TLR3在心肌缺血_再灌注损伤中的作用及其机制研究_任单阳.docx
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1、 南京医科大学硕士学位论文 南京医科大学 学位论文原创性声明 南京医科大学硕士学位论文 本人郑重声明:所呈交的论文是本人在导师的指导下,独立进行研究工作 所取得的成果。除了文中特别加以标注引用的内 容外,本论文不包含任何其他 个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和 集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人 承担。 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和 借阅。本人授权南京医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索,可以采
2、用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于(请在以下相应方框内打 “V”) : 学位论文版权使用授权书 1、保密口,在 _ 年解密后适用本授权书。 2、不保密匚 1。 南京医科大学硕士学位论文 目录 中文摘要 . 1 英文摘要 . . . 3 前言 . 6 材料与方法 . 9 I . 19 . 42 I . 45 参考文献 . 46 综述及参考文献 . 51 Pft 录 . 69 攻读学位期间发表文章情况 . 70 E m . 71 南京医科大学硕士学位论文 TLR3 在心肌缺血 -再灌注损伤中的 作用及其机制研究 中文摘要 心肌缺血 -再灌注损伤 ( ischemic
3、/reperfUsion, I/R)与机体固有免疫系统的过 度激活和局部或全身炎症反应密切相关。 Toll 样受体 ( Toll-likereeeptors, TLRs) 是一类识别病原相关分子模式 ( pathogen-associated molecular patterns,; ?AMPs), 参与调节机体天然免疫及获得性免疫的受体超家族。迄今为止发现至少有 11 种 人类跨膜蛋白基因和 13 种小鼠跨膜蛋白基因属于 TLR 家族,它们可各自识别不同 的配体。TLR1, 2,4, 5,6 主要识别细菌细胞壁的脂肽等成分, TLR3, 7, 8, 9 主要识 别病毒单、双链 RNA 或 D
4、NA。 TLRs 与相应配体结合后招募 MyD88 (myeloid differentiation primary response protein) Mai (MyD88 adaptor-like protein)% TRIF (TIR-domain-contain!ng adaptor protein inducing IFN-mediated transcription - factor)、 TRAM (TRIF-related adaptor molecule)、 SARM(sterile alpha and HEAT-Armadillo motifs)等含 TIR 的接头蛋白,通过
5、 MyD88依赖途径或 MyD88非依 赖途径进行细胞内信号转导,在天然免疫和炎症反应中发挥重要作用。己有研 究发现TLR4 和 TLR2 介导的信号通路参与了心肌缺血 -再灌注损伤诱导的炎性反 应,在心肌缺血 /再灌注损伤的发生、发展过中起着关键性调节作用。而 TLR3 是 TLR 样受体中重要的成员,主要分布在细胞的内涵体上,它不仅可以识别外源 性病毒双链 RNA,还可识别细胞凋亡或坏死等内源性物质及其降解 产物。 TLR3 与其他 TLRs 信号转导通路不同, TLR3 识别配体后通过含有 TRIF 结构域的转接蛋 白 (TRIF)途径活化转录因子 NF_KB 及干扰素调节因子 (IRF
