蒸储水试漏，如有漏液，可涂少量凡士林（过量的凡士林会堵塞滴定管）。试漏成功的滴定管要润洗两次，即注液杯、支管、刻度管和出液尖嘴用滴定液洗涤两遍。3.由于支管拐弯处易藏气泡，一般待滴定液放满刻度管后打开支管旋塞用洗耳球将溶液中气泡刚好吹入贮液杯中即可，也可缓慢倾斜滴定管使气泡从口部溢出。4 .滴定过程要注意爱护仪器，轻拿轻放。用（N I L
7、）2s 0 4 滴定时，在接近滴定终点左右时一定要每滴一滴，便彻底混匀后方可滴定下一滴。六、思考问题1 双水相萃取中相图有何意义？2 双水相萃取在分离生物大分子物质时有何意义？实验三牛血清蛋白在双水相萃取系统中的分配一、实验目的1.了解双水相萃取的原理和方法2.双水相系统分离蛋白质的操作二、实验原理某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分占很大比例，即形成双水相。常见的双水相系统可分为两类，即双聚合物体系和聚合物/盐体系。双水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是研究双水相萃取的基础。双缩腺反应是指蛋白质在碱性溶液中与而家铜离子结合生成紫色络合物的反应，双锁
8、尿是由两分子尿素缩合而成的化合物在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红和络合物。因此具有两个或两个以上的肽键的化合物都有双缩J S 反应，其颜色深浅和蛋白质含量成正比。可利用此反应进行蛋白质定性鉴别(4)材料、试剂及仪器1、材料牛血清蛋白2 .试剂P e g6 0 0 0,硫酸镂、硫酸铜、酒石酸钠钾、氢氧化钠、蒸储水。2.仪器离心机、离心管、烧杯、玻璃棒、量筒、天平。四、实验步骤1 .双水相系统的制作(1)配制牛血清蛋白溶液：l g/L(2)配制高浓度的聚合物和盐溶液母液：P E G 6 0 0 0,4 0 0 g/L、硫酸钱4 0 0 g/L 各 2 0 m l。(3)配制相应的高聚合物子液(6
9、0 g/L,1 0 0 g/L,1 4 0 g/L)和盐的子液(1 4 0 g/L,1 4 0g/L,1 4 0 g/L)各 4 m l(4)将高聚合物子液和盐的子液转到1 0 m l 离心管中，加入牛血清蛋白2 n d,共三组。离心管封口后，反复倒置5 T o m i n,6-1 0 次/分钟。使充分混合。(5)1 5 0 0 R/m i n 下离心3-5 m i n 后,观察情况。(6)小心吸取目标物，加入双缩胭试剂进行定性鉴定。五、注意事项1 .离心前，必须配平。3 .由于支管拐弯处易藏气泡，一般待滴定液放满刻度管后打开支管旋塞用洗耳球将溶液中气泡刚好吹入贮液杯中即可，也可缓慢倾斜滴定管
10、使气泡从口部溢出。4 .滴定过程要注意爱护仪器，轻拿轻放。用(N H J 2 s 0 4 滴定时，在接近滴定终点左右时一定要每滴一滴，便彻底混匀后方可滴定下一滴。六、思考问题1 双水相萃取蛋白的优点。2 双水相萃取成相的影响因素有哪些？实验四机械剪切法细胞破碎实验及PPO的粗提一、实验目的1.熟悉细胞破碎的基本方法2.熟练掌握机械破碎法操作技术二、实验原理细胞破碎技术(包括机械破碎法：捣碎法、珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法；非机械破碎法：冻结-融化法、渗透压冲击法、有机溶剂法、表面活性剂法、酸碱法、酶溶法)是提取分离生物药物的一个基本技术，是一项必须掌握的基本技能)。三、材料、试剂及仪器1.
