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1、章章6：微生物遗传与变异：微生物遗传与变异n n遗传遗传heredity亲代将其特有的生物学特亲代将其特有的生物学特性传递给子代。性传递给子代。n n遗传性遗传性子代总保持与亲代相同的生物子代总保持与亲代相同的生物学特性。学特性。n n遗传型遗传型genotype生物体所具有的全套生物体所具有的全套遗传物质总称。又称基因型。遗传物质总称。又称基因型。n n表型表型表型表型phenotypephenotype特定环境中生物体表现出的种种形态特定环境中生物体表现出的种种形态特定环境中生物体表现出的种种形态特定环境中生物体表现出的种种形态与生理特征。与生理特征。与生理特征。与生理特征。*代谢、发育代
2、谢、发育 遗传型遗传型 +环境条件环境条件 -表型表型n n变异变异变异变异variationvariation遗传型的改变。遗传型的改变。遗传型的改变。遗传型的改变。指生物体在某种外因或指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变。内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变。变异频率一般为变异频率一般为1010-5-51010-10-10、变化后新性状稳定、可遗、变化后新性状稳定、可遗传。传。n n适应或饰变适应或饰变适应或饰变适应或饰变modificationmodification表型的改变。表型的改变。表型的改变。表型的改变。指不涉及遗传指不涉及遗传物质结构而只发
3、生在转录、翻译水平上的表型变化。物质结构而只发生在转录、翻译水平上的表型变化。它是不遗传的。它是不遗传的。n n基因基因基因基因指带有足以决定一个蛋白质全部组成所需信息指带有足以决定一个蛋白质全部组成所需信息指带有足以决定一个蛋白质全部组成所需信息指带有足以决定一个蛋白质全部组成所需信息的最短的最短的最短的最短DNADNA片段。片段。片段。片段。n n菌株菌株菌株菌株&克隆克隆克隆克隆指一组遗传型相同的细胞群。指一组遗传型相同的细胞群。指一组遗传型相同的细胞群。指一组遗传型相同的细胞群。n n微生物在遗传上特点：n n1、微生物细胞结构简单，营养体一般为、微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体
4、，方便建立纯系。单倍体，方便建立纯系。n n2、很多常见微生物都易于人工培养，快、很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖速、大量生长繁殖。n n3、对环境因素的作用敏感，易于获得各、对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。大多是无性生殖，类突变株，操作性强。大多是无性生殖，变异易保留。变异易保留。微生物的变异性和遗传性的特点微生物的变异性和遗传性的特点 1、大多数微生物为单细胞构造简单，通常为单倍体，而且直接接触外界环境，任何条件的变化，都可影响微生物，从而降低了遗传的保守性。2、繁殖速度快，可在短时间重复多次，即使变异的频率十分低，也可在短时间内产生大量的变异后代。3、
5、常见的变异形式是基因突变,它可以涉及到任何性状:形态构造、代谢途径、生理类型等。4、大多数M为无性繁殖,一旦发生变异很容易在性状上表现和保留出来,有利于筛选好的特性。生物生物基因数基因数基组大小基组大小(bp)MS2噬菌体(MS2 Phage)33103 噬菌体(Phage)505104T40噬菌体(T4 Phage)1502105 生殖道枝原体(Mycoplasma genitalium)4730.58106詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)*16821.66106幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)1.66106 流感嗜血菌(Hacmophil
