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1、重组DNA大肠大肠埃希菌埃希菌俗名大肠杆菌俗名大肠杆菌是人和动物肠道中最主要的细菌之一是人和动物肠道中最主要的细菌之一是正常菌群的成员是正常菌群的成员出生后数小时就进入肠道，并伴随终生出生后数小时就进入肠道，并伴随终生能合成维生素能合成维生素B B和和K K，供人体利用，供人体利用能抑制腐败菌及病原菌（如金黄色葡萄球菌、志贺菌属）能抑制腐败菌及病原菌（如金黄色葡萄球菌、志贺菌属）真菌（如白念珠菌）的过度增殖真菌（如白念珠菌）的过度增殖异位寄居时可引起肠外感染异位寄居时可引起肠外感染 某些菌株某些菌株有有致病性致病性消化道感染，导致腹泻等消化道感染，导致腹泻等 每个人每天平均从粪便中排出每个人每
2、天平均从粪便中排出10101111到到10101313个个可作为粪便污染的检测指标可作为粪便污染的检测指标常作为细菌的模式生物广泛用于科学研究常作为细菌的模式生物广泛用于科学研究基因工程的基因工程的工具菌工具菌生物学性状生物学性状 形态与染色形态与染色G-杆菌，杆菌，13m（短（短杆菌）杆菌）两端钝圆、无芽孢两端钝圆、无芽孢有周鞭毛有周鞭毛有普通菌毛有普通菌毛/性菌毛性菌毛 能运动能运动卫生细菌学检查卫生细菌学检查 大肠菌群大肠菌群 指指37OC24h内发酵乳糖产酸产气内发酵乳糖产酸产气包括埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属及肠杆菌属包括埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属及肠杆菌属等等大肠菌群
3、指数大肠菌群指数指指1000 ml被检样品中的大肠菌群数被检样品中的大肠菌群数生活饮用水的水质标准生活饮用水的水质标准coli-index 3个个 我国我国2007年开始实施的卫生标准规定年开始实施的卫生标准规定每每100ml生活饮用水中，不得检出总大肠菌群、耐热大生活饮用水中，不得检出总大肠菌群、耐热大肠菌群和大肠埃希菌肠菌群和大肠埃希菌 1 1、细菌培养、细菌培养-平板培养平板培养划线法培养划线法培养涂布法培养涂布法培养大肠杆菌的培养大肠杆菌的培养限制性内切酶EcoR I内切酶限制性内切酶限制性内切酶:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，
4、又催化非甲基化的DNA的水解；而型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。分子剪刀分子剪刀沃纳阿尔伯1929年生于瑞士。苏黎士工科大学毕业后，在日内瓦大学获得博士学位。1971年起，任巴塞尔大学教授。在研究噬菌体的遗传现象时，成功地分离出DNA的限制性酶和甲基化修饰酶，为此获1978年诺贝尔生理学医学奖。限制限制修饰现象修饰现象K（B）（B）：能够在大肠杆菌）：能够在大肠杆菌B菌株上生长的菌株上生长的噬菌体噬菌体第一次感染第一次感染K菌株，菌株，形成的噬菌斑很少，形成的噬菌斑很少，生长受寄主限制生长受寄主限制K（K）存活下来的噬菌体再次感染存活下来的噬菌体再次感染K菌株，则菌株，则形成的噬菌
5、斑形成的噬菌斑很多，不受限制很多，不受限制EOP:Efficiency of plating（生长在不同寄主中的噬菌体的成斑率成斑率，表示限制程度）说明说明K和和B菌株中存在一菌株中存在一种限制系统可排除外来的种限制系统可排除外来的DNA；10-4的存活率是由宿主限的存活率是由宿主限制系统作用的结果制系统作用的结果产生这种现象的原因何在产生这种现象的原因何在甲基化酶：甲基化酶：能使细胞自身核酸的内切酶识别序列的碱基甲基化，从能使细胞自身核酸的内切酶识别序列的碱基甲基化，从而使自身核酸免受内切酶水解而使自身核酸免受内切酶水解细菌的细菌的“防御防御”系统系统核酸内切酶：核酸内切酶：识别并水解外源识