11、材料：土豆2.试剂(1)O.lmol/L 的 NaF 溶 液(4.2gNaF 溶于 1000ml 水中)；(2)0.1mol/L的邻苯二酚溶液(1.1g邻苯二酚溶于1000ml水中，用稀NaOH调节溶液pH为 6.0)。3.仪器家用匀浆机，烧杯，布氏漏斗，抽滤瓶，量筒，容量瓶，普通离心机，水浴锅，不锈钢锅。四、实验步骤1.酶抽提物的制备(1)拿一块土豆，洗去上面的泥土；(2)去土豆皮后切成小块；(3)称取50g 土豆块放入匀浆机中，再加入50ml氟化钠溶液：(4)在匀浆器中研磨30s；(5)把匀浆物通过几层细布滤到一个100ml的烧杯中；(6)加入等体积的饱和硫酸镀溶液(70g硫酸俊溶于100
12、ml水，加热到70-80使其溶解，冷却到室温后过滤，即得饱和硫酸镀溶液)，混合后于4放置30min；(7)在 4000r/min下离心15m in,倒掉上清液；(8)将沉淀物用大约15ml柠檬酸缓冲液(pH=5.6,将 O.lmol/L的 A 液柠檬酸和0 mo1/L的 B 液柠檬酸三钠按5.5：14.5的比例混合)，既得该酶粗制品。2.多酚氧化酶的颜色反应(1)将 3 只干净的试管编号为1、2、3.(2)按下面的要求制备各管：管号酶抽提液水邻苯 二 酚(O.Olmol/L)混合均匀115滴15滴215滴15滴315滴15滴（3）把三只试管放于37水浴（4）每隔5min震荡试管并观察每管中溶液
13、颜色的变化，共反应25min。（5）观察现象，记录实验结果。五、结果与讨论（1）记录以上实验过程每一步骤的现象，并对现象所说明的问题进行分析。（2）本实验中加入硫酸筱的目的是什么？（3）预测试管1、2、3 的现象，并说明预测的依据。实验五：高压匀浆法、珠磨法细胞破碎技术一、实验目的：细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。机械破碎主要的方法有珠磨法、高压匀浆法、超声波等方法。本实验主要
14、介绍高压匀浆法、珠磨法的介绍和使用。二、实验原理：1高压匀浆法是大规模破碎细胞的常用方法，作用机理是液体剪切作用，利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时.，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。1.1 高压匀浆机工作原理及工作示意图高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射
15、向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。1.2 高压匀浆破大肠杆菌菌体浓度150gXL-l左右（目标蛋白表达量为20%）用去离子水悬浮，在 80MPa压力下，连续高压匀浆三次。影响高压匀浆破碎的因素主要有压力、温度和通过匀浆器阀的次数，工业生产中常采用的压力为5570Mpa。高压匀浆法操作参数少，且易于确定；且样品损失量少，在
16、间歇处理少量样品方面效果好，在实验室和工业生产中都已得到应用，适用于酵母和大多数细胞的破碎。对于易造成堵塞的团状或丝状真菌以及一些易损伤匀浆阀，质地坚硬的亚细胞器一般不适用。2、珠磨法：设备是珠后机，其破碎机理：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间和互相剪切、碰撞，促使细胞壁破碎，释出内含物，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中，生的热量由夹套中的冷却液带走。存在的问题：操作参数多，一般赁经验估计并且珠子之间的液体损失30%左右。三、实验操作两种机器的使用过程及步骤。实验六红霉素的萃取与精制一、实验目的（1）