6、us influenzae)17601.83106枯草杆菌(Bacillus subtilis)37004.2106大肠杆菌(Escherichia coli)41004.7106黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)80009.4106啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)580013.5106脉孢菌属(Neurospora)500060106果蝇(Drosophila melanogaster)12000165106Nicotiana tobacum(一种烟草)430004500106拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)1600033000
7、70-145106人(human)30109细菌的基因组细菌的基因组n n大肠杆菌基因组为双链环状的大肠杆菌基因组为双链环状的DNADNA分子分子*，其基因组结构，其基因组结构特点如下：特点如下：n n 1.1.遗传信息的连续性遗传信息的连续性遗传信息的连续性遗传信息的连续性n n大肠杆菌和其它原核生物中基因大肠杆菌和其它原核生物中基因 组组DNA DNA 绝大部分用来编绝大部分用来编码蛋白质、码蛋白质、RNARNA；用作为复制起点、启动子、终止子和一；用作为复制起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别些由调节蛋白识别 和结合的位点等信号序列。和结合的位点等信号序列。n n n n 2.2.功
8、能相关的结构基因组成操纵子结构功能相关的结构基因组成操纵子结构功能相关的结构基因组成操纵子结构功能相关的结构基因组成操纵子结构n n 大肠杆菌总共有大肠杆菌总共有25842584个操纵子，基因组测序推测出个操纵子，基因组测序推测出21922192个个操纵子。其中操纵子。其中73%73%只含一个基因，只含一个基因，16.6%16.6%含有含有2 2个基因，个基因，4.6%4.6%含有含有3 3个基因，个基因，6%6%含有含有4 4个或个或4 4个以上的基因。大肠杆个以上的基因。大肠杆菌有如此多的操纵子结构，可能与原核基因表达多采用转菌有如此多的操纵子结构，可能与原核基因表达多采用转录调控有关，因
9、为组成操纵子有其方便的一面。录调控有关，因为组成操纵子有其方便的一面。此外有些功能相关的此外有些功能相关的RNARNA基因也串联在一起，如构成核基因也串联在一起，如构成核糖核蛋白体的三种糖核蛋白体的三种RNARNA基因转录在同一个转录产物中，它基因转录在同一个转录产物中，它们依次是们依次是16SrRNA16SrRNA、23SrRNA23SrRNA和和5SrRNA5SrRNA。乳糖操纵子学说乳糖操纵子学说(原核基因的表达调控原核基因的表达调控)3.3.结构基因的单拷贝及结构基因的单拷贝及结构基因的单拷贝及结构基因的单拷贝及rRNArRNA基因的多拷贝基因的多拷贝基因的多拷贝基因的多拷贝在大多数情
10、况下结构基因在基因组中是单拷贝的，但是编码在大多数情况下结构基因在基因组中是单拷贝的，但是编码在大多数情况下结构基因在基因组中是单拷贝的，但是编码在大多数情况下结构基因在基因组中是单拷贝的，但是编码rRNArRNA的基因的基因的基因的基因rrnrrn往往是多往往是多往往是多往往是多拷贝的，大肠杆菌有拷贝的，大肠杆菌有拷贝的，大肠杆菌有拷贝的，大肠杆菌有7 7个个个个rRNArRNA操纵子，其特征都与基因组的复制方向有关，即按复制方操纵子，其特征都与基因组的复制方向有关，即按复制方操纵子，其特征都与基因组的复制方向有关，即按复制方操纵子，其特征都与基因组的复制方向有关，即按复制方向表达。向表达。