6、3), 诱导各种炎症因子 及干扰素和共刺激分子的产生。己有文献报道 TLR3 介导的信号通路参与了急性 肺损伤炎症反应的发生。另一些研究显示,在某些肿瘤细胞系中, TLR3 与细胞 的凋亡密切相关。但是, TLR3介导的信号通路是否可以在心肌缺血 -再灌注损伤 的发生发展中发挥调控作用至今尚不明确。为此,本研究釆用小鼠在体模型,研 1 南京医科大学硕士学位论文 究了 TLR3 及其介导的细胞内信号转导在心肌缺血再灌注损伤中的作用及分子调 控机制。 采用 TLR3 基因敲除鼠与同周龄及体重的雄性野生型小鼠,通过结扎小鼠冠 状动脉左前降支 (left anterior descending cor
7、onary artery, LAD) 45min, 再灌注 4h, 24h, 3d, 7d, 14d的方法建立小鼠急性心肌缺血 -再灌注损伤模型,对比观察 TLR3 对心肌缺血 -再灌注损伤发生发展的影响,并着重探讨了 TLR3 信号通路在心肌 缺血 -再灌注损伤炎性反应及细胞凋亡中的作用。 实验结果显示,缺血 45min 再灌 4h 后,与野生型小鼠相比, TLR3+组的梗死 区面积 / 危 险 区 面 积 ( ischemia area/risk area IA/ RA) 减少了 42.16% (39.382.19% vs. 68.09 2.04%, n=8 只 /组, P鼠与野生型小鼠比
8、降低了 23.2%。提示 TLR3V 可能通过抑制凋亡蛋白 BAX 的表达抑制细胞凋亡。 3.4.8 TLR3- 抑制急性心肌缺血再灌注引起的 BCL2 表达水平的下降 BCL2 是位于线粒体膜上的与细胞存活相关的蛋白。它可以通过多种机制抑 制细胞凋亡。如图 11 所示与 sham 组相比,缺血再灌注损伤后,野生型小鼠心肌 组织中 BCL2 表达降低了 38%,而 TLR3V_小鼠与野生型小鼠比增力卩 142.94%。提示 TLR3V_可能通过促进 BCL2 表达抑制细胞凋亡。 3.5 TLR3+减轻急性心肌缺血再灌注引起的炎症反应 3.5.1 TLR3V 减少了缺血 再灌注损伤后炎性因子的表
9、达 21 南京医科大学硕士学位论文 我们用 ELISA 方法检测了血浆中炎性因子的表达情况。如图 12 所示,与 sham 组比较, I/R 损伤显著增加了野生型小鼠血浆中炎性因子的表达水平,其中, IL-lp 增加了 2.5倍, TNF-oc 增加了 1.25倍。而 TLR3_A小鼠与野生型小鼠比 IL-lp 降低了 51.43% (17.3 2.39 vs 35.4 + 1.96 pg/ml, P后 , 野生型小鼠冠脉缺血区心肌组织出现明显坏死,而 TLlm 心肌梗死面卷 ?明显 减少,与野生型小鼠相比, IA/RA 及 IA/LV 比值明显下降( 0.05,n=3 只 /组 )。 Fig
10、ure 16. TLR3 deficiency attenuated I/R induced expression of myocardial ICAM-1 expression. TLES and WT mice were subjected to I/R. Sham operation served as sham control. Hearts were harvested 4 hours after reperfusion and sectioned. The expression of ICAM-1 was examined by Westem-blot(a) and iimnuno
11、histochemistry(b). TLR3_/ inhibits ICAM-1 protein expression in the myocardial vasculature after I/R. (O.OS. n=6 mice/group). Representative photomicrographs of sections stained for ICAM are shown (magnification x200 and x400). Brown staining indicates the presence ofICAM-1. (*P0.05. n=3 mice/group)
