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1、食品生物工程下游技术1主要内容 1 概述 2 原料与预处理 3 固液分离和细胞破碎 4 初步纯化 5 精细纯化 6 成品加工 7 案例21 概述 生物下游技术也称下游工程,或生物活性物质分离纯化,是指从基因工程获得的动、植物和微生物的有机体或器官中，比细胞工程、发酵工程和酶工程产物（发酵液、培养液）中把目标化合物分离纯化出来，使之达到商业应用目的的过程。31.1生物工程下游技术的重要性 基因工程、细胞工程、发酵工程和酶工程的产物不能直接成为产品，必须经过分离工程得到高纯度的产品。41.2生物工程下游技术的特点 在原料液中目标成分的含量很低。原料液是复杂的多相体系。目标成分的稳定性较差，对热、酶
2、、空气、光等因素敏感，易分解和失活。要求产品的纯度很高。51.3下游工程的目的产物 具有保健功能或治疗作用的功能因子、专用添加剂（如有防腐作用抗菌多肽、改进食品风味的有机化合物），以及专用于食品的微生物或酶等。（1）目的产物的特点 通常是活的有机体或具有生理活性的有机化合物，不稳定，易变性，易失活。许多目的产物的相对分子质量较大。目的成分在制备液中浓度往往较低，但要求产品的纯度却很高。6 目的产物中的生物制剂含有丰富的营养成分，易被微生物污染和分解。成分较为复杂，有的可用常规分析方法检测，有的应用分子检测技术进行检测。许多功能因子参与人体机能的精细调节。7（2）食品生物技术产品可分为5类：蛋白
3、质、多肽、氨基酸类，包括抗菌蛋白、抗生素、肿瘤坏死因子、干扰素等。酶、辅酶、酶抑制剂类，如溶菌酶、纤维素酶等。多糖类，包括食用胶、促红细胞生长素、肝素、真菌多糖等。免疫调节类，如生长激素、白细胞介素等。其他，包括脂类、多不饱和脂肪酸、维生素等。8（3）目的产物的商业用途 功能食品 食品添加剂 生物药物 化妆品91.4 下游工程的基本路线 预处理：加热、调整pH、絮凝 固液分离：珠磨、匀浆、酶溶、离心 初步纯化：萃取、吸附、沉淀、离心 精细纯化：层析、电泳、分子蒸馏 成品加工：结晶、浓缩、干燥101.5 下游工程的质量控制 首先确定下游工程的工艺路线和参数，在生产过程中严格执行工艺流程和参数，以
4、保证生产高质量的产品。注意安全防护，遵循生物技术安全规定。食品生物技术产品的质量控制应包括产品的鉴定、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性等。11主要内容 1 概述 2 原料与预处理 3 固液分离和细胞破碎 4 初步纯化 5 精细纯化 6 成品加工 7 案例122.1 原料 下游工程的原料包括发酵工程、酶工程、细胞工程的发酵液和培养液，以及基因工程获得的动、植物、微生物的有机体或器官。目前，发酵液和培养液仍是下游工程的主要原料。132.2 发酵液预处理（1）加热。提高发酵液温度可显著降低悬浮液的黏度，提高过滤速度。但是目的产物必须具有热稳定性。（2）调节pH 值。利用蛋白质等电点沉淀。（3）凝聚
5、和絮凝。在化学试剂的作用下，改变发酵液中的大分子物质和细胞碎片的分散性质，使之聚结沉淀的现象。143 固液分离和细胞破碎3.1 固液分离 胞外产物-液相部分 胞内产物-固相部分（1）离心分离。在离心产生的重力场作用下使悬浮颗粒沉降下来的操作过程。高速冷冻离心机 蝶式离心机 管式离心机 倾析式离心机15（2）过滤分离。操作中迫使悬浮液通过固相支承物或过滤介质，截留固相，以达到固液分离的目的。压力过滤 真空过滤 错流过滤163.2 细胞破碎3.2.1常用细胞破碎方法（机械和非机械）珠磨法。珠磨机中细胞悬浮液与直径小1mm的玻璃珠、石英砂等快速研磨，使细胞破碎，使细胞内含物释放出来。高压匀浆法。高压