11、向表达。向表达。7 7个个个个rrnrrn操纵子中就有操纵子中就有操纵子中就有操纵子中就有6 6个分布在大肠杆菌个分布在大肠杆菌个分布在大肠杆菌个分布在大肠杆菌DNADNA的双向复制起点的双向复制起点的双向复制起点的双向复制起点oric(83oric(83分钟处分钟处分钟处分钟处)附近，而不是在复制终点附近，而不是在复制终点附近，而不是在复制终点附近，而不是在复制终点(33(33分钟分钟分钟分钟)附近，可以设想，在一个细胞周期中，复制起点处的附近，可以设想，在一个细胞周期中，复制起点处的附近，可以设想，在一个细胞周期中，复制起点处的附近，可以设想，在一个细胞周期中，复制起点处的基因的表达量几乎
12、相当于处于复制终点的同样基因基因的表达量几乎相当于处于复制终点的同样基因基因的表达量几乎相当于处于复制终点的同样基因基因的表达量几乎相当于处于复制终点的同样基因 的两倍，有利于核糖体的快速组装，的两倍，有利于核糖体的快速组装，的两倍，有利于核糖体的快速组装，的两倍，有利于核糖体的快速组装，便于在急需蛋白质合成时，细胞可以在短时间内有大量核糖体生成。大肠杆菌及其它原便于在急需蛋白质合成时，细胞可以在短时间内有大量核糖体生成。大肠杆菌及其它原便于在急需蛋白质合成时，细胞可以在短时间内有大量核糖体生成。大肠杆菌及其它原便于在急需蛋白质合成时，细胞可以在短时间内有大量核糖体生成。大肠杆菌及其它原核生物
13、核生物核生物核生物(如枯草杆菌的如枯草杆菌的如枯草杆菌的如枯草杆菌的rrnrrn有有有有1010个拷贝个拷贝个拷贝个拷贝)rrnrrn多拷贝及结构基因的单拷贝，也反映了它们基多拷贝及结构基因的单拷贝，也反映了它们基多拷贝及结构基因的单拷贝，也反映了它们基多拷贝及结构基因的单拷贝，也反映了它们基因组经济而有效的结构。因组经济而有效的结构。因组经济而有效的结构。因组经济而有效的结构。4.4.基因组的重复序列少而短基因组的重复序列少而短基因组的重复序列少而短基因组的重复序列少而短原核生物基因组存在一定数量的重复序列，但比真核生物少得多，而且重复的序列比原核生物基因组存在一定数量的重复序列，但比真核生
14、物少得多，而且重复的序列比原核生物基因组存在一定数量的重复序列，但比真核生物少得多，而且重复的序列比原核生物基因组存在一定数量的重复序列，但比真核生物少得多，而且重复的序列比较短，一般为较短，一般为较短，一般为较短，一般为4 44040个碱基，重复的程度有的是十多次，有的可达上千次个碱基，重复的程度有的是十多次，有的可达上千次个碱基，重复的程度有的是十多次，有的可达上千次个碱基，重复的程度有的是十多次，有的可达上千次*。*典型的原核生物染色体是环状典型的原核生物染色体是环状典型的原核生物染色体是环状典型的原核生物染色体是环状DNADNA分子分子分子分子，但发现布氏疏螺旋体，但发现布氏疏螺旋体，
15、但发现布氏疏螺旋体，但发现布氏疏螺旋体(BorreliaBorrelia burgdorferiburgdorferi)的染色体是线状的。的染色体是线状的。的染色体是线状的。的染色体是线状的。*流感嗜血菌基因组上有流感嗜血菌基因组上有流感嗜血菌基因组上有流感嗜血菌基因组上有14651465个个个个“摄取位点摄取位点摄取位点摄取位点”的重复，其重复序列为的重复，其重复序列为的重复，其重复序列为的重复，其重复序列为5AAGTGCGGTCA5AAGTGCGGTCA33。酵母的基因组酵母的基因组n n 啤酒酵母是是第一个完成测序的真核生物基因组。该基因大小为啤酒酵母是是第一个完成测序的真核生物基因组。
16、该基因大小为啤酒酵母是是第一个完成测序的真核生物基因组。该基因大小为啤酒酵母是是第一个完成测序的真核生物基因组。该基因大小为13.5106bp13.5106bp，分布在，分布在，分布在，分布在1616个不连续的染色体中。染色体个不连续的染色体中。染色体个不连续的染色体中。染色体个不连续的染色体中。染色体DNADNA上上上上没有明显没有明显没有明显没有明显的操纵子结构的操纵子结构的操纵子结构的操纵子结构，有间隔区或内含子序列有间隔区或内含子序列有间隔区或内含子序列有间隔区或内含子序列。酵母菌基因组最显著的特点。酵母菌基因组最显著的特点。酵母菌基因组最显著的特点。酵母菌基因组最显著的特点是高度重复