17、学会利用溶剂萃取的方法对微生物药物的原理与方法进行提纯；（2）掌握利用提取红霉素的步骤和操作要求。二、实验原理萃取过程是利用混合物质各种组分在两个不相混溶的液相中的溶解度的不同，从而达到分离的目的。红霉素在碱性条件下，溶于乙酸乙酯中，在酸性条件下溶于水溶液中给，通过这个原理达到分离提纯的目的。三、试剂及仪器1 .材料2g红霉素软膏。2、器材量杯、烧杯、布氏漏斗及抽滤瓶、培养皿、分液漏斗、铁架台、剪刀、烘箱等。2.试剂乙酸、乙酸乙酯、饱和食盐水、异丙醇、乙醇-醋酸钾溶液（10g醋酸钾溶于100ml无水乙醇中，现用现配）四、实验步骤（一）取 2g红霉素软膏，放入烧杯中，加 6m l乙酸丁酯,用乙酸
18、或乙酸丁酯调pH值 为 7.2 8.0,抽滤，得澄清滤液，供下一步萃取用。（二）澄清滤液放入搪瓷缸中用乙酸酸化pH 值为3.5 6.0,加乙酸丁酯分两次（每次加1020ml）进行萃取，每次加入后，要在搪瓷缸内上下翻动，使滤液和乙酸丁酯能充分混合接触，然后静置30 min使之分层，用 100ml烧杯收集上层萃取液。（三）取上述下相液，加入一定体积的饱和食盐水，加入乙酸丁酯分两次萃取，充分混合接触，待静置分层后，将上层萃取液（BA液）倾倒出或吸出，转入另一只烧杯中（四）结晶和干燥：取量乙醇-醋酸钾溶液，缓慢加入上述B A 溶液中，带有沉淀时，搅拌后静置30min后过滤，得红霉素晶体，将湿晶体放入烧
19、杯中，加异丙醇30-50ml,搅拌成浆糊状，然后抽滤，将湿品平铺培养皿中，真空干燥的干品。五、结果与分析六思考pH 的调节在提高红霉素萃取效率方面的重要性。常见的有机溶剂有哪些？红霉素萃取时为何选用饱和食盐水？（有两个作用一是防止乳化，二是降低有机化合物在水中的溶解度。）实验七薄层色谱法鉴定果汁中的糖一、实验目的了解薄层色谱法的分离原理，掌握薄层色谱法鉴定果汁中的糖的操作技术。二、实验原理对多组分的复杂混合物，无论是有机物或无机物，薄层色谱法是有效的分离手段之一.硅胶是常用的吸附剂，使用与酸性和中性物质的分离，在一定条件下，硅胶对各种糖分的吸附能力不同。同时，选择适当的展开剂，利用各种糖分的分
20、配系数的差异，从而达到分离。显色后得到色谱图，与在相同条件下已知糖分的色谱图比较就能鉴定果汁中的糖分。未知物组分的鉴定是通过在同一块薄层板上分别点上标准样品和未知样品，通过比较斑点的比移值来定性鉴定。其中比移值R f 计算公式为：Rf=原点至斑点中心的距离/原点至展开剂前沿的距离由于在相同条件下，物质的R f 值是一定的，因而比移值R f 可以进行物质的定性分析。分离之后，可以用适当的方法定量测定，如刮下有色斑点。将被测物浸取后用比色法测定其含量，或用薄层扫描仪扫描直接测出被测物的含量。三、实验器材层析缸（筒）（1 0 c m x l 0 c m）；微量注射器，若仅作定性鉴定，则可用玻璃毛细管
21、来替代;薄层板：用 1 0 x 1 0 c m 玻璃板制作硅胶板、可剪截型薄层层析板（1 0 c m x 1 0 c m,0.2-0.2 5 m m铝基硅胶G板，天津市天河医疗有限公司）；吸附剂：硅胶G （青岛海洋化工有限公司生产,2 0 0-2 6 0 目，化学纯）展开剂1：正丁醇：丙酮：水=4：3：1显色剂1：苯胺一二苯胺 磷 酸（临用时配制：2 g二苯胺、2 ml苯胺、2 0 ml8 5%磷酸，与2 0 0 ml丙酮混溶）显色剂2：把 1 0 ml硫酸缓慢倒入9 0 ml乙醇中混合冷却，制 得 1 0%的硫酸溶液标准糖溶液：麦芽糖、果汁、蜂蜜、果糖、葡萄糖，分 别 溶 于 1 0%异丙醇
22、中，使其浓度为 1 0 0 mg/ml新鲜果汁、蜂蜜、无水乙醇四、实验步骤（1）制作薄层板将玻璃板洗净至不挂水，晾干后置于干燥洁净处备用。将 1 0 g 硅 胶 G加适量的水（约2 5 m L）,在研钵中用研杵向一个方向研磨制成均匀的有适当粘稠度的胶浆，立即倾倒于玻璃板中央，迅速振荡，使硅胶层厚度均匀。涂布好的薄层板于室温下在水平台上晾干，并在1 0 5%：温度下活化3 0 mi n 后，贮于干燥器中备用。硅胶层的厚度约为0.1 m m,使用前用氯仿-甲醇（8 预洗，在 1 0 5。（2 温度下加热干燥1 h。（2）点样在 1 0 x 1 0 c m 的硅胶G薄板上离底边2 c m 处用铅笔划