12、. 南京医科大学硕士学位论文 讨论 缺血引起的心血管疾病是危害人类健康的主要疾病之一,尽早有效地恢复 对缺血心肌的血液再灌注,是阻止缺血性心肌损伤的发展、减小心梗面积进而改 善临床预后的根本措施。但是 ,缺血心肌在恢复血液灌注后可产生更为严重的损 伤,即缺血 /再灌注损伤,使得即使给予及时、适当的再灌注治疗,仍会出现心 律失常、梗死面积扩大、持久性收缩功能低下等状况。病理变化可出现心肌细 胞水肿、细胞膜和细胞器膜完整性破坏、肌纤维出现破坏性断裂超微结构的改 变、微血管损伤和无再灌注现象等。因此,缺血 /再灌注损伤成为阻碍缺血心肌 从再灌注治疗中获得最佳疗效的主要难题。然而心肌缺血再灌注损伤其病
13、因复 杂,发生机制至今尚未完全阐明。目前认为与氧自由基,钙超载,能量代谢障 碍,内皮细胞损伤,细胞凋亡等有关。新近研宂进展发现, TLR 样受体与心肌缺 血再灌注损伤引起的固有免疫反应及炎症反应密切相关。而我们课题组的研宄 首次发现 TLR3 及其信号转导通路在小鼠心肌缺血 -再灌注损伤的病理生理过程 中发挥了关键性的调控作用。实验结果显示, TLR3+明显降低缺血 -再灌注损伤 减轻急性心肌 I/R 后的心肌梗死面积,显著改善心功能。并且, TLRTZr 以明显 减少心肌细胞的凋亡数目,降低缺血再灌损伤导致的 NF-KB的激活,抑制 炎性细 胞的聚集和活化,减轻粘附分子及炎症因子的表达。 过
14、度激活的炎症反应以及细胞凋亡现象存在于心血管系统的许多生理病理 过程中 3G, 31。 已有学者提出,固有免疫的过度激活 ,炎症反应以及细胞凋亡可能 为再灌注损伤发病机制中的关键环节,在再灌注损伤发生、演化过程中起着关 键的调节作用。因此如何减轻心肌缺血再灌注损伤引起的炎症反应,减少心肌 细胞凋亡,改善心功能已成为防治再灌注损伤的关键性问题。 TLR3 是 Toll 样受体 家族重要成员之一,主要识别病毒双链 RNA。 TLR3 与配体结合后通过含 TIR 结 构域的转接 蛋白 ( TRIF)途径活化转录因子 NF-KB 和干扰素调节因子 3 ORF3), 诱导炎症细胞释放炎症因子并介导炎症反
15、应,同时诱导 I 型干扰素的释放 ,介导天 然免疫。部分肿瘤细胞也表达TLR3,活化的 TLR3 与肿瘤细胞的凋亡及干扰素 42 南京医科大学硕士学位论文 的分泌、 NF-KB 的活化等有关 33。在盲肠结扎穿孔脓毒症小鼠模型中, TLR3+ 可显著抑制心肌细胞凋亡及炎症细胞的浸润 34。因此, TLR3 极有可能参与心肌 缺血再灌注引起的炎症反应及细胞凋亡等病理生理过程。有研宄认为, TLR3 促 进细胞凋亡的机制与激活 Fas/FasL 细胞凋亡信号通路有关 35。 Fas 与 FasL 结合 后, Fas 分子变构为三聚体,继而转接蛋白 Fas 相关死亡结构域蛋白 (FADD/M0TRT
16、1)的 DD 与 Fas的 DD 结合, FADD 另一端的死亡效应结构域 (DED) 于前半胱天冬酶8(procaspase8/FLICE)结合形成 Fas/FADD/caspase8 组成的死亡诱 导信号复合物 (DISK),激活白细胞介素 ip 转化酶 (ICE),启动蛋白酶的级联 反应, 引起核酸内切酶活化,降解DNA 修复酶及细胞骨架调节蛋白,从而诱导细胞凋 亡的发生 36。 Fas 也可通过介导Fas 死亡结构与相关蛋白或水解神经鞘磷脂产生神 经酰胺从而激活几 _末端激酶 (JNK)引起细胞凋亡。另有研宄显示, NF-KB 活化 后可启动能促进 Fas, FasL 等含 KB 位点
17、的基因转录,这些蛋白产物的上调在某些 特定情况下可促进细胞凋亡 37。我们目前的研究发现,缺血再灌注损伤后与野 生型小鼠相比, TLR3+组小鼠 NF-KB 的 DNA 结合活性明显降低, Fas, FasL 及 FADD 的表达也显著下降 。但是,在心肌缺血再灌损伤模型中, NF-KB 是否对 TLR3 介导的 Fas/FasL 凋亡信号通路发挥调控作用至今仍不明确。此外,我们的研究结 果还提示,在 TLR3 除了与死亡受体介导的凋亡信号通路相关外,还介导了线粒 体凋亡信号通路。在生理条件下,心肌细胞有序而协调地激活促凋亡基因 (BAK,BAX 等 )和 /或抗凋亡基因 (BCL-2 等 )
