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1、扩增与电泳检测电电 泳泳观察PCR反应反应 实验步骤DNADNA在体内复制得条件就是什么？在体内复制得条件就是什么？模板模板:酶酶:原料、能量原料、能量:解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶等。聚合酶等。DNADNA分子得每条链分子得每条链dATPdATP、dGTPdGTP、dCTPdCTP、dTTPdTTP引物引物:温与得反应条件温与得反应条件DNADNA分子得结构分子得结构合成合成DNADNA分子得原料分子得原料脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸合成合成DNADNA分子得原料分子得原料脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸dATP dGTP dCTP dTTP 聚合反应机理聚合反应机理:DNA聚合酶聚合酶不
2、同细胞得细胞周期不同细胞得细胞周期 不同生物细胞不同生物细胞 需要得时间需要得时间细细 菌菌一般就是一般就是20203030分钟分钟蚕豆根尖细胞蚕豆根尖细胞1717、3 3小时小时小鼠十二指肠细胞小鼠十二指肠细胞1515、3 3小时小时人得肝细胞人得肝细胞2222小时小时人得宫颈癌细胞人得宫颈癌细胞2222、5 5小时小时PCRPCR技术可在几小时内技术可在几小时内,将特定核酸序列扩增百万倍将特定核酸序列扩增百万倍!PCR得概念得概念 PCRPCR(Polymerase Chain Reaction,Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应聚合酶链反应)就就是指在体外是
3、指在体外,通过特异通过特异DNADNA引物扩增核酸分子中某引物扩增核酸分子中某个特定区域得技术。个特定区域得技术。PCR得反应体系得反应体系DNA模板模板原料原料:dNTP(dATP、dGTP、dCTP、TTP);酶酶:Taq聚合酶聚合酶(嗜热细菌中分离得到嗜热细菌中分离得到)引物引物:(单链单链DNA片段片段)MgMg2+2+(维持酶活性所必需维持酶活性所必需)PCRPCR缓冲液缓冲液:维持维持pH,保护保护Taq酶酶 大家有疑问得大家有疑问得,可以询问与交流可以询问与交流可以互相讨论下可以互相讨论下可以互相讨论下可以互相讨论下,但要小声点但要小声点但要小声点但要小声点PCR技术原理技术原理
4、变变 性性退火退火 延伸延伸 PCR三步曲三步曲 预变性预变性保温保温 变变 性性9095延伸延伸 7075退火退火 4060PCR仪仪用于用于PCR得预混液得预混液(500 L 体系体系):ddH2O 310 310 L L10butter 510butter 50 0 L LMgClMgCl2 2 40 40 L LdNTPdNTP混合液混合液 2020 L L引物引物1 251 25 L L引物引物2 252 25 L L模板模板DNA 2525 L L Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 5 5 L L 标记一个微量离心管标记一个微量离心管,用取样器取用取样器取20 L得预混液加
5、入到该管中。得预混液加入到该管中。反应试剂反应试剂 用量用量PCR SuperMix 10L引物(浓度10M)1L引物(浓度10M)1L模板DNA 5LddH2O 3L总体积 20L微量可调移液器微量可调移液器(一档吸、二档排一档吸、二档排)PCR反应参数反应参数:变性变性 94 30 s退火退火 52 30 s延伸延伸 72 60 s 预变性预变性 94 300 s 保温保温 72 600 s循环次数循环次数 351、基本概念、基本概念 以琼脂糖凝胶作为介质以琼脂糖凝胶作为介质,DNA在外加电场得在外加电场得作用下泳动得技术。作用下泳动得技术。2、实验原理、实验原理 琼脂糖就是一种天然聚合长
6、链状分子琼脂糖就是一种天然聚合长链状分子,可以可以形成具有刚性得滤孔形成具有刚性得滤孔,凝胶孔径得大小决定凝胶孔径得大小决定于琼脂糖得浓度。于琼脂糖得浓度。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳基本原理琼脂糖凝胶电泳基本原理制胶制胶使用电泳缓冲液在制胶器上配使用电泳缓冲液在制胶器上配制制1.0%的琼脂糖凝胶。的琼脂糖凝胶。混样混样2L载样缓冲液、载样缓冲液、2L 核酸荧核酸荧光染料，光染料，10LPCR产物混匀。产物混匀。点样点样将上步混好的样将上步混好的样10 L加到凝胶加到凝胶孔中孔中。电泳电泳90V电压下电泳电压下电泳1020min。琼脂糖凝胶电泳得过程琼脂糖凝胶电泳得过程将凝胶倒入
7、制胶器得槽中将凝胶倒入制胶器得槽中(60oC)将琼脂糖加入电泳缓冲液将琼脂糖加入电泳缓冲液,在微波炉中加热溶解至透明。在微波炉中加热溶解至透明。制 胶将梳子从制胶槽中拔出将梳子从制胶槽中拔出 取出凝胶板放入电泳槽中取出凝胶板放入电泳槽中 向电泳槽中加入电泳缓冲液至没过凝胶向电泳槽中加入电泳缓冲液至没过凝胶 琼脂糖凝胶电泳中琼脂糖凝胶电泳中缓冲液得作用缓冲液得作用1 1、增加电导率、增加电导率;2 2、维持电泳过程中、维持电泳过程中得合适得得合适得pHpH。吸取吸取PCR反应产物反应产物10L。注意吸头。注意吸头要插入到管底要插入到管底,才能取到才能取到PCR产物。产物。将将PCR产物与加样缓冲
8、液充分混合产物与加样缓冲液充分混合(吸排几次吸排几次)混 样常用得上样缓冲液配方及各成分得作用常用得上样缓冲液配方及各成分得作用蔗糖蔗糖使样品呈色使样品呈色,便于上样便于上样,形成可见指示带形成可见指示带,预测电泳进程。预测电泳进程。溴酚蓝溴酚蓝增加样品密度增加样品密度,保证保证DNADNA均匀沉均匀沉入加样孔内。入加样孔内。核酸荧光染料核酸荧光染料可嵌合入可嵌合入DNADNA分子分子,在特定激发在特定激发光源得激发下可发出荧光光源得激发下可发出荧光,荧光荧光强度与强度与DNADNA含量成正比。含量成正比。(需要与加样缓冲液混合需要与加样缓冲液混合)加 样进行电泳10-20分钟电 泳实验用得核酸荧光染料与实验用得核酸荧光染料与DNA嵌合后嵌合后,在在DNA图谱观察仪得可见光下图谱观察仪得可见光下发射黄绿色荧光。发射黄绿色荧光。电泳结果得观察电泳结果得观察在在DNADNA电泳图谱观察仪中观察核酸条带并拍照。电泳图谱观察仪中观察核酸条带并拍照。