6、别并水解外源DNA（外来核酸在内切酶识别序列上没外来核酸在内切酶识别序列上没有甲基化修饰作保护有甲基化修饰作保护）研究发现：原来是由两种酶配合完成，一种是起修饰作用的甲基化酶，另一种是核酸内切酶限制限制修饰修饰限制修饰体系K（B）（K）（B）：能够在大肠杆菌）：能够在大肠杆菌B菌株上生长的菌株上生长的噬菌体噬菌体K（K）再次感染再次感染K菌株，则形成菌株，则形成的噬菌斑很多，不受限制的噬菌斑很多，不受限制（K菌株已经对其进行了菌株已经对其进行了修饰）修饰）（B）噬菌体感染大肠杆菌）噬菌体感染大肠杆菌K菌株后，其菌株后，其DNA大部分被内切大部分被内切酶降解了，但有极少部分能在酶降解了，但有极少
7、部分能在特定序列甲基化，避免被酶解，特定序列甲基化，避免被酶解，因此有少量噬菌斑形成因此有少量噬菌斑形成。在限制修饰系统中，限制作用限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA（如噬菌体DNA等），使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而宿主细胞自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制修饰系统中修饰作用修饰作用的含义。限制修饰体系，其功能功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA，以保护和维持自身遗传信息的稳定，这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。分类分类核酸外切酶核酸外切酶核酸内切酶
8、核酸内切酶核酸酶核酸酶从核酸链的一端开始，一个接一个地消从核酸链的一端开始，一个接一个地消化降解核苷酸化降解核苷酸从核酸链分子内部切割从核酸链分子内部切割3，5磷酸二酯键，磷酸二酯键，使之断裂形成小片段使之断裂形成小片段核酸内切酶：核酸内切酶：按限制性酶的组成、限制和修饰活性、切断核酸的情按限制性酶的组成、限制和修饰活性、切断核酸的情况不同，分三类（况不同，分三类（I，II，III），），通常指的是通常指的是II型型。命名法H i n d III同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶如从流感嗜血杆菌如从流感嗜血杆菌d菌株（菌株（Haemophilu
9、s influenzae d）先后发）先后发现现3种限制性酶，则分别命名为种限制性酶，则分别命名为HindI，HindII，HindIII大肠杆菌大肠杆菌R菌菌株株REscherichia嗜血流感杆嗜血流感杆菌菌d株株dinfflluenzaeHaemophiillus株名株名（型号）（型号）种名的头两个字母种名的头两个字母宿主属名的第一个字母宿主属名的第一个字母coli前前3个字母代表来源的生物个字母代表来源的生物随后随后1个字母或阿拉伯数字代表菌株个字母或阿拉伯数字代表菌株最后最后1个罗马字母代表发现或鉴定的次序个罗马字母代表发现或鉴定的次序 基本特征基本特征识别并切割双链识别并切割双链D
10、NA（环状或线状）（环状或线状）分子中分子中4-8bp的特定序列的特定序列结构特征：旋转对称的回文结构结构特征：旋转对称的回文结构切割后产生的末端：切割后产生的末端：Cohesive terminus or Blunt end（粘性末端（粘性末端或平末端）或平末端）EcoR I的识别序列的识别序列5G C T G A A T T C G A G 33C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的切割位点的切割位点质粒质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有
