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1、ICS 11.120.01 CCS C27 团 体 标 准 T/TPPA 0001-2022 RBL-2H3 肥大细胞脱颗粒法 评价中药注射剂类过敏反应操作规程 Operating procedure for evaluating the anaphylactoid reactions of traditional Chinese medicine injection by RBL-2H3 mast cell degranulation method 2022-12-22 发布 2022-12-22 实施 天津市医药行业协会 发布 T/TPPA 0001-2022 目 次 前 言.I 1 范围
2、.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 检测原理.1 5 材料与设备.2 5.1 材料.2 5.2 设备.2 6 实验方法.2 6.1 溶液配制.2 6.2 实验步骤.3 7 数据处理及判定.5 T/TPPA 0001-2022 I 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由天津天士力之骄药业有限公司提出。本文件由天津市医药行业协会归口。本文件起草单位：天津天士力之骄药业有限公司、天津大学、天津市药品检验研究院、天津市中药注射剂安
3、全性评价企业重点实验室、创新中药关键技术国家重点实验室、现代中医药海河实验室、河南天地药业股份有限公司、天津红日药业股份有限公司。本文件主要起草人：鞠爱春、华晓东、李德坤、岳洪水、周水平、张俊华、周立华、万梅绪、庄朋伟、张燕欣、王冲、徐琳、李智、何毅、白晓丽、马晓慧、王蕴华、吕欣、黄芝娟、江昕、张松梅。T/TPPA 0001-2022 1 RBL-2H3 肥大细胞脱颗粒法评价中药注射剂类过敏反应操作规程 1 范围 本文件规定了RBL-2H3肥大细胞脱颗粒的实验方法。本文件适用于中药注射剂通过RBL-2H3肥大细胞脱颗粒法对类过敏反应的评价。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引
4、用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 组胺 histamine 组胺是一种有机含氮化合物，由组氨酸在脱羧酶的作用下产生。许多组织，特别是皮肤、肺和肠黏膜的肥大细胞中含有大量的组胺。当组织受到损伤或发生炎症和过敏或类过敏反应时，都可释放组胺。组胺有强烈的刺激血管作用，并能使毛细血管和微静脉的管壁通透性增加，血浆漏入组织，导致局部组织水肿。3.
5、2 -氨基己糖苷酶-hexosaminidase -氨基己糖苷酶是一种生物活性因子。肥大细胞受到外源刺激时，迅速释放到组织内引起血管通透性增加。常被作为检测过敏反应的标志物。4 检测原理 T/TPPA 0001-2022 2 肥大细胞是类过敏反应的靶细胞之一，在类过敏反应中，细胞受到外源刺激，出现脱颗粒现象，释放多种生物活性因子，如组胺、-氨基己糖苷酶等，因此肥大细胞脱颗粒百分率、组胺释放率及-氨基己糖苷酶释放率为类过敏反应的重要检测指标。5 材料与设备 5.1 材料 5.1.1 细胞 RBL-2H3细胞。5.1.2 试剂试药 a）氢氧化钠、氯化钠、十二水磷酸氢二钠、十二水磷酸二氢钠、碳酸氢钠
6、、邻苯二甲醛、甲醇、盐酸，上述试剂均为分析纯。b）C48/80、中性红、胰酶、聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）、DMEM 培养基、胎牛血清、PBS缓冲液、青-链霉素、CCK-8 检测试剂盒、-氨基己糖苷酶检测试剂盒。c）水为 GB/T 6682 规定的三级水。5.2 设备 酶标分析仪、微孔板振荡培养箱。6 实验方法 6.1 溶液配制 6.1.1 DMEM完全培养基的配制 将 DMEM 培养基、胎牛血清和青-链霉素按照 89:10:1 的体积比混合均匀，即得 DMEM 完全培养基，4保存备用。6.1.2 2mg/mL C48/80溶液的配制 称取 C48/80 加水配制成 2mg/m
7、L C48/80 溶液。6.1.3 1%中性红染液的配制 称取中性红加水配制成 1%中性红染液。6.1.4 0.1%邻苯二甲醛-甲醇溶液的配制 称取邻苯二甲醛 0.05g，加甲醇溶解并定容至 50mL，避光，4保存。6.1.5 0.1mol/L盐酸溶液的配制 T/TPPA 0001-2022 3 取盐酸加水配制成 0.1mol/L 盐酸溶液。6.1.6 0.4mol/L氢氧化钠溶液的配制 称取氢氧化钠加水配制成 0.4 mol/L 氢氧化钠溶液。6.1.7 0.5%TritonX-100-PBS溶液的配制 吸取 TritonX-100 加 PBS 配制成 0.5%的 TritonX-100-P