6、匀浆机由高压泵和匀浆阀组成，细胞悬浮液通过针形孔，在高压驱动使下高速运动并发生剧烈冲击，使细胞破裂。17 超声破碎法。超声波形成的空穴产生压力时对微生物细胞产生冲击。酶溶法。微生物生长到一定阶段，即能产生溶菌酶，将自身的细胞壁溶解。因此控制发酵悬浮液的温度、pH 等条件，即可使细胞自溶。183.2.2 包涵体的处理 在基因工程中作为目的产物的蛋白质常常互相交联在一起，形成不溶性聚集物，称为包涵体。存在于包涵体中的重组蛋白质在大多数情况下不溶于水也不具备生物活性，因为分子内和分子间的二硫键搭错了位置。与一般微生物细胞相比，基因工程菌的细胞破碎要复杂得多。19 包涵体的分离。溶菌酶法或超声波法处理
7、基因工程菌，使菌体细胞破碎，经离心、弃上清液，得包涵体。再用蔗糖溶液、低浓度弱变性尿素缓冲液或温和的表面活性剂等冲洗包涵体，清除杂蛋白、DNA、RNA 和酶。包涵体的溶解。先用变性剂（尿素）或表面活性剂（十二烷黄酸钠）溶解包涵体，使蛋白质肽链分离。再加入还原剂二巯基苏糖醇（DTT）或二巯基乙醇（ME）等，使二硫键可逆地断裂。20 蛋白的复性。变性蛋白质初步纯化浓缩以后，透析除变性剂和还原剂。大部分蛋白质即重新折叠，被空气氧化，在正确位置上重建二硫键，恢复其活性。214 初步纯化 4.1萃取 目标物质在发酵液或提取液中浓度较低，必须通过萃取把目标物质与大多数杂质从混合物中分离出来。224.1.1
8、溶剂萃取 通常选择萃取能力强、分离程度高的溶剂。用有机溶剂萃取水相中的目标组分时，应调节水相中的pH 值、温度、盐浓度等，以提高萃取效果。234.1.2 超临界CO2流体萃取 超临界萃取的技术原理：利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。当然，对应各压力范围所得到的萃取物不可能是单一的，但可以控制条件得到最佳比例的混合成分，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的，所以超
9、临界CO2流体萃取过程是由萃取和分离过程组合而成的。2425超临界二氧化碳萃取法特点：二氧化碳的临界温度为31.1,临界压力7.38MPa,在一般条件下容易达到临界点,适合于对热不稳定的生理活性物质的萃取;二氧化碳是不活泼气体,不会着火,不起化学作用,对人体无害;高纯度的二氧化碳容易获得,价格低。26 如:用超临界CO2萃取技术提取玫瑰精油,然后用分子蒸馏对所得的萃取物进行精分离,得到高质量的玫瑰精油.其他:蒜油、姜油、中药挥发油等 271、萃取和分馏合为一体，工艺流程简单、萃取效率高、时间短。2、萃取温度相对低，适合热不稳定性物质的提取。3、不使用有毒溶剂，产品无任何溶剂残留，对人及环境友好
10、。4、液体CO2 可净化、循环使用。284.1.3 双水相萃取 两种亲水性高聚物溶液混合后静止分层为两相（双水相），生物大分子在两相中有不同的分配而实现分离，而且生物大分子在上相和下相中浓度比为一常数。溶质的分配总是趋向于系统能量最低的相或相互作用最充分的相。常用的双水相体系有聚乙醇（PEG）/葡聚糖（Dextran），PEG/磷酸盐体系。294.1.4 反胶束萃取 在水和有机溶剂构成的两相体系中，加入一定量表面活性剂，使之存在于水相和有机相之间的界面。表面活性剂不断包围水相中的蛋白质，形成直径为20200nm 的球形“反胶束”，并引导入有机相中，完成对蛋白质的萃取和分离。反胶束萃取操作简单，
11、萃取能力大，选择性中等。304.2 吸附 正吸附：在生物活性物质分离中常用固体吸附剂吸附溶液中的目的物质；负吸附：吸附杂质314.2.1 普通吸附剂吸附 普通吸附剂有活性炭、磷酸钙、白陶土、硅藻土、聚酰胺等。活性炭是最常用的吸附能力很强的非极性吸附剂。磷酸钙由浓磷酸和氢氧化钙反应制成，呈凝胶状，用以吸附目的蛋白或杂蛋白。用普通吸附剂吸附操作简便，较少引起生物活性物质的变性失活，但专一性较差。32 4.2.2 离子交换吸附 利用树脂上的离子性功能团与溶液中的离子进行吸附，而将呈离子状态的目的物质或杂质从溶液中分离出来。常见的树脂有强酸性、弱酸性、强碱性、弱碱性4 类。树脂的吸附能力取决于交联度、
