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1、 第十九章第十九章 生物素生物素-亲合素系统及亲合素系统及其在免疫检测技术中的应用其在免疫检测技术中的应用 讲授内容讲授内容讲授内容讲授内容第第第第19191919章章章章 生物素生物素生物素生物素-亲合素系统亲合素系统亲合素系统亲合素系统及其及其及其及其 在免疫检测技术中的应用在免疫检测技术中的应用在免疫检测技术中的应用在免疫检测技术中的应用第一节 生物素的特性第二节 亲合素和链霉亲合素的特性第三节 生物素与亲合素结合反应的特点第四节 BAS在免疫检测技术中的应用 1掌握生物素-亲和素系统的特点2掌握BAS在免疫检测技术中的应用3熟悉生物素-亲合素系统多级放大效应的原理4生物素和亲合素（链霉
2、亲合素）的理化性质5.了解活化生物素的制备方法教教 学学 目目 标标概概 述述生物素-亲合素系统（biotin-avidin system，BAS）是20世纪70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。生物素与亲合素间高度亲合力，结合迅速、专一、稳定。既能偶联抗原、抗体、核酸等大分子生物活性物质，又能被酶、荧光素、胶体金、化学发光物及放射性核素等各种示踪物标记。概概 述述1个亲合素与4个生物素化分子结合及1个大分子活性物质能与多个生物素结合特点，使BAS产生多级放大效应多级放大效应，极大地提高了免疫检测和分析的敏感性。目前，BAS已广泛应用于整个生物学领域，是微量抗原与抗体定性、定量检测及定
3、位观察研究的常用技术，也是生物医学研究工作中最具使用价值和发展前途的技术之一。讲授内容讲授内容讲授内容讲授内容第一节第一节 生物素的特性生物素的特性一、生物素理化性质二、活化生物素一、生物素理化性质一、生物素理化性质 生物素（biotin，B）为含硫水溶性维生素，又称维生素H或辅酶R；动植物组织中广泛分布，卵黄（型）和肝（型）含量高，亦可人工合成。分子式：C10H16O3N2S；MW：244.31 Da。其羧基修饰后成为活化生物素，既能与抗原、抗体大分子生物活性物质结合，又能与各种示踪物（如酶、荧光素等）结合。一、生物素理化性质一、生物素理化性质 咪唑酮环咪唑酮环咪唑酮环咪唑酮环 噻吩环噻吩环
4、噻吩环噻吩环 羧基羧基环为咪唑酮环，与亲合素亲合素结合部位；环为噻吩环，C2上戊酸侧链戊酸侧链的未端羧基羧基是结合生物大分子的唯一结构。生物素侧链末端羧基羧基经化学修饰后制成带各种活性活性基团基团的衍生物活化生物素。二、活化生物素二、活化生物素活化生物素易与抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记生物素化标记物物。标记蛋白质标记蛋白质标记蛋白质标记蛋白质氨基氨基的活化生物素的活化生物素的活化生物素的活化生物素 标记蛋白质标记蛋白质标记蛋白质标记蛋白质醛基醛基的活化生物素的活化生物素的活化生物素的活化生物素 标记蛋白质标记蛋白质标记蛋白质标记蛋白质巯基巯基的活化生物素的活化生物素的
5、活化生物素的活化生物素 标记标记标记标记核酸核酸的活化生物素的活化生物素的活化生物素的活化生物素 二、活化生物素CNHNHCHCH2CHCHOS(CH2)4COOHNH2COCH2CH2CONHOHCOONCOOCCH2CH2EDC生物素生物素N-羟基羟基丁二酰胺丁二酰胺碳二亚胺碳二亚胺生物素生物素N-羟基丁二羟基丁二酰亚胺酯酰亚胺酯（BNHS）1.标记蛋白质氨基氨基的活化生物素BNHS分子可与蛋白质赖氨酸的氨基形成肽键。BNHS适用标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质。生物素分子量小与大分子抗体或酶结合后会产生空间位阻效应空间位阻效应，对生物素与亲合素的结合以及BAS的应用效果造成干扰。如何减小空
