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1、Diagnostics HBV DNA检测在乙肝治疗中的应用罗氏诊断产品（上海）有限公司王亚雄2006年8月11日 上海Diagnostics为什么进行HBV DNA检测HBV DNA检测带给我们的益处目前HBV DNA的检测方法罗氏COBAS Amplicor系统的优点新一代技术COBAS TaqMan主要内容Diagnostics乙型肝炎：全球性的健康问题 目前HBV携带者超过 350 million 2540%HBsAg 阳性人群会死于肝硬化或肝癌 全球350 million HBV 携带者,75%在亚洲Diagnostics中表面抗原（S+preS2）核蛋白壳HBcAg(HBeAg)D
2、NA聚合酶膜蛋白基因组 DNA小表面抗原HBsAg(S)RNA 引物大表面抗原（S+preS2+preS1)乙肝病毒颗粒示意图Diagnostics慢性乙肝检测指标 HBsAg 确定慢性乙肝 HBeAg/anti-HBe 区分感染的不同时期 HBV 聚合酶 检测病毒的酶活性 HBV DNA 检测病毒载量(病毒转录活性)HBcAg 检测病毒蛋白(病毒翻译活性)DiagnosticsHBV 病毒基因Diagnostics慢性乙型肝炎暴露后时间滴度ALTAnti-HBcSymptoms 5 60 1 2 3 4 6 7 1 2 3 4 5 8 9 10HBsAgHBeAg月 年HBV DNAAnti
3、-HBeDiagnostics慢性乙肝的三种临床表现 HBeAg 阳性慢性乙肝 HBeAg,ALT 升高,HBV-DNA 107 to 1011 拷贝每毫升，病理切片指征明显 HBeAg 阴性慢性乙肝 Anti-HBe,ALT 升高，HBV-DNA 104 to 108拷贝每毫升,病理切片指征明显 HBsAg 阴性携带期 Anti-HBe,ALT 正常,HBV-DNA 101 to 104拷贝每毫升,病理切片变化极小EASL（欧洲肝病学会）将显著的复制水平定为HBV-DNA 10 5 拷贝每毫升 Diagnostics HBV保持复制活性（HBV DNA 105 copies/mL）,转氨酶3
4、6月内持续升高，建议进行治疗 对于e抗原阳性的慢性乙肝患者而言，采用干扰素治疗结束后，应该检测e抗原、e抗体和HBV DNA水平，并且每6个月评估病毒学反应 对于e抗原阴性的慢性乙肝患者而言，在经过抗病毒治疗后，检测血清HBV DNA水平是评估病毒学反应的唯一方式欧洲肝病学会（EASL）2003乙肝防治指南http:/www.jhep-Diagnostics HBV-DNA 血清阳性病人，如果ALT 2ULN,要考虑治疗 治疗期间，ALT、e抗原和HBV-DNA至少每3个月检测一次 亚太乙肝防治共识2003Journal of Gastroenterology and Hepatology(2
5、003)18,239245Diagnostics 抗病毒一般适应症主要指标：HBV DNA 105 拷贝/mL 病毒学应答重要指标包括血清HBV，DNA 检测不到(PCR 法)或低于检测下限，或较基线下降2log10中华医学会肝病学分会/中华医学会感染病分会慢性乙肝防治指南http:/Diagnostics为什么进行HBV DNA检测HBV DNA检测带给我们的益处目前HBV DNA的检测方法罗氏COBAS Amplicor系统的优势新一代技术COBAS TaqMan主要内容DiagnosticsHBV DNA检测带给我们的益处 监测抗病毒治疗效果 早期确定病毒学应答预测治疗后反应(HBsAg
6、 消失)预测耐药突变 预测肝移植后复发 检测HBsAg 携带者的病毒的活动情况Diagnostics指标正常/HBeAg 阳性(n.31)anti-HBe 阳性(n.15)转阴ALT 12 7HBeAg 12 NDdot-blot hybridization.12 7IgM anti-HBc ND 5Amplicor HBV Monitor 5 2HBsAg 3 2经治疗生化指标正常病人中病毒清除率Diagnostics治疗中/后，应答者与不应答者HBV DNA水平的比较baseline1-3wks4-7wks8-11wks12-15wks16-24wks0-5mths6-11mths12-1
7、8mths1x1021x1041x1061x1081x1010HBV DNA levelscopies/mlmean SEMp=0.07p=0.2p0.01p0.001p0.001p0.001p0.001p0.001p0.001-不应答者-应答者-治疗中 治疗后Diagnostics监测抗病毒治疗，预测耐药Puchhammer-Stockl E.at al.J Infect Dis 181:2063,2000DiagnosticsHBV DNA 载量显示携带者处于活动或非活动状态HBV DNA copies/mlManesis K.et al.Gastroenterology 122(7):2
8、092-3,2002.1.E+021.E+031.E+041.E+051.E+061.E+071.E+081.E+09非活动状态 活动状态DiagnosticsHBV DNA载量在肝移植中的应用 在肝移植中(Liver Transplantation)为防治肝移植后的复发所采取的预防性治疗需要达到HBV DNA104 copies/mL 的指标Diagnostics为什么进行HBV DNA检测HBV DNA检测带给我们的益处目前HBV DNA的检测方法罗氏COBAS Amplicor系统的优势新一代技术COBAS TaqMan主要内容Diagnostics目前HBV DNA的检测方法 罗氏CO