17、，是高度重复，是高度重复，是高度重复，tRNAtRNA基因在每个染色体上至少是基因在每个染色体上至少是基因在每个染色体上至少是基因在每个染色体上至少是4 4个，多则个，多则个，多则个，多则3030多个，总多个，总多个，总多个，总共约有共约有共约有共约有250250个拷贝个拷贝个拷贝个拷贝(大肠大肠大肠大肠 杆菌约杆菌约杆菌约杆菌约6060个拷贝个拷贝个拷贝个拷贝)。rRNArRNA基因只位于基因只位于基因只位于基因只位于号号号号染色体的近端粒处，每个长染色体的近端粒处，每个长染色体的近端粒处，每个长染色体的近端粒处，每个长9137bp9137bp，有，有，有，有100100200200个拷贝。
18、酵母基因组个拷贝。酵母基因组个拷贝。酵母基因组个拷贝。酵母基因组全序列测定完成后，在其基因组上还发现了许多较高同源性的全序列测定完成后，在其基因组上还发现了许多较高同源性的全序列测定完成后，在其基因组上还发现了许多较高同源性的全序列测定完成后，在其基因组上还发现了许多较高同源性的DNADNA重重重重复序复序复序复序 列列列列，并称之为遗传丰余，并称之为遗传丰余，并称之为遗传丰余，并称之为遗传丰余(genetic redundancy)(genetic redundancy)。酵母基因组的高。酵母基因组的高。酵母基因组的高。酵母基因组的高度重复或遗传丰余是进化的策略，所有现存的生物在自然的不断选
19、择度重复或遗传丰余是进化的策略，所有现存的生物在自然的不断选择度重复或遗传丰余是进化的策略，所有现存的生物在自然的不断选择度重复或遗传丰余是进化的策略，所有现存的生物在自然的不断选择下下下下 ，总是以合适的结构特征来完成其生命过程。也许是在份数这么多，总是以合适的结构特征来完成其生命过程。也许是在份数这么多，总是以合适的结构特征来完成其生命过程。也许是在份数这么多，总是以合适的结构特征来完成其生命过程。也许是在份数这么多的丰余基因中，如果有少数基因突变而失去功能的话，可不影响生命的丰余基因中，如果有少数基因突变而失去功能的话，可不影响生命的丰余基因中，如果有少数基因突变而失去功能的话，可不影响
20、生命的丰余基因中，如果有少数基因突变而失去功能的话，可不影响生命的生存；也许是为了适应复杂多变的环境，多余的基因可使生物体能的生存；也许是为了适应复杂多变的环境，多余的基因可使生物体能的生存；也许是为了适应复杂多变的环境，多余的基因可使生物体能的生存；也许是为了适应复杂多变的环境，多余的基因可使生物体能够在不同的环境中分别使用多个功能相同或者相似的基因产物，做到够在不同的环境中分别使用多个功能相同或者相似的基因产物，做到够在不同的环境中分别使用多个功能相同或者相似的基因产物，做到够在不同的环境中分别使用多个功能相同或者相似的基因产物，做到有备无患。因此从这个意义上讲酵母确实比细菌和病毒有备无患
21、。因此从这个意义上讲酵母确实比细菌和病毒有备无患。因此从这个意义上讲酵母确实比细菌和病毒有备无患。因此从这个意义上讲酵母确实比细菌和病毒“进步进步进步进步”且且且且“富有富有富有富有”，而细菌和病毒，而细菌和病毒，而细菌和病毒，而细菌和病毒(许多病毒基因组上的基因是重叠的许多病毒基因组上的基因是重叠的许多病毒基因组上的基因是重叠的许多病毒基因组上的基因是重叠的)似乎更似乎更似乎更似乎更“聪明聪明聪明聪明”，知道如何尽量经济和有效地利用其有限的遗传资源。，知道如何尽量经济和有效地利用其有限的遗传资源。，知道如何尽量经济和有效地利用其有限的遗传资源。，知道如何尽量经济和有效地利用其有限的遗传资源。
22、啤酒酵母的染色体染色体染色体长度长度(kbp)基因数基因数tRNA基因数基因数2301064813423133151721015328142757729213270136101091573335632911143923110 74538724666334161078550229244872178442115109257120 94849917 注：号染色体长度只包括了二个拷贝rDNA，实际上有100-200个，长1-2106bp。染色体外遗传物质染色体外遗传物质质粒质粒1 1、定义、定义：凡游离于原核生物核基因组之外，具有独立复制：凡游离于原核生物核基因组之外，具有独立复制能力的小型双链能力的