6、间位阻如何减小空间位阻长臂活化生物素（BCNHS）：在生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加两个两个6-6-氨基已糖分子基团氨基已糖分子基团，形成连结臂，增加生物素与大分子间的距离，减少位阻效应，更好发挥生物素的活性作用。标记蛋白质氨基与醛基的活化生物素醛基醛基醛基醛基氨基氨基氨基氨基长臂长臂长臂长臂2个个6-氨基已糖氨基已糖分子分子2.标记蛋白质醛基醛基的活化生物素生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物用于标记偏酸性糖蛋白。肼化生物胞素(BCHZ)：生物素与赖氨酸氨基连接后与无水肼反应而成BCHZ还可标记氨基。3.标记蛋白质巯基巯基的活化生物素马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)：能特异地
7、与蛋白质巯基结合的活化生物素。4.标记核酸核酸的活化生物素(1)光敏生物素(photobiotin)：侧链上连接的芳香基叠氮物基团，经光照后变为芳香基硝基苯，与腺嘌呤N-7位氨基结合，形成生物素化的核酸探针，用于DNA或RNA的标记。(2)生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）：作为TTP的结构类似物，可采用缺口移位法通过DNase和DNA聚合酶的作用而掺入到双链DNA中。(3)BNHS和BHZ：与核酸胞嘧啶分子中的N-4位氨基结合，形成生物素标记的核酸探针，但对碱基配对有影响。（不常用）1.活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；2.一个蛋白分子可被多个生物素标记-多价；3.可标记生物活性大分子
8、，如抗原、抗体。BNHS多标记抗体，BHZ则多标记偏酸性抗原，标记后标记后抗原、抗体活性不变抗原、抗体活性不变；4.可对示踪物标记，碱性磷酸酶标记后活性将活性将降低降低。生物素标记蛋白质特点生物素标记蛋白质特点 讲授内容讲授内容讲授内容讲授内容第二节第二节 亲合素和链霉亲合素的特性亲合素和链霉亲合素的特性一、亲合素二、链霉亲合素亲合素(avidin,A/AV)和链霉亲合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特异性结合物。（实际应用中多用链霉亲合素）二者均为大分子蛋白，目前所有用于标记的物质均可与亲合素（AV）或链酶亲合素（SA）结合。能与生物活性分子抗原、抗体结合，也能与示踪物结合
9、。多与酶、荧光素及胶体金偶联。结构结构结构结构 四亚基糖蛋白四亚基糖蛋白四亚基糖蛋白四亚基糖蛋白 四肽链蛋白四肽链蛋白四肽链蛋白四肽链蛋白 无糖基无糖基无糖基无糖基分子量分子量分子量分子量 68 kD 65 kD68 kD 65 kDpIpI 10.5 6 10.5 6结合位结合位结合位结合位 色氨酸色氨酸色氨酸色氨酸 色氨酸色氨酸色氨酸色氨酸生物素生物素生物素生物素 4 44 4KaKa 10 1015 15 10 101515活性活性活性活性U U 13 1315 1515 151818亲合素亲合素(AV)链霉亲合素链霉亲合素(SA)SA的pI低，表面所带正电荷少，且不含糖基，非特异性结合
10、远低于AV，目前以SA标记的酶结合物更为常用。AV/SA耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，与生物素结合后稳定性更好，每个亲和素能结合四个分子的生物素。亲合素亲合素亲合素亲合素(A Avidin,AV)vidin,AV)生物素生物素生物素生物素（Biotin,BBiotin,B）BAS-WB WB四、适用性广四、适用性广一、特异性强一、特异性强二、敏感性高二、敏感性高三、稳定性好三、稳定性好 五、其他五、其他两者间亲和力、专一性极高，试剂能高倍稀释，非特异性反应低。AV/SA能4价桥联生物素；一个Ab和酶分子可连接多个B，多级放大效应。两者结合呈不可逆反应；不受酸碱、变性剂、蛋白酶等影响，稳定性极
