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1、PCR原理及其操作(高中)1.PCR的基本原理的基本原理 2.PCR反应体系反应体系 3.PCR的基本步骤的基本步骤2PCR的基本原理的基本原理试管中进行的试管中进行的DNA复制反应，依据复制反应，依据DNA半保留复制的机理；半保留复制的机理；体体外外DNA分分子子于于不不同同温温度度下下可可变变性性和复性的性质；和复性的性质；通通过过人人为为控控制制体体外外合合成成系系统统的的温温度度，使使双链双链DNA变成单链，变成单链，单链单链DNA与人工合成的引物退火，与人工合成的引物退火，DNA聚聚合合酶酶使使引引物物沿沿着着单单链链模模板板延延伸为双链伸为双链DNA。PCR反应体系反应体系4 4种
2、种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0.10.12ug2ugTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5u2.5uMgMg2+2+1.5mmol/L1.5mmol/LPCR的的基基本本步步骤骤1.DNA变性变性（90-96）：双链）：双链DNA模板在热作用模板在热作用下，下，氢键断裂，形成单链氢键断裂，形成单链DNA。2.退火（复性）退火（复性）（25-65）：系统温度降低，引物与）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。模板结
3、合，形成局部双链。3.延伸延伸（70-75）：在）：在Taq酶（在酶（在72左右，左右，活性最佳）的作用下，以活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，为原料，从引物的从引物的5端端3端延伸，合成与模板互端延伸，合成与模板互补的补的DNA链。链。大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流7高温变性高温变性低温退火低温退火中温延伸中温延伸在引物作在引物作用下，用下，Taq酶酶从引物从引物3端开端开始延伸始延伸DNA链，链，即即DNA的合成的合成方向是从子链方向是从子链的的5端自端自3端端延伸的。实际延伸
4、的。实际上就是在体外上就是在体外模拟细胞内模拟细胞内DNA的复制过的复制过程。程。DNA的复的复制需要引物，制需要引物，其主要原因是其主要原因是DNA聚合酶只聚合酶只能从能从3端延伸端延伸DNA链。链。uPCR每每一一步步的的转转换换通通过过温温度度的的改改变变控控制制。DNA模模板板解解链链（变变性性）、引引物物与与模模板板结结合合（退退火火）、DNA聚聚合合酶酶催催化化新新生生DNA的的合合成成（延延伸伸）三三个步骤构成个步骤构成PCR反应的一个循环。反应的一个循环。u此此循循环环反反复复进进行行，可可使使目目的的DNA得得以迅速扩增。以迅速扩增。u理理论论扩扩增增率率：2n递递增增（n为为循循环环次次数数），2530循环，目标循环，目标DNA可增加可增加109倍。倍。u由由于于引引物物和和底底物物的的消消耗耗，酶酶活活力力的的下下降降等等因因素素，扩扩增增产产物物的的增增加加，逐逐渐渐由指数形式变为线性形式。由指数形式变为线性形式。u以以上上“变变性性、退退火火、延延伸伸”三三部部曲曲为为PCR一轮循环。一轮循环。