23、线，用微量注射器或玻璃毛细管点样（新鲜果汁及标准糖液），各斑点之间相距2 c m且每个斑点的直径不超过2 m m,每个样品点 4次，每次点样后用冷风吹干或间隔一定时间使其自然干燥。在板上标出起始线和欲展开的前沿线，一般展开距离为7 c m 以上。（3）展开把点样后的薄层板在红外灯烘干（若无红外灯，则在空气中晾干），将配好的展开剂倒入展开缸中，使展开剂在缸中的深度至少有1 c m 深，盖上盖子，混合均匀。等数分钟后让溶剂在展开缸中饱和后，再将已点好样的晾干的薄层板迅速的放入缸内，尽量不破坏缸内的气氛，盖上盖子。让薄层板的下部浸入展开剂溶液中约0.5 c m以上（但注意不要让点样的斑点浸入到展开剂
24、的溶液中，以免被溶液浸洗下来）；由于吸附剂的毛细管作用，展开剂和斑点不断向上迁移，直到展开剂前沿到事先预定好的刻度线后（一般完成一次展开过程需要2 5 3 0 分钟），可取出薄层板,。在红外灯下将展开剂蒸发（或在空气中晾干，此过程大约需1 5 分钟）。（4）显色在通风橱中，在薄层板上喷雾显色，随即在1 0 0。（2下烘烤1 0 2 0 m i n,注意观察各种糖的颜色和计算R f,并以此鉴定果汁中的糖分。五、结果与讨论1.计算出果汁中所含糖的R f；实验结果如下：从左往右样品分别为：麦芽糖、葡萄糖、果糖、果汁、蜂蜜。名称麦芽糖葡萄糖果糖果汁蜂蜜原点至斑点中心的距离c m5.05.35.14.3
25、5.5原点至展开剂前沿的距离c m7.57.77.97.87.9R f0.6 6 70.6 880.6 4 50.5 5 10.6 96讨论：从上表可以看出各种物质的Rf值不同，计算出的Rf值中，果汁的Rf值与果糖的Rf值最接近，故果汁中最有可能含有果糖。在点样时，样品点过大，可能会导致样品色谱变宽；果汁色谱颜色深，其原因可能是样品浓度过高；实验八透析法脱盐一、实验目的学会透析的基本原理和操作。二、实验原理蛋白质是大分子物质，它不能透过透析膜，而小分子物质可以自由透过。在分离提纯蛋白质的过程中，常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分开。三、试剂及仪器1.仪器透析管或玻璃纸、烧杯、玻璃
26、棒、电磁搅拌器、试管及试管架。2.试剂蛋白质的氯化钠溶液（3 个去黄的鸡蛋蛋清与700ml水及300ml饱和氯化钠溶液混合后，用数层干纱布过滤）。1%硝酸银溶液、10%硝酸溶液、10%氢氧化钠溶液、1%硫酸铜溶液。四、实验步骤1.用蛋白质溶液做双缩版反应（加 10%氢氧化钠溶液约1 m l,振荡摇匀，再 加 1%硫酸铜溶液1 滴，振荡，观察出现的粉红颜色）。2.透析袋的预处理。将适当大小和长度的透析袋放在50%乙醵中煮沸lh（或浸泡一段时间），再 用 10g/L的碳酸钠溶液和lmmol/L的 EDTA溶液洗涤，最后用蒸储水洗涤2-3次,结扎袋的一端。3.向火棉胶制成的透析管中转入10-15ml
27、蛋白质溶液并放在盛有蒸储水的烧杯中，或用玻璃纸装入蛋白质溶液后扎成袋形，系于一横放在烧杯的玻璃棒上。4.约lh 后，从烧杯中取出l-2ml水，加 10%硝酸溶液数滴使呈酸性，再加入1%硝酸银溶 液 1-2滴，检查氯离子的存在。5.从烧杯中另取水l-2 m l,做双缩服反应，检查是否有蛋白质存在。6.不断更换烧杯中的蒸馈水，并用电磁搅拌器不断搅拌蒸储水以加速透析过程。数小时后从烧杯的水中不能再检出氯离子时，停止透析并检查透析袋内容物是否有蛋白质和氯离子的存在。（此时应观察到透析袋中球蛋白沉淀的出现，因为球蛋白不溶于纯水）。五、结果与分析从氯离子和双缩胭反应检查结果，评价透析的效果。实验九等电点法
28、沉析法分离牛乳中酪蛋白一、实验目的1、学会牛乳中制备酪蛋白的原理和方法2、等电点沉析法的基本操作技术二、实验原理蛋白质在溶液中有两性电离现象。假设某一溶液中含有一种蛋白质。当 pI=pH时该蛋白质极性基团解离的正负离子数相等，净电荷为0,此时的该溶液的是pH 值是该蛋白质的p l值。某一蛋白质的p l大小是特定的，与该蛋白质结构有关，而与环境pH 无关。在此时，蛋白质之间的静电排斥力最小，溶解度最低。利用蛋白质在pH 值等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀(isoelectric precipitation).三、试剂及仪器1.材料鲜牛奶2.试剂醋酸钠、优级纯醋
