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1、包涵体的纯化一、包涵体的定义 l 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA 聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF 和ompA 等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。l 大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。二、包涵体形成的原因l 包涵体形成的原因主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。具体的原因可能有以下几点：l 1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，
2、由于细菌的 因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。l 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。l 3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH 接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。l 4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。l
3、 5、蛋白质在合成之后，于中性pH 或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase 和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。l 6、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。三、包涵体表达的有利/有害因素：1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。4、对机械搅拌
4、和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。l 5、以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。四、包涵体破菌、分离、洗涤、溶解 l 1、破菌 基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用：机械破碎、超声破碎。单纯超声破碎，在小规模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起，给后期纯化带来困难。因此，在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再结合超声破碎方法，可显著提高包涵体
5、的纯度和回收率。用超声波破碎法在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。此外还有高速组织捣碎法，玻璃匀浆器匀浆，反复冻融法，化学处理法。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另
6、外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。l 2、分离 5000-20000g15min 离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。l 3、洗涤l 包涵体沉淀中主要含有重组蛋白，但也含有一些细菌成分，如一些外膜蛋白、质粒和其它杂质。由于这些脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，所以在溶解包涵体之前要先洗涤。洗涤常用低浓度的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel 和 NP40 等加EDTA 和还原剂二硫苏糖醇（DTT）、-巯基乙醇等，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度
7、至少可达50%以上，而且可保持原结构。l 也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH 以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA 为0.1-0.3 mM。去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质，这一步很重要，因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L 尿素中具有蛋白水解酶活性，在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。l 实验室用的是低浓度的变性剂2M 尿素在50mM Tris pH8.0，1mM EDTA 中洗涤和用温和去垢剂1%
8、TritonX-100 洗涤去除膜碎片和膜蛋白。l 4、溶解 变性蛋白只有空间构象的破坏，一般认为蛋白质变性本质是次级键、二硫键的破坏，并不涉及一级结构的变化。包涵体的溶解主要任务是拆开错配的二硫键和次级键。l 变性作用是蛋白质受物理或化学因素的影响，改变其分子内部结构和性质的作用。一般认为蛋白质的二级结构和三级结构有了改变或遭到破坏，都是变性的结果。能使蛋白质变性的化学方法有加强酸，强碱，重金属盐，尿素，乙醇，丙酮等；能使蛋白质变性的物理方法有加热，紫外线照射，剧烈振荡等。重金属盐使蛋白质变性，是因为重金属阳离子可以和蛋白质中游离的羧基形成不溶性的盐，在变性过程中有化学键的断裂和生成，因此是
9、一个化学变化。l 尿素、乙醇、丙酮等，它们可以提供自己的羟基或羰基上的氢或氧去形成氢键，从而破坏了蛋白质中原有的氢键，使蛋白质变性。但氢键不是化学键，因此在变化过程中没有化学键的断裂和生成，所以是一个物理变化。加热、紫外线照射，剧烈振荡等物理方法使蛋白质变性，主要是破坏蛋白质分子中的氢键，在变化过程中也没有化学键的断裂和生成，没有新物质尘成，因此是物理变化。一般用强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展,达到增溶蛋白的效果。一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的
10、包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH 值下长期保温时。但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量 蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前使用比较广泛。盐酸胍成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。也可用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS 无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。l 另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二
11、硫键。还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。还原剂的使用浓度一般是50-100mM 2-BME 或DTT，也有文献使用5mM 浓度。在较粗放的条件下，可以使用5ml/l 的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。
12、对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。l 根据不同用途，采用相应溶剂溶解包涵体。如用于免疫注射，用1.5 倍沉淀体积的PH8.0，8M 尿素溶解，并于4 保存。如用于纯化，用2 倍沉淀体积的PH8.0 的PBS，2%SKL（十二烷基肌氨酸钠）孵育过夜，溶解包涵体沉淀，10000rpm，7min 离心，收集上清，4 保存。包涵体的复性是一个复杂的过程，我们公司生产的融合蛋白用作抗原免疫兔子，因此不需要作复性处理。5、复性复性：通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形
13、成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M 开始，到1.5M 时复性过程已经结束。包涵体的复性与重折叠的主要任务是：l 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠l 通过次级键的形成使蛋白质复性复性中常采用的方法有：l 稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。l 透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。l 超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。l 柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，如华北制药的G-CSF 复性据说是通过柱上复性进行的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC 等。