12、膨胀度和交换容量。树脂的预处理 树脂可再生重复使用，该法操作简便，选择性较强，应用较广。334.2.3 大网格聚合物吸附 大网格聚合物为非离子树脂，能从低浓度溶液中吸附有机化合物。大网格树脂分为非极性、中极性、极性三种，分别以苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯和丙烯酰胺为骨架。从极性溶液中吸附非极性溶质应选用非极性树脂，从非极性溶液中吸附极性溶质应选用极性树脂。大网格聚合物吸附操作简便，条件温和，选择性中等，有一定的应用。344.3 沉淀 沉淀是将溶液中的目的产物或主要杂质以无定形固相形式析出再进行分离的单元操作。4.3.1 等电点沉淀法 等电点沉淀法是调节溶液pH 值使两性溶质溶解度下降而析出。该法操作
13、简便，成本较低，给分离体系相入的杂质较少，但生物大分子即使在等电点仍有一定的溶解度，使沉淀不完全。而且许多大分子等电点很接近，不易分离。因此等电点法应结合其他方法一起使用，才能有好的效果。35 4.3.2 盐析法 盐析是向溶液中加入大量中性盐，中性盐的离子中和生物大分子的表面电荷，破坏分子外围的水化层，从而使生物大分子聚集沉淀。所用的中性盐为硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钠等，以硫酸铵最常用。盐析得到的沉淀可采用过滤法或离心法与盐溶液分离。36 4.3.3 有机溶剂沉淀法 生物大分子溶液中加入一定量的亲水性有机溶剂，使溶质的溶解度降低而沉淀析出，即有机溶剂沉淀法。常用的有机溶剂为乙醇
14、、丙酮、甲醇、异丙醇等。乙醇最常用。374.3.4 聚合物絮凝沉淀法 水溶性非离子型多聚物絮凝剂有脱水作用，加入蛋白质溶液中可使蛋白质沉淀。常用的多聚物絮凝有聚乙二醇、葡聚糖等。384.4 离心4.4.1 制备型超速离心 分成普通离心机、高速离心机、超高速离心机。4.4.2 密度梯度离心 密度不同的物质在密度梯度溶液中离心，被分布于不同位置而分离。4.4.3 差分离心 依次提高离心力，将各组分逐级分离和纯化的方法。394.5 膜分离 膜分离是用不同孔径的滤膜把不同相对分子质量和体积的物质分离开来的方法。4.5.1 透析分离 实验室最常用的膜分离，能把分子量相差较大的两类物质分离开来。常用的透析
15、膜为玻璃纸、硝化纤维薄膜等。透析法操作简便，不需要附加压力，成本低廉，应用广泛，但选择性低。40 4.5.2 微滤膜分离 微虑膜由纤维素、聚砜、聚酰胺、全氟羧酸组成的管式或中空纤维式膜。其膜孔径在0.05 2.0m 之间，可阻留分子量为20 500 万的物质，所需压力在0.1Mpa以下。适用于细菌、微粒等的分离；该法操作简单，但选择性较差。41 4.5.3超滤膜分离 超滤膜由表皮层和支撑层组成，膜孔径在0.0015 0.2m，截留分子量范围为103 106，所需压力为0.3 0.7Mpa，适用于大分子(蛋白质、胶体等)与小分子(无机盐及低分子有机物等)溶液的分离；又分错流过滤和重过滤，重过滤使
16、用较多。主要用于蛋白质和酶的初步纯化和浓缩，操作简便，能耗低，效果佳，但容易造成膜污染和浓差极化。42 4.5.4 纳滤分离 和超滤分离极为接近，但是孔径更小，只有（12nm），阻留的分子量100-250。纳滤主要用于肽的分离纯化和浓缩、乳清的脱盐和浓缩或者食品工厂的有机废水的处理等。43 4.5.5 反渗透分离 膜孔径小于0.002m,阻留的分子量为600 以下,所需压力为1.4 2.0Mpa,适用于分子量小于500 的低分子无机物或有机物水溶液的分离。44 目前,所应用的膜过程还有电渗析、渗透气化、气体膜分离、膜控制释放、液膜分离、膜传感器、膜萃取、膜分相、膜蒸馏等。膜分离的特点:膜分离过