29、酸、95%乙醇、乙醛、蒸储水、0.2mol/l PH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液3、器具烧 杯 100ml、玻璃棒、滴管、量筒、离心机、水浴锅、布氏漏斗、表面皿、抽滤瓶四、实验步骤1、将牛奶30ml及醋酸-醋酸钠缓冲液30ml分别水浴加热40摄氏度左右，用 8 层纱布过滤牛奶。2、量取加热后牛奶2 0 m l,在搅拌下加入加热后的醋酸-醋酸钠缓冲液2 0 m l,调 节 PH到 4.7.3、将混合液冷却到室温，3500r/min离 心 15m in,弃去上清液，得酪蛋白粗品。4、水洗沉淀3 次，3500r/min离 心 lOmin.弃去上清液。5、沉淀中加入乙醇20m l,搅拌片刻。将浑浊液转到布
30、氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醛混合液洗涤两次，最后用乙醛洗涤两次，抽干。6、将沉淀摊开到表面皿上，风干的酪蛋白纯品。7、计算：含量=酪蛋白g/100ml牛奶收率=测得含量/理论含量理论含量为3.5g/100ml牛乳五、结果实验十柱层析分离色素一、【实验目的】1 .了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。2 .熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。二、【实验原理】叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主 要 有 叶 绿 素a、叶 绿 素b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可 用9 5%乙醇或无水乙醇提取。分离
31、色素的方法有多种，如纸层析、柱 层 析 等。柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以 及 对 洗 脱 剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的 多 孔 性 物 质 或 粉 状 固 体 作 为 吸 附 剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然 后 从 柱 顶 加 入 溶 剂（洗 脱 剂）洗 脱。由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶
32、剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压 成 柱 状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油酸提取液倾于吸附柱上,色素即被吸附。由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主 要 的4种 色 素（叶 绿 素a、叶 绿 素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。三、【实验材料】原 料：新鲜的菠菜叶试 剂：I.无 水 乙 醇 或9 5%乙 醇2.5.三氧化二铝 6.饱和氯化钠溶液器 材：层 析 柱（1 X 3 0 c
33、 m）,研 钵，漏 斗，玻璃棒，锥 形 瓶，分液漏斗,石英砂 3.丙酮 4.石 油 酸（6 0-9 0）7.水硫酸钠 8洗脱液：丙酮：石油醛=1：9蒸储装置，脱 脂 棉，天平，烧 杯，过滤试 管，铁架台四、【实验操作】1.色素的提取：2 0克菠菜，加少许石英砂，再 加2 0毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤 渣 再 加 入3 0毫升石油酸提取一次，过滤，合并滤 液，转移至分液漏斗中,再加入4 0毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入2 0毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠 干 燥5分 钟，备用