11、好。可与多种标记技术结合，广泛应用于临床和科研检测各种生物学反应体系。可制成通用性制剂；效价高用量少，成本低；有效期长；反应时间短等。第三节第三节第三节第三节 生物素与亲合素结合反应的特点生物素与亲合素结合反应的特点生物素与亲合素结合反应的特点生物素与亲合素结合反应的特点 讲授内容讲授内容讲授内容讲授内容第四节第四节 BAS在免疫检测技术中的应用在免疫检测技术中的应用一、固相载体的包被二、检测系统的信号放大生物素与亲合素之间的结合亲合力高、特异性强；两者各自均可与各型大小分子结合，且二者的结合反应具有多级放大作用；已广泛应用于各种标记免疫分析技术，BAS在免疫标记技术中既可用于检测系统的信号放
12、大，又可用于固相载体的包被。一、固相载体包被固相吸附分离是非均相免疫分析重要的分离方法。引入生物素-亲合素（链霉亲合素）系统连接于固相载体表面，再与欲包被的抗原或抗体结合，实现间接包被，可极大地提高非均相免疫分析的敏感性。包被方法有：（一）生物素-链霉亲合素-生物素化抗体(Ag)包被法（二）链霉亲合素-生物素化抗体（或Ag）包被法1.生物素-链霉亲合素-生物素化抗体(或Ag)包被法纳米纳米微球微球 生物素化牛血清生物素化牛血清白蛋白白蛋白(BSA)通过通过通过通过B-BASB-BAS将抗体间将抗体间将抗体间将抗体间接包被在固相载体上接包被在固相载体上接包被在固相载体上接包被在固相载体上亲合素亲
13、合素生物素化抗体生物素化抗体生物素化生物素化-BSA致敏微球致敏微球2.链霉亲合素-生物素化抗体（或抗原）包被法 加生物素化抗体加生物素化抗体纳米纳米微球微球 亲合素亲合素生物素生物素 通过通过通过通过BASBAS间接将抗体间接将抗体间接将抗体间接将抗体包被在固相载体上包被在固相载体上包被在固相载体上包被在固相载体上链霉亲合素-生物素化抗体包被法(BA包被法)比生物素-链霉亲合素-生物素化抗体包被法(B-BAB包被法)简便、高效、省时省材；BAS连接固相载体的包被模式，可增加抗体(或Ag)包被数量，减少空间位阻效应，提高检测的灵敏度和准确度；链霉亲合素预包被磁性纳米微球可作为通用试剂，用于反应
14、体系成分的分离、纯化及不同项目的检测，如发光免疫分析。二、检测系统的信号放大生物素-亲合素系统用于检测系统的信号放大，基本模式有两种：（一）生物素-亲合素-生物素模式：BAB和ABC法（二）生物素-亲合素(biotin-avidin,BA)或标记亲合素-生物素(labeled avidin-biotin,LAB)模式。将生物素标记在第一抗体上称为直接法，将生物素标记在第二抗体上称为间接法。方方 法法 反应体系反应体系 直接法直接法 BABAg-(Ab-B)-A-B-E ABCAg-(Ab-B)-ABC(A-B-E)BA/LABAg-(Ab-B)-A-E 间接法间接法 BABAg-Ab1-(Ab
15、2-B)-A-B-E ABCAg-Ab1-(Ab2-B)-ABC BA/LAB Ag-Ab1-(Ab2-B)-A-E（一）生物素-亲合素-生物素模式1.BAB法以游离亲合素（或链霉亲合素）为桥，分别连接生物素化抗体生物素化抗体和生物素化酶生物素化酶，从而将抗原-抗体待检系统和酶促反应的信号检测系统有机联系在一起。EEEEEEEEEAgAbAg-Ab生物素生物素生物素化抗体生物素化抗体双抗夹心双抗夹心游离游离AV/SA生物素化酶生物素化酶生物素化生物素化Ab-游离游离AV/SA-生物素化酶生物素化酶酶酶生物素化酶生物素化酶生物素生物素化抗体化抗体AV/SA1.BAB法直接法直接法1.BAB法直接
16、法直接法生物素化生物素化生物素化生物素化 AbAbAgAgAV/SA生物素化酶生物素化酶生物素化酶生物素化酶ABC2.ABC法BAB改良法，将亲和素(A或SA)先与生物素化酶(B-E)结合，制成亲和素-生物素-过氧化酶复合物(avidin-biotin-peroxidase complex，ABC)。EEEEEEB-Ab双抗夹心法双抗夹心法直接法直接法（一）生物素（一）生物素-亲合素亲合素-生物素模式生物素模式2.ABC法 直接法直接法Ab生物素化生物素化生物素化生物素化 AbAb生物素化酶生物素化酶生物素化酶生物素化酶 SA SA SAABC(SA-B-E)生物素化抗体生物素化抗体一个酶分子