17、程特别适用于对热敏感的物质。膜分离过程不发生相变化,具有冷杀菌潜势,能耗低。膜分离过程可用于冷法杀菌,保持了产品的色、香、味及营养成分。45 膜分离广泛，仅用压力作为膜分离的推动力,因此分离装置简便,操作容易、易自控、维修,且在闭合回路中运转,减少了空气中氧的影响。膜分离过程对稀溶液中微量成分的回收,低浓度溶液的浓缩是有效的,且物质的性质不会改变。4647485 精细纯化 5.1 层析 层析技术又叫色谱分离技术。常见的层析技术有纸层析、薄层（平板）层析、柱层析3 种。纸层析和薄层层析进样量太少，主要用于定性和定量分析。柱层析进样量大，回收容易，因而主要用于分离纯化，也可用于定性定量分析。49
18、5.1.1 凝胶层析（1）葡聚糖凝胶层析 应用最广泛的层析固定相，商品名Sephadex，由右旋糖酐Dextran 通过交联而成，干胶为坚硬白色粉末，吸水后膨胀，成凝胶状。凝胶层析时，移动相通过网状结构的葡聚糖凝胶时，小分子可进入凝胶内部空间，而大分子则被排阻于凝胶相之外，在不断洗脱时大分子被首先洗脱胎换骨，小分子最后洗脱，就把大小分子分离开。使用过的凝胶可反复使用，如多次使用被污染后，应采用反冲洗洗去污染杂质。葡聚糖凝胶常用于分离纯化蛋白质和多糖等。50（2）琼脂糖凝胶层析 琼脂糖是从海藻琼脂中除去带磺酸基和羧基的琼脂胶后得到的中性多糖。琼脂糖经修饰接上烷基、苯基等疏水基团，即形成疏水作用琼
19、脂糖凝胶，能把溶液中不同疏水性的蛋白质，甚至蛋白质的不同亚基分离开。琼脂糖经修饰生成双羧甲基氨琼脂糖，与过渡金属结合，形成金属螯合琼脂糖凝胶，即可把金属离子配位亲和力不同的蛋白质分离开来。51（3）聚丙烯酰胺凝胶层析 聚丙烯酰胺为化学合成凝胶，化学稳定性好，机械强度好，有较高的分辨率。生物凝胶的孔径度取决于交联度和凝胶浓度。凝胶层析操作简便、不需要昂贵的设备，分辨效果好，应用广泛，但较费时和消耗大量溶剂。52 5.1.2 亲和凝胶层析 亲和凝胶层析是联接在琼脂糖凝胶上的配基与移动相中的生物大分子进行特异的可逆结合，从而把生物大分子分离纯化。一些生物分子与另一些生物分子无论在生物体内还是试管里都
20、表现出特别的的亲和力。如酶和底物、酶与抑制剂、酶与辅酶、抗体与抗原、激素与受体蛋白等。每一组亲和的生物分子都互为配基。53 亲和层析的一个重要分支是免疫亲和层析，它利用抗原-抗体的亲和反应进行酶的分离纯化。免疫亲和层析除了可以分离纯化酶以外，还可用来分离纯化受体蛋白，即细胞表面能与激素、功能因子或药物发生专一结合的生物大分子。亲和层析的分辨力高，但配基的选择和固相化比较困难，因而工业应用不如凝胶层析广。54 5.1.3 制备型高效液相色谱 制备型HPLC 是在分析型HPLC 的基础上发展起来的。制备型HPLC 对层析中的样品容量、回收率、产率要求较高，而对分离和速度要求不高。制备型HPCL 常
21、用于分离肽、蛋白质、核酸与核苷酸、多糖等。制备型高效液相色谱分离效果好，但设备昂贵，操作繁锁。555.2 电泳 原理：蛋白质是两性大分子，在一定的pH缓冲液中，蛋白质或带正电，或带负电，或在等电点时不带电。在电场的作用下，带正电荷的蛋白质移向负极，带负电的蛋白移向正极，处于等电点的蛋白质不移动。就可将两性大分子分离开来。565.2.1 凝胶电泳 常用聚丙烯酰胺凝胶电泳。不同浓度的聚丙烯酰受凝胶有不同的孔径，浓度越高孔径越小。两性大分子一方面受到电场作用而移动，一方面受到网格的阻滞作用，一边移动一边排列，形成区带，从而达到分离的目的。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果好，时间短，但操作复杂。57 5.2
22、.2 等电点聚焦电泳 当载体为连续pH 梯度时，不同蛋白质移动至该蛋白质等电点的pH 位置处，便不再移动，聚集成极窄的区带，从而达到分离的目的。等电点聚焦电泳分辨率高，但操作复杂，成本高，进样量小。585.3 分子蒸馏 分子蒸馏（短程蒸馏）是一项较新的分离技术，能解决大量常规蒸馏技术所不能解决的问题。分子蒸馏是一种特殊的液液分离技术，能在极高真空下操作，它依据分子运动平均自由程的差别，能使液体在远低于其沸点的温度下将其分离，特别适用于高沸点、热敏性及易氧化物系的分离。59分子蒸馏的基本原理：分子蒸馏是一种特殊的液-液分离技术，它不同于传统蒸馏依靠沸点差分离原理，而是靠不同物质分子运动平均自由程