11、自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。莱德伯格（莱德伯格（1925200819252008），美国遗传学家。），美国遗传学家。细菌遗传学的创始人之一。1925年5月23日生于美国蒙特克莱市。1944年获哥伦比亚大学哥伦比亚大学学士学位，以后曾在医学院学习，不久转入耶鲁大学，于1947年获博士学位。1959年起任斯斯坦福医学院坦福医学院教授兼遗传学系主任。1962年任肯尼迪分子医学实验室主任
12、。他在耶鲁大学期间，发现细菌的遗传重组细菌的遗传重组。1946年，他和E.L.E.L.塔特姆塔特姆发现遗传重组的普遍性。1952年发现细菌的F F因子因子。1952年发现沙门氏菌中的普遍性转导，1953年发现大肠杆菌的温和噬菌体在染色体上占有一定位置。1956年发现噬菌体能进行局限性转导。他们的研究工作还包括应用细菌的有性生殖和转导进行细菌的免疫学和代谢作用等方面的研究。1958年他和G.W.比德尔和E.L.塔特姆共同获得诺贝尔生理学或医学奖。接合现象的发现接合现象的发现接合：接合：指通过细菌细胞的直接接触，遗传物质从指通过细菌细胞的直接接触，遗传物质从供体供体转移到转移到受受体体并发生重组的
13、过程。并发生重组的过程。1946年年莱德伯格莱德伯格和塔特姆和塔特姆发现了发现了细菌的接合。细菌的接合。细菌的杂交实例细菌的杂交实例（1946）不同营养缺陷型的大肠杆菌（不同营养缺陷型的大肠杆菌（K12K12）：）：A菌株：菌株：met-bio-thr+leu+thi+，B菌株：菌株：met+bio+thr-leu-thi-这种野生型细胞如何出现的？这种野生型细胞如何出现的？U型管实验：型管实验：A、B菌株分别培养在基本培养基上菌株分别培养在基本培养基上 一边加压一边加压和吸引使培养液充分混合和吸引使培养液充分混合 结果任何一臂的培养基上均未长结果任何一臂的培养基上均未长出野生型细菌。出野生型
14、细菌。结论：菌株结论：菌株A A与菌株与菌株B B细胞直接接细胞直接接触（接合）是野生型细胞出现的触（接合）是野生型细胞出现的必要条件；两菌株直接接触后导必要条件；两菌株直接接触后导致遗传物质转移，进而发生基因致遗传物质转移，进而发生基因重组，产生野生型细菌。重组，产生野生型细菌。试验证明：试验证明：接合过程是一种接合过程是一种单向转移单向转移，A菌株遗传物质菌株遗传物质 B菌株，从菌株，从供体到受体。供体到受体。用大肠杆菌K12的菌株A和菌株B，首先用高剂量的链霉素链霉素处理菌株A或菌株B，把处理过的菌株A跟未处理过的菌株B混合，或把处理过的菌株B跟未处理过的菌株A混合，发现结果大不相同：F
15、 因子：致育因子或称性因子，是一种附加体。因子：致育因子或称性因子，是一种附加体。携带携带F F因子的菌株称为供体菌或雄性，用因子的菌株称为供体菌或雄性，用F F表示。表示。未携带未携带F F因子的菌株为受体菌或雌性，用因子的菌株为受体菌或雌性，用F F表示。表示。F F因子及因子及F F向向F F的转移的转移 F F因子的结构因子的结构染色体外遗传物质（质粒），环状染色体外遗传物质（质粒），环状DNADNA，9 9104 bp，大约为，大约为大肠杆菌环状染色体的大肠杆菌环状染色体的2%，具有，具有4060个蛋白质基因。个蛋白质基因。每个细胞（每个细胞（F）有）有2424个。个。F因子分为三个
16、区域：自主复制区：有转移的起点和2个复制起点。复制起点Ori T是在染色体转移时进行滚环复制滚环复制时的复制起点；Ori V是在营养时期，即游离在细胞质中独立复制独立复制时的复制起点。转移区：主要有合成性伞毛性伞毛即F纤毛纤毛（F pili）的操纵子。F纤毛是由性伞毛蛋白构成，呈管状，又叫接合管。通过接合管可将供体和受体细胞相联。共30kb长，有40个基因与DNA的转移有关。重组区：有4个插入顺序（IS），通过和宿主染色体上的IS同源重组或通过转座，F因子可以整合到宿主不同位点上。F F 因子的三种状态因子的三种状态有一个自主状态的有一个自主状态的F F因子，即因子，即F F细胞；细胞；带有一