34、.2.样 品 的 浓 缩：将提取液放入蒸储烧瓶中，蒸除多余的石油酸，至 剩 余 液 体5-8毫升左右，以备加样使用。3 .层析拄的制备：15克碱性三氧化二铝加入3 0毫升石油酸搅拌，浸 泡l O m i n.o在层析拄内加入一团棉花在底部，再 加 入 石 英 砂0.5 c m以上，然后用石油醛半充满柱子，再将浸泡好的三氧化二铝倒入柱内，倒时应该缓慢，重复使用下面的石油酸，直到装完。用石油酸洗柱内壁，顶部加一小团棉花，然 后 再 填 入 石 英 砂0.5厘米高。4 .样品的分离层析：吸附层析分离色素打开层析拄下部开关，向 拄 内 加入2毫升浓缩液，至液体没入砂内，再加入石油叫冲洗 拄 壁，液体浸
35、入砂内，加洗脱液开始层析，可以看到不同色带如图片I,直至第一条色带洗脱完毕，在拄下面用试管接收第一条色带的洗脱液，如图片2。五、【实验结果】实验结果如下图:图一：层析柱中出现黄色帝 图二：提取出的黄色胡萝卜素六、结果分析：洗脱过程中，首先有一条黄色的色带圈沿着层析柱下移，色带圈的各个方向的移动速度并不是完全相同，原因在于层析柱的制作过程并不完全均一，使层析柱内部不均匀，以至于色带各方向的移动速度不同。最后收集得到亮黄色的胡萝卜素。七、【注意事项】1、萃取时不要剧烈振荡，以防止发生乳化现象。2、为了保持柱子的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的，否则当柱中溶剂或溶液流干时，就会使柱身干
36、裂，影响渗透和显色的均一性。因此要保证整个装样过程中溶剂要高于三氧化二铝的表面。3、在吸附剂上端加入脱脂棉（或滤纸）是使加样品时不致把吸附剂冲起；在吸附柱下端加脱脂棉（或沙子）可以防止吸附剂细粒流出。4、层析柱填装紧密与否，对分离效果很有影响，若各部分松紧不匀，会影响渗透速度和显色的均匀。6、洗脱流速不宜过快，避免因此压紧凝胶，色素分离不开；也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降，色素洗脱很慢。因此应控制洗脱流速，以每分钟6080滴为宜。7、样品一定要足够浓缩，加样量不要过大，过大，分离条带过宽，如果层析拄不够长,各组分不易分开，易同时洗脱下来；加样量过少，色带不是很清楚，不
37、易观察，效果不好。8、层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据试剂需要选择。一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发 生“管壁效应”，即柱管中心部分的组份移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。八、【实验小结】在该柱层析分离色素实验中，我了解了柱层析技术的相应方法和原理，学会了层析柱的制作和准备，进一步了解绿叶中色素的组成及各色素的颜色和性质、洗脱液的配比、层析柱的制作及洗脱液的流速是本实验成功与否的三大关键因素。知识拓展：1、溶剂的选择：(1)吸附剂要求较纯，否则会影响
38、样品的吸附和洗脱。(2)溶剂和吸附剂不能起化学反应。(3)溶剂的极性应比样品小，如果大了，样品不宜被吸附剂吸附。(4)溶剂对样品的溶解度不能太大，否则影响吸附，但也不能太小，溶液的体积增加，易使色谱分散。(5)可使用混合溶剂，如有的组分含有较多的极性基团，在极性小的溶剂中溶解度太小。也可选用极性大的溶剂溶解，然后加入一定量的非极性溶剂。这样既降低了极性，又减少了溶液的体积。2、洗脱剂的选择：样品吸附在氧化铝柱上后，用合适的溶剂进行洗脱，这种溶剂称为洗脱剂。如果原来用于溶解样品的溶剂冲洗柱不能达到分离的目的，可以改用其他溶剂，一般极性较强的溶剂影响样品和氧化铝之间的吸附，容易将样品洗脱下来，达不