17、可结一个酶分子可结合多个合多个B，B又可又可结合多个结合多个AV/SA。（二）生物素-亲合素模式BA法或LAB（标记亲和素-生物素）法亲合素（或SA）直接标记酶或荧光素等示踪物，生物素直接标记抗体（或抗原）。以标记亲和素代替BAB法中的游离亲和素(A)，省却了加生物素化酶（B-E）的步骤。BA 或或LAB法法直接法直接法直接法直接法酶直接标记酶直接标记AV/SAB-AbAgEEEB-AbEEEBAB法与BA法比较BAB法：以游离亲和素为桥，分别连接生物素化抗体和生物素化酶。BA法：以酶标AV/SA代替BAB法中的游离亲和素，省却了加生物素化酶的步骤。EEEEEE生物素化酶生物素化酶游离游离AV
18、/SA生物素化生物素化AbEEEEEE酶标酶标-AV/SA生物素化生物素化Ab BSA在酶免疫测定中的应用BSA在荧光免疫技术中的应用BSA在放射免疫测定中的应用BAS在化学发光免疫分析中的应用BAS在胶体金免疫技术中的应用BSA在分子生物学中的应用BAS在其它方面的应用：分子和细胞的分离与纯化、肿瘤诊断与治疗、增强杂交细胞融合率等小小 结结生物素为B族水溶性维生素，环咪唑酮环是与AV/SA结合部位，环噻吩环戊酸侧链末端羧基可结合生 物大分子。经化学修饰后带活性基团成为活化生物素。AV或SA是生物素天然特异性结合物，均为大分子蛋白，由四个相同亚基构成，可结合4个生物素分子。生物素与AV/SA结
19、合具有亲合力高、特异性强、敏感性高、稳定性好等特点，使BAS适应性广、实用性强。生物素和AV/SA均可与各种标记分子结合如Ab、酶。1个AV/SA 可与4个生物素化物结合及一个生物大分子可与多个生物素分子结合，使BAS具有多级放大效应，可极大地提高分析测定的灵敏度。小小 结结BAS应用于检测系统的信号放大有两种基本模式：一种是生物素-亲合素-生物素模式(包括BAB和ABC法）；另一种是生物素-亲合素(又称BA或LAB法）。BAB法是以游离AV（或SA）为桥，分别连接生物素化抗体和生物素化酶。将Ag-Ab反应与示踪系统连在一起。ABC法是BAB改良法。预先制成可溶性的AV(或SA)-生物素-过氧
20、化酶复合物(ABC)，再与生物素化抗体结合。BA或LAB法是将示踪物如酶直接标记在AV或SA上，将生物素分子直接标记抗原或抗体。BAS可应用于固相载体的包被及生物分子分离与纯化。思思 考考 题题1.生物素的分子结构特点是什么？2.如何制备活化生物素？3.AV或SA 的分子结构及理化性质有何特点？4.生物素与亲合素结合反应的特点有哪些？5.生物素-亲合素系统放大作用的原理是什么？6.BAS用于检测系统信号放大的基本模式有几种？各有何特点？7.如何利用BAS进行抗原或抗体的固相载体包被？8.何为ABC-ELISA法？技术优势体现在哪些方面？1.在生物素分子中，可连接生物素大分子（抗原或抗体）的部位
21、是（）A.戊酸侧链 B.咪唑酮环 C.噻吩环 D 苯环 E 末端羧基2.1个亲和素分子能结合生物素分子的数目是（）A.2 B 4 C 6 D 8 E 123.ABC模式的原始模式为()A.BAB模式 B.直接模式 C LAB 模式 D.间接模式 E BA模式4.在LAB体系中，需将示踪物质标记在（）A.抗体分子 B.抗原分子 C.生物素 D.亲和素 E 第二抗体5.在ABC-ELISA(双抗体夹心）体系中，需将生物素标记在（）A.抗体分子 B.抗原分子 C.酶蛋白 D.亲和素 E.固相抗体6.关于生物素分子的特性，叙述不正确的是（）A.生物素为双环结构 B.咪唑酮环是结合亲和素的部位C.含有戊酸侧链并可进行修饰 D.有、两型，生物功能相同E.生物素是一种能与亲和素结合的小分子蛋白质7.下列选项中，不属于生物素-亲和素相互作用特点的是（）A.呈可逆性结合反应 B.呈高度专一性反应 C.具有极高亲和常数 D.具有多级放大效应 E.抗酸、碱干扰能力强