17、个整合的带有一个整合的F F因子的细胞叫因子的细胞叫高频重组细胞高频重组细胞，HfrHfr细胞。细胞。没有没有F因子，即因子，即F细胞；细胞；F与与F菌菌（1）有）有F因子的细菌称为因子的细菌称为F，细菌增殖时可把，细菌增殖时可把F 因子传递给后代细胞（通过自主复制）。因子传递给后代细胞（通过自主复制）。（2）没有）没有F因子的细菌称为因子的细菌称为F，F细菌经吖啶细菌经吖啶 橙处理而丢失，成为橙处理而丢失，成为F。F因子一经丢失，因子一经丢失，细胞中便不再出现；细胞中便不再出现；（3）F可以和可以和F杂交，而不能和杂交，而不能和F杂交；杂交；（4）F菌菌与与F菌菌混混合合（即即FF）1小小时
18、时后后，约约95%的的F菌菌转转变变为为F菌菌，而而原原来来的的F仍仍然然保保留留有有F因子。因子。(1)F纤毛合成：由性伞毛蛋白构成，接合管接合管使供体和受体细胞接触。(2)转移启动：F因子从转移复制起点(Ori T)开始向F 转移（5端首先进入受体）。(3)单链转移，滚环复制。F F纤毛与接合管纤毛与接合管FFHfrHfr 是是F F因子整合到因子整合到E.coliE.coli 染色体上的结果染色体上的结果(1)E.coli染色体上有染色体上有20个以上的整合位点；个以上的整合位点；(2)整合通过整合通过IS等同源重组或转座实现；等同源重组或转座实现；(3)F因子有多个整合位点，主要在因子
19、有多个整合位点，主要在IS3处。处。分子克隆分子克隆pUC18pUC19含四个部分：含四个部分：（1 1）来自）来自pBR322pBR322的质粒复制起点的质粒复制起点（oriori）；）；（2 2）ampampr r ;（3 3）大肠杆菌）大肠杆菌半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因（lacZlacZ）的启动子及其编码）的启动子及其编码-肽链的肽链的DNADNA序列；序列；（4 4）多克隆位点（）多克隆位点（MCSMCS）lacZOriAmprMCS蓝白斑筛选重组子的原理：蓝白斑筛选重组子的原理：lacZ 编码编码半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的肽，在异丙基硫代肽，在异丙基硫代-D-半乳糖半乳糖苷（苷（IP
20、TG）的诱导下，使呈色底物）的诱导下，使呈色底物5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷（半乳糖苷（X-gal）被分解产生蓝色。因此携带空载体）被分解产生蓝色。因此携带空载体的大肠杆菌呈蓝色菌落。的大肠杆菌呈蓝色菌落。外源基因的插入使外源基因的插入使 肽失活，因而携带外源基因的重组子菌肽失活，因而携带外源基因的重组子菌落呈白色。落呈白色。利利用用菌菌落落颜颜色色筛筛选选重重组组子子PUC质粒载体的优点：质粒载体的优点：基因组小，拷贝数高，基因组小，拷贝数高，DNA产量高；产量高；有有LacZ筛选标记，筛选标记，LacZ基因插入失活，可用蓝白斑筛选阳基因插入失活，可用蓝白斑筛选阳性克隆；性
21、克隆；有有MCS，其中有，其中有13个以上的单一限制位点，可用于外源基个以上的单一限制位点，可用于外源基因克隆。因克隆。意义与应用意义与应用 重组DNA技术的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域，打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。Frankenstein（译作“科学怪人”或“弗兰肯斯坦”）是英国诗人雪莱的妻子玛丽雪莱在1818年创作的小说，被认为是世界第一部真正意义上的科幻小说。“弗兰肯斯坦”是小说中那个疯狂科学家的名字，他用许多碎尸块拼接成一个“人”，并用电将其激活。Frankenstein已经成为科幻史上的经典，现在很多幻想类影视作品中经常出现这个怪物的翻版。