39、到分离的目的。因此常用一系列极性渐次增强的溶剂，既先使用极性最弱的溶剂，然后加入不同比例的极性溶剂配成洗脱溶剂。常用的洗脱溶剂的极性按如下次序递增。己烷和石油醛环己烷四氯化碳三氯乙烯二硫化碳甲苯二氯甲烷氯仿乙醛乙酸乙酯丙酮V丙醇乙醇甲醇水叱咤乙酸。实验十一活性炭吸附分离色素实验一、实验目的(1)了解吸附的基本原理；(2)掌握活性炭、木炭的静态和动态吸附的基本操作技术。二、实验原理活性炭具有较大的比表面，在水溶液中比一般固态物质吸附能力强很多，故可以吸附许多物质的分子及离子，本实验用活性炭、木炭静态和动态吸附溶液中的色素。三、实验仪器离心机、大 烧 杯(2500ml)、烧 杯(250ml)、高精
40、度pH试纸、大容量瓶、移液管、玻璃棒等。四、材料和试剂1.材料胡萝卜或红心萝卜8kg、活性炭粉8kg、脱脂棉1包。2.试剂(1)石蕊试剂500ml、浓硝酸500ml高锌酸钾400g；，(2)组织捣碎机、烧杯、U形管、漏斗、直通管、导管、漏斗架、胶塞、玻璃管、橡皮圈等。日实验步骤节性炭好态吸附石蕊 将石黛建蜂液放在小烧杯中加活性炭粉2超 然后援I拌%刻.故人过惬器中过流.用另一烧杯或试管收集液体，观察滤液颜色活性炭动态吸附胡萝卜色素 选深红色，质地紧密，色素含量高的红心胡萝卜切碎打浆，过滤得含胡萝卜色素的溶液，然后以直通管中段全笫用话件炭装满、两蜡堵上妙布棉团.上面单孔塞装上漏斗，下面单孔察加一
41、个短导管作为旗液出口.实验前将这娈装置固定于铁架台上把含有萝卜色素的溶液放入漏斗中,观察下面接受器中收集到的溶液颜色木炭吸附高活酸锌U型管中放人约1/3容积的小块木炭，两管口同时加脱脂梅-团.实轮时从左仔n加人稀而铳酸钾溶液。不久右管上层液而渐渐开高.观察右臂上层液面81色制二氯化或气体 取两只带塞锥形就、以细发拴牢一支小试百，小试管中杓一两片铜屑，滴加浓硝酸后立即吊入推形瓶中，待瓶中气体的榇红色明显时即将小试管转移到另一帷形瓶中，同时给第一屈加塞第二瓶也同样浓度后，取出加塞，井立即把小试 管连同内中废液一起浸入大水杯中，北废液若量少可弃去.但可以把洗净的弱腐隙干回收注意事项：(1)、活性炭使
42、用前一定要经过处理，增强他的吸附活性，实验前要将木炭或活性炭放在培烟里烘烤，充分进行解吸。(2)、选用有色液体不要太浓，否则吸附不干净可能会出现色带，得不到无色清液（3）、榨取的胡萝卜 汁在活性炭脱色前，应进行过滤前处理，避免汁液过黏影响吸附效果。（4）、所用锥形瓶在实验前应该是干燥的。六、结论七、思考1、木炭和活性炭那种吸附剂的吸附效果好？2、实验中第一步和第二步用同样的胡萝卜色素和活性炭，哪步吸附效果显著？一、目的要求实 验 十 二 卵 磷 脂 制 备(I)熟悉从蛋黄中制备卵磷脂的原理；(2)掌握卵磷脂制备的基本操作及鉴定技术。二、实验原理利用卵磷脂可溶于乙醇的性质，将卵黄溶于乙醇，卵磷脂
43、从卵黄中转移到乙醇溶液中，可分离提取出来，而蛋白质等某些杂质从沉淀物中除去。但由于乙醇溶剂抽提时，其他脂质也起被抽提，如甘油三酯、留酵等。利用卵磷脂不溶于丙阳的性质，用丙用从粗卵磷脂溶液中沉淀磷脂，能使卵磷脂与其他脂质和胆固醇分离开来。无机盐和卵磷脂可生成络合物沉淀，因此可利用金属盐沉淀剂将卵磷脂从溶液中分离出来，由此除去蛋白质、脂肪等杂质.再用适当溶剂萃取出无机盐和其他磷脂杂质，这样可大大提高卵磷脂纯度。三、实验用品1 .材料新鲜鸡蛋、卵磷脂对照品、G F 2 5 4 硅胶板。2 .试剂1 0%氯化锌溶液、2%三氯甲烷溶液、无水乙醇、9 5%乙醇、0.1%乙醇、丙 酮(冰)、甲静和碘。3 .
44、3具离心机、旋转蒸发仪、布式漏斗、抽滤瓶、真空干燥箱、层析缸、紫外分光光度计、用烟。四、实验过程1 .快提室温下，取适量的鸡蛋卵黄用2倍于卵黄体枳的9 5%乙醉进行提取 混合搅拌，离心分离(3 0 0 0 r/mi n.5 mi n),将沉淀物重复提取3次.回收上清液；然后、减压蒸懦(4 5 七)至近干，用少量石油酸洗下粘壁的黄色油状物质；加入丙酮，抽滤，分禽出沉淀物，真空干燥(4 0 T.3 0 mi n),得到淡黄色的粗卵磷 脂,称重2 .精制取一定量的卵磷脂粗品，用无水乙醉溶解，得到约1 0%乙醇粗提液，加入相当F卵磷脂质般的1 0%的氯化锌水溶液，室温搅拌0.5 h；分离沉淀物,加入适