23、的差别实现分离。这里，分子运动自由程（用 表示）是指一个分子相邻两次碰撞之间所走的路程。当液体混合物沿加热板流动并被加热，轻、重分子会逸出液面而进入气相，由于轻、重分子的自由程不同，因此，不同物质的分子从液面逸出后移动距离不同，若能恰当地设置一块冷凝板，则轻分子达到冷凝板被冷凝排出，而重分子达不到冷凝板沿混合液排出。这样，达到物质分离的目的。6061分子蒸馏器的结构及特点 1 分子蒸馏器即在刮板蒸发器的基础上在内部安置一个冷凝器。当进料混合物受热后某轻物质分子运动至一定距离时碰到冷凝器即被凝结成液体分离出来，重物质而沿器壁流下。2 操作温度远低于物料的沸点：由分子蒸馏原理得知，混合物的分离是由
24、于不同种类的分子逸出液面的平均自由程不同的性质来实现的，并不需要沸腾，所以短程蒸馏是在远低于沸点的温度下进行操作的。623 受热时间短：由分子蒸馏原理知，受加热的液面与冷凝面间的距离要求比轻分子的平均自由程短，由液面逸出的轻分子，几乎未经碰撞就到达冷凝面，所以受热时间很短。另外，混合液体呈薄膜状，使液面与加热面的面积几乎相等，这样物料在蒸馏中受热时间就变得更短。对其他蒸馏而言，受热时间一般较长（30 分钟以上），而短程蒸馏仅为十几秒。63分子蒸馏的条件是：残余气体的分压必须很低，使残余气体的平均自由程长度是蒸馏器和冷凝器表面之间距离的倍数。在饱和压力下，蒸汽分子的平均自由程长度必须与蒸发器和冷
25、凝器表面之间距离具有相同的数量级。64实际应用中的优势：分子蒸馏真空度高，操作温度低和受热时间短，对于高沸点和热敏性及易氧化物料的分离，能极好地保证物料的天然品质。分子蒸馏不仅能有效地去除液体中低分子物质，如：有机溶剂、臭味等，而且有选择地蒸出目的产物，去除其它杂质，因此被视为天然品质的保护者和回归者。分子蒸馏能实现传统分离方法无法实现的物理过程，因此，在一些高价值物料的分离上被广泛用作脱臭、脱色及提纯的手段。6566主要内容 1 概述 2 原料与预处理 3 固液分离和细胞破碎 4 初步纯化 5 精细纯化 6 成品加工 7 案例676 成品加工 经过分离纯化得到的高纯度和较高浓度的溶液，可以制
26、备成各种口服液或输液等成品，也可以作为半成品，进一步加工成精细食品、药品和化妆品。686.1 结晶 结晶是固体物质以晶体形态从溶液中析出的过程。结晶是同类分子或离子进行规则排列的结果，只有当溶质在溶液中达到一定纯度和浓度要求后方能形成晶体，而且纯度越高越容易结晶。结晶过程分为3 个步骤：过饱和溶液的形成 晶核的生成 晶体的生长696.2 浓缩 浓缩用于提高液相中溶质的浓度，为结晶和干燥做准备。对于热稳定的目的产物可用常规的水浴常压蒸发、减压蒸发等。对于热不稳定的生物大分子通常采用冷冻浓缩、葡聚糖凝胶浓缩、聚乙二醇浓缩、超滤浓缩等。706.3 干燥6.3.1 气流干燥 是固体流态化干燥方法，把呈
27、泥状、粒状或小块状的湿物送入热干燥介质中，物料在运动中与热介质一起进行热交换，得到粉粒状干燥产品。6.3.2 喷雾干燥 用压缩空气将溶液自喷嘴以1015m 雾滴形式喷入温度为120 的干燥室，在1540s 内雾滴被干燥为细粉。6.3.3 冷冻干燥 冷冻干燥是在低于水的三相点压力下进行的干燥。717 案例 蛋白质和肽 酶 核酸 糖类 脂类72 许多蛋白质和多肽对人体的生理活动具有调节作用,如细胞生长刺激因子（白细胞介素、神经生长因子、表皮生长因子、细胞集落刺激因子）和细胞生长抑制因子（如干扰素、肿瘤坏死因子、转化生长因子等）。获得活性肽的途径有三种：1）从天然生物体中提取天然活性肽2）在消化过程中产生的或体外水解蛋白质产生3）通过化学方法、酶法、重取DNA 技术合成73