9、BAS Amplicor HBV Monitor Digene Hybrid Capture 杂交捕捉 Abbott Genostix 已消失 Bayer bDNA 3.0 国产HBV DNA检测试剂及方案 罗氏COBAS TaqMan HBV monitorDiagnostics灵敏度比较TechnologyLODcopies/mLRoche AMPLICOR300Digene Hybrid Capture 140,000Abbott Genostix 500,000Bayer bDNA 3.0 2,000Roche Cobas Taqman 35国产试剂？DiagnosticsBranch
10、ed DNA(bDNA)Diagnostics靶探针*Preamplifier*Microwell靶 DNA捕获探针微孔板捕获探针Amplifier*with hybridizedLabel Probes*components containing Iso-C/Iso-G 信号扩增Branched DNA(bDNA)Diagnostics国内Real time方法 HBV 的检测现状Diagnostics PCR 反应Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPT aq DNA PolymeraseAmpEraseTarget DNADiagnostics模板扩增1 cycle=22 cycle=
11、43 cycle=84 cycle=165 cycle=326 cycle=647 cycle=128Single strand RNADiagnostics水解探针(TaqMan)模式淬灭基团 报告荧光激发荧光淬灭激发荧光检测到信号Diagnostics实时荧光定量模式0510152025300 10 20 30 40 50 60相对荧光强度None1ThresholdCycle Threshold(Ct)for 108 C/PCRHBV DNALog C/PCR2876543循环数Diagnostics需要关注的国内实时荧光PCR检测的问题 仪器90源于进口，ABI、ROCHE、Bio-R
12、ad 试剂100国产，匹基、达安、科华、复星Diagnostics需要关注的国内实时荧光PCR检测的问题 目前国内使用的进口Realtime PCR仪全部是针对科研用途研发的，缺乏临床诊断所需的质控系统 所有进口PCR仪均为开放系统，除Roche外均不提供临检用试剂 仪器厂家仅负责仪器运行是否正常，不对检测结果做任何保障Diagnostics 均采用外部标准曲线定量，标准品为重组质粒，与临床标本有无差异？质控品及标准品有无朔源性？试剂是否标明“域值”或“Cross Band”取值范围？阳性质控是否给出标准值范围？标准品浓度是否覆盖声明的检测灵敏度？是否提供内部质控品？纯化产率如何控制？需要关注
13、的国内实时荧光PCR检测的问题Diagnostics检测结果标准化的问题 标准化的各要素校准品试剂分析仪Diagnostics为什么进行HBV DNA检测HBV DNA检测带给我们的益处目前HBV DNA的检测方法罗氏COBAS Amplicor系统的优点新一代技术COBAS TaqMan主要内容DiagnosticsCOBAS Amplicor 检测原理杂交(37 C)PCR扩增变性杂交清洗加AV-HRP 加TMBDiagnostics内部标准品(QS)全程监控样本制备/PCR过程兼作定量参照B B B BB BB B 内部标准品 DNA 模板 DNA模板 DNA内部标准品 DNACOBAS
14、 Amplicor：与固定在磁珠上的探针杂交内对照防止假阴结果，精确定量PCRDiagnosticsCOBAS AMPLICOR HBV Monitor特点 检测下线300 copies/mL,95%检出率 线性范围 300-200,000 copies/mL 同等定量亚型 A-F 血清或血浆 100 ul 样本 6 小时检测时间,30 分钟手工准备 内部定量标准 防污染系统DiagnosticsCOBAS Amplicor VS bDNADiagnosticsCOBAS Amplicor vs bDNADiagnosticsCOBAS Amplicor vs bDNACobas Amplic
15、or bDNA标本准备 乙醇沉淀 磁珠吸附扩增 靶序列 光信号线性范围300200,000 2000-100,000,000 特异性100%99.2%（96-98%)亚型AF AF污染控制 有 无定量方案 内部标准品 外部标准曲线Control数量 3个 12个报告时间8小时 24小时DiagnosticsCOBAS Amplicor HBV 灵敏度vs 其它测试?-预测反跳？-预测突变？-预测肝移植复发风险？其他测试的灵敏度COBAS Amplicor HBV 灵敏度1101001,00010,000100,0001,000,00010,000,000100,000,0000 4 8 12 20 24Weeks of therapyHBVDNA copies/mLDiagnostics为什么进行HBV DNA检测HBV DNA检测带给我们的益处目前HBV DNA的检测方法罗氏COBAS Amplicor系统的优势新一代技术COBAS TaqMan主要内容DiagnosticsCOBAS TaqMan 实时荧光检测系统