8、BS 溶液。6.1.8 基底溶液的配制 取 10mg 的 4-硝基苯-N-乙酰基-D-葡糖胺溶于 10mL 的 0.09mol/L 柠檬酸盐溶液中，-20保存。6.1.9 终止液的配制 称取碳酸钠 4.2g 加水溶解并定容至 100mL。6.2 实验步骤 6.2.1 细胞培养 将 RBL-2H3 细胞加入 DMEM 完全培养基中，置于 5%CO2培养箱中 37培养。观察细胞的生长状态，当细胞汇合度达 90%时，可进行传代或冻存。6.2.2 细胞传代 将可传代的细胞从 CO2培养箱中取出，弃去培养液，PBS 缓冲液清洗 23 遍，随后加入 2mL 胰酶消化液，CO2培养箱中孵育 12min 至细
9、胞完全脱落，迅速加入 2mL DMEM 完全培养基中止消化，轻轻吹打，将细胞收集于离心管中，800rpm 离心 5min，弃上清液。计数细胞，以 1:3 进行传代培养。为保证实验所用细胞的稳定性，细胞代数控制在 520 代内。6.2.3 细胞生长曲线的测定 取生长状况良好的 RBL-2H3 细胞，调整细胞浓度依次为：2.5104个/mL、5104个/mL、7.5104个/mL、1.0105个/mL、1.5105个/mL，均匀接种细胞于 96 孔微孔板中，每孔 200L 细胞悬液，每个浓度组设 6 个平行，于 5%CO2的培养箱中 37培养 24h、48h、72h、96h、120h、144h、1
10、68h。培养终止时，每孔加入 20L CCK-8 溶液，继续培养 0.5h，用酶标仪于 450nm 处检测各孔的吸光度值，以 DMEM完全培养基调零。绘制细胞生长曲线。6.2.4 细胞接种 收集对数生长期的 RBL-2H3 细胞，根据细胞生长曲线结果，调整处于细胞生长对数期的细胞浓度范围为 5.01047.5104个/mL，均匀接种 96 孔微孔板中，每孔加入 200L 细胞悬液，于 5%CO2培养箱中 37培养约 36h，至细胞汇合度达 80%。上述细胞实验均应符合 GB 19489 的要求。T/TPPA 0001-2022 4 6.2.5 对中性红染色法细胞脱颗粒影响的评价 取6.2.4项
11、下接种细胞的96孔微孔板，每孔弃去细胞上清液100L，设置阴性对照组、阳性药组和供试品组，每组6个平行，分别加入PBS、C48/80和供试品药液各100L，37孵育30min，弃去细胞上清液，每孔加入1%中性红染液100L，染色30min，弃去染液，PBS 缓冲液清洗23次，倒置显微镜下观察细胞脱颗粒情况，计算细胞脱颗粒百分率，其计算公式：细胞脱颗粒百分率（%）=N脱颗粒细胞/（N脱颗粒细胞+N未脱颗粒细胞）100%式1 式中：N脱颗粒细胞脱颗粒细胞数 N未脱颗粒细胞未脱颗粒细胞数 6.2.6 供试品对组胺释放率的评价 取6.2.4项下接种细胞的96孔微孔板，设置阴性对照组、阳性药组和供试品组
12、，每组6个平行，取出细胞上清液100L置于测试荧光板中，测试荧光板中另设置3个平行空白对照，空白对照取DMEM完全培养基100L。随后测试荧光板各孔加入0.4mol/L氢氧化钠溶液50L后，加入0.1%邻苯二甲醛-甲醇溶液10L，室温放置10 min，加入0.5mol/L盐酸溶液50L终止反应，立即用多功能酶标仪检测荧光值（入射波长360nm，发射波长450nm）。96孔微孔板中剩余的细胞用0.5%的TritonX-100-PBS溶液100L进行裂解，37孵育30min 后，取细胞裂解液100L置于测试荧光板中，测试板各孔加0.4mol/L氢氧化钠溶液50L后，立即加入0.1%邻苯二甲醛-甲醇
13、溶液10L，室温放置10min，加入0.5mol/L盐酸溶液50L终止反应，立即用多功能酶标仪检测荧光值（入射波长360nm，发射波长450nm）。计算组胺释放率，其计算公式：组胺释放率（%）=(A上清 A空白)/(A上清-A空白)+(A裂解-A空白)100%式2 式中：A上清样品中上清液的吸光度 A空白空白对照的吸光度 A裂解样品中裂解液的吸光度 6.2.7 供试品对-氨基己糖苷酶释放率的评价 取 6.2.4 项下接种细胞的 96 孔微孔板，设置阴性对照组、阳性药组和供试品组，每组 6 个平行，取细胞上清液 10L 后分别加入 PBS、C48/80 和供试品药液各 90L，空白对照取 DME
14、M 完全培养基10L 后加入 PBS 90L，37孵育 30min。随后每孔加入 100L 终止液，终止反应，混合均匀，立即在酶标仪在 405nm 处检测吸光度值。96 孔微孔板中剩余的细胞用 0.5%的 TritonX-100-PBS 溶液 100L进行裂解，37孵育 30min。取细胞裂解液 100L，37孵育 30min。随后每孔加入 100L 终止液，终止反应，混合均匀，立即在酶标仪在 405nm 处检测吸光度值。计算-氨基己糖苷酶释放率，其计算T/TPPA 0001-2022 5 公式：-氨基己糖苷酶释放率（%）=(A上清A本底)/(A上清+裂解-A本底)100%式 3 式中：A上清样品中上清液的吸光度 A空白空白对照的吸光度 A裂解样品中裂解液的吸光度 7 数据处理及判定 对各组实验数据进行单因素方差统计学分析，实验数据以xs表示，各给药组脱颗粒率、组胺释放率、-氨基己糖苷酶释放率与PBS对照组比较，P0.05表示为存在显著性差异。若3项检测数据均存在显著性差异，判定该供试品有发生类过敏反应的风险。