18、, 共同调控细胞代谢而维持细胞内环 境稳定。但是在缺血再灌注损伤过程中,促凋亡及抗凋亡相关基因及其蛋白发生 了变化,从而导致心肌细胞凋亡的发生。研究发现 ,长时间缺血诱发心肌细胞发 生凋亡之后,心肌内 BCL2 表达减少而 BAX 表达増多 【 38。在 BCL2 过度表达的转基 因小鼠中,缺血和再灌注所致的心肌细胞凋亡、心肌梗死和心功能下降等均明显 减轻。我们的研究发现, TLR3+通过上调抗蛋白 BCL2,下调促凋亡蛋白 BAX BAK 的表达抑制心肌缺血再灌注引起的细胞凋亡,改善心功能。 心肌缺血再灌注损伤是一个包括中性粒细胞活化,多种炎症因子及黏附分 43 南京医科大学硕士学位论文 子
19、过度表达,伴有多种炎性介质及信号传导分子参加的复杂操作过程 39。由于 NF-KB调控多种炎性因子基因表达,而 TLR3 则可以通过含 TIR 结构域的转接蛋 白 ( TRIF)途径活化转录因子 NF-KB, 诱导炎症细胞释放炎症因子并介导炎症反 应,因此推测TLR3 在心肌缺血再灌注损伤引起的炎症反应中起重要作用。本研 究中,我们发现在缺血 45min 再灌注 4h 后, TLR3 明显抑制了 NF-KB 的结合活性, 降低心肌组织中炎性因子 IL-ip 和 TOF-oc 的表达水平。 大量的研究己证实,中性粒细胞和巨噬细胞的激活和聚集在心肌缺血 -再灌 损伤中起着至关重要的作用。活化的中性
20、粒细胞可以释放包括 IL-1P 和 TNF-cx 在 内的一系列炎症因子活化的巨噬细胞可以释放 MCP-1 和 KC 等细胞因子,招 募中心粒细胞进入损伤的心肌组织 41。在本实验中,我们发现缺血再灌注损伤 后,心肌组织中中性粒细胞和巨噬细胞侵润增多,而 TLR3+组小鼠心肌组织中 中性粒细胞和巨噬细胞的聚集明显减少。血管内皮细胞粘附分子 ICAM-1, VCAM-1 表达的上调可以促进中性粒细胞和巨噬细胞的粘附,有研宂发现, ICAM-1, VCAM-1 缺陷小鼠与野生型小鼠相比可以明显减轻 I/R引起的心肌组织 中中性粒细胞的浸润和心肌坏死 42。我们观察到,在野生型小鼠中,缺血再灌 注损
21、伤后 ICAM-1, VCAM-1 表达增加,而对照组 TLR3+组小鼠心肌血管中,粘 附分子 ICAM-1, VCAM-1 的表达则明显低于野生型小鼠。上述研宄提示, TLR3+ 通过抑制 NF-KB 等信号通路的激活,下调心肌组织中炎性因子和血管内皮细胞粘 附分子的表达,抑制 I/R 引起的心肌组织中中性粒细胞的浸润及巨噬细胞的激活, 进而减轻心肌损伤,改善心脏功能。 综上所述,本研究结果表明, TLR3+可以明显减少心肌梗死面积、改善心 功能。抑制 I/R 引起的 NF-KB 的结合活性, 减少心肌细胞凋亡,抑制炎症反应。在 接下来的研究中,我们要进一步探讨心肌缺血再灌注损伤中, TLR
22、3 的激活机制 以及 NF-KB信号通路和 TRIF/IRF 信号通路在 TLR3 介导的炎症反应及细胞凋亡过 程的作用,从而更好的阐述 TLR3 在心肌缺血再灌注损伤中的作用及其调控机制, 为临床防治心肌缺血再灌注损伤提供新的理论基础。 南京医科大学硕士学位论文 小结 1. 心肌缺血再灌注可引起严重的心肌细胞损伤,导致心功能下降。 TLR3 可以 明显减少 I/R 引起的心肌梗死面积、改善心功能。提示 TLR3 介导的信号通路 在心肌缺血再灌注损伤中发挥了至关重要的作用。 2. 心肌缺血再灌注损伤可引起的 NF-KB 的 DNA 结合活性増强,心肌细胞凋亡增 加以及炎症反应, TLRS+则可
23、抑制 I/R 引起的 NF-KB 的结合活性的增加,减少 心肌细胞凋亡,抑制炎症反应,提示 TLR3 介导的信号通路与缺血再灌注损伤 后细胞凋亡及炎症反应密切相关。 3. TLR3_对 I/R 诱导的心肌细胞凋亡的调控机制可能与 Fas/FasL 凋亡信号途径 和线粒体凋 5 信号途径有关。 4. TLR3+对 I/R; 引起的炎症反应的 调控机制可能与减少心肌组织中中性粒细胞 的聚集和巨噬细胞的活化,抑制炎症因子及粘附分子的表达等有关。 5. 在心肌缺血再灌注损伤中, TLR3 是如何被激活的, NF-KB 信 号 通 路 以 及 TRIF/IRP 信号通路在 TLR3 介导的炎症反应及细胞
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- TLR3 心肌 缺血 灌注 损伤 中的 作用 及其 机制 研究 任单阳
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