45、量冰丙第(4T)洗涤搅拌lh.再用丙随复研洗，直到丙酮洗液为近无色止，得到白色蜡状的精卵磷脂；干燥：称重。3 .叁定：(1)薄层色谙分析,将卵磷脂样品与对照品分别配成2%三氯甲烷溶液，用 G F 2 5 4 硅胶板进行层析，展开剂为三氯甲烷：甲醇：水(6 5：2 5：4),层析完毕后，取出薄板，干燥，碗蒸气显色.(2)紫外吸收光谐酒定将一定量卵磷脂样品溶于无水乙醇，配成0 乙醇溶液，用紫外分光光度计扫描左在9 0 4 0 0 nm的吸收光谱,可濯得卵磷脂的紫外最大吸收峰.卵磷脂紫外最大吸收峰在2 1 5 nm波长。五、注意事项(1)碘蒸气显色时,应保证层析干燥，膜蒸气量不可过浓(2)紫外吸收光
46、谱测定时样品与对照品溶液浓度应相同六、思考题(1)讨论影响卵磷脂得率的主要因素(2)根据紫外吸收光谱分析所制备的卵确肪的纯度“实验十三银耳多糖的制备及鉴定和含量测定一、目的要求(1)了解银耳多精制备的基本原理；(2)掌握糖类物质提取纯化的基本操作技术。二、实验原理.银耳是我国传统的一种珍贵药用交菊.银耳多糖主要成分为酸性杂多蟾.中性杂多幅、胞壁多铺、胞外篆情及酸性低聚懦五类，不含核酸、蛋白质类物质 银耳多除具有明显提高机体免疫功靶、抑制肿痛转移.抗炎症、抗放射、抗血栓、降由错等作用.是一种滋补强壮、扶正固本的保健食品和药物，本实训利用眼耳子实体经水浸泡捣碎.舒没提，乙障沉析分离可制得银耳多精粗
47、品.再MICTAB(滨化十六烷基三甲段)络合法进-步精制得侬耳多精纯品并进行多糖的鉴定。三、材料用具1.材料银耳孑实体T品20g,2.试剂2nwl/L的氢氧化钠溶液；2moi/L班化钠溶液；2moi/LtfclR溶液,无水乙薄；乙醛；.浓蜕酸；泰酚；0.5%甲茶胺乙静溶液；5%三叙乙酸-正丁呼溶液；复合薄制剂(含果皎崎、杆推崇薛和中性蛋白醒食品级复合的)；活性炭；硅藻土；2%溟化十六烷基三甲饯(C TA B)配制：取2 g CTAB溶尸100mL蒸斓水中,摇匀备用 斐林试剂.3.补具烧 杯(250ml.,500mL,1000m l.)、布 氏 流 斗(8cm)、抽 旋 腋(5 00 m L).
48、分液漏斗(250m L),量筒(100mL.10m L),离心机.水浴锅、透 析 纸、造纸、层析缸、组织捣碎机、不锈据蝌四、实验方法(-)毋件就 颊(JL W 6-8)图6-8康耳多箫制普及剖定的操作海存(二)条作步薄1.tRK知 处 理(事 氾 笫4)选无杂质银耳子实体干品20g放人不精纲情中,抑水1600m L.干20 2 5 t浸泡30min,找高逮组织捣碎机中充分捣碎.制成娘耳浆液.2 .监法典将银耳浆液用2 m o i/L 盐酸溶液蠲pH至 6.3,加 入 1%复合酶制剂，5 0 七下陇促反山4 0 m i n,迅速升温至8 0 T 灭酸，并保绢没提约l.5 h.浸提液了 8 0 七
49、水格浓箱至稚浆状 另法：加热提取银耳子实体2 0 g 加水8 0 0 m L 于沸水浴加热搅拌8 h,离 心(秋 O r/m i n)2 0 m i n去找渣.上清液用硅藻土助淮，水洗.合井洗渔液尸8 0 七水浴浓缩至糖浆状3 .虫官苗糖的沉降(1)有机酸除杂 浓缩液放入烧杯中加入等体积5%三氯乙酸-正丁醉溶，摇匀，离 心(3 0 0 0 r/m i n)1 5 m i n G.用滴管吸去正葬层和中层变性蛋白，下层清液备用.(2)脱色、透析 将下层清液用2mo i/L 的氮氧化钠溶液调pH至7,加 1%活性炭8 0 七加热1 5 m i n 脱色，抽送，滤液扎袋，流水透析1 2 h.透析液8
50、0 t 水浴浓缩至原体积1/3.拍遍,(3)乙醛沉析 滤液加3倍地9 5%乙醇，搅拌均匀后，离 心(3 0 0 0 r/m i n)1 5 m m 沉淀用无水乙静洗涤2次。乙隧洗涤I 次.5 0 七以下真空干燥，得银耳多幡粗品.称盍4 .楂洌(1)取粗品1 g,溶于1 0 0 m L 水中.溶解与离心除去不溶物：注液加2%C T A B 至沉淀完全C摇匀.岸置2 h.离 心(3 0 0 0 r/m i n)1 5 m i n,沉淀用8 0 t 热水热涤3次，加 1 0 0 m L 2 m o l/L家化钠溶液于60 七就离4 h.离 心(3 0 0 0 r/m i n)I 5 m i n.上清