23、小型双链DNADNA分子，称为分子，称为质粒质粒质粒质粒（plasmidplasmid）2 2、特点、特点：具有超螺旋结构，大小具有超螺旋结构，大小1.5-300kb1.5-300kb，分子量，分子量106-108106-108，相，相当于当于1%1%核基因组大小。核基因组大小。质粒也能进行复制、遗传，含有核基因组没有的少量基质粒也能进行复制、遗传，含有核基因组没有的少量基因。因。质粒虽含有少量基因，但不象染色体那样重要。因为丧质粒虽含有少量基因，但不象染色体那样重要。因为丧失了质粒，生物体并不死亡，只是丧失由它们所决定的某失了质粒，生物体并不死亡，只是丧失由它们所决定的某些性状。些性状。质粒
24、的种类很多，有致育质粒的种类很多，有致育F F因子、抗药性因子、抗药性R R因子、大肠杆因子、大肠杆菌毒素菌毒素ColCol因子、诱癌因子、诱癌TiTi因子、因子、假单胞菌的假单胞菌的“降解降解”质粒质粒等。等。plasmidplasmid2节：基因突变节：基因突变（一）基因突变的概念（一）基因突变的概念（一）基因突变的概念（一）基因突变的概念 基因突变基因突变 ：简称突变，是指细胞内（或病毒粒子简称突变，是指细胞内（或病毒粒子内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的的变化变化。从自然界分离的菌株称从自然界分离的菌株称野生型野生型，突变后的菌株
25、称，突变后的菌株称突变型突变型（株）（株）狭义：基因突变（点突变）：只涉及狭义：基因突变（点突变）：只涉及DNADNA分子一对碱基分子一对碱基或少数几对碱基的变化。或少数几对碱基的变化。广义：包括染色体畸变和基因突变广义：包括染色体畸变和基因突变。染色体畸变染色体畸变:某些因素使某些因素使DNADNA发生大的损伤，使染色体发生大的损伤，使染色体产生畸变，结构上出现缺失产生畸变，结构上出现缺失 、重复、重复 、倒位和易位的现象，、倒位和易位的现象，数目上有所增减。数目上有所增减。基因突变的特点1.1.自发性：自发性：自发性：自发性：可自发地发生突变。可自发地发生突变。可自发地发生突变。可自发地发
26、生突变。2.2.不对应性：不对应性：不对应性：不对应性：突变性状与引起的原因间无直接对应关系。突变性状与引起的原因间无直接对应关系。突变性状与引起的原因间无直接对应关系。突变性状与引起的原因间无直接对应关系。3.3.稀有性：稀有性：稀有性：稀有性：通常自发突变的频率在通常自发突变的频率在通常自发突变的频率在通常自发突变的频率在1010-6-6 10 10-9-9间。间。间。间。4.4.独立性：独立性：独立性：独立性：某基因的突变率不受他种基因突变率的影响。某基因的突变率不受他种基因突变率的影响。某基因的突变率不受他种基因突变率的影响。某基因的突变率不受他种基因突变率的影响。5.5.可诱变性：可
27、诱变性：可诱变性：可诱变性：自发突变的频率可因诱变剂的影响而大为提自发突变的频率可因诱变剂的影响而大为提自发突变的频率可因诱变剂的影响而大为提自发突变的频率可因诱变剂的影响而大为提高（高（高（高（10 1010 105 5倍）。倍）。倍）。倍）。6.6.稳定性：稳定性：稳定性：稳定性：基因突变后的新遗传性状是稳定的。基因突变后的新遗传性状是稳定的。基因突变后的新遗传性状是稳定的。基因突变后的新遗传性状是稳定的。7.7.可逆性：可逆性：可逆性：可逆性：野生型某一性状可发生正向突变，也可发生相野生型某一性状可发生正向突变，也可发生相野生型某一性状可发生正向突变，也可发生相野生型某一性状可发生正向突
28、变，也可发生相反的回复突变。反的回复突变。反的回复突变。反的回复突变。1.碱基变化与遗传信息的改变碱基变化与遗传信息的改变 不同的碱基变化对遗传信息的改变是不同的，可分为四种类型 基因突变的机制基因突变的机制n n1 1）自发突变）自发突变n n不经诱变剂处理而自然发生的突变称自发突变不经诱变剂处理而自然发生的突变称自发突变 n n引起自发突变的原因很多，包括引起自发突变的原因很多，包括DNADNA复制过程中，由复制过程中，由DNADNA聚合酶产生的错误，聚合酶产生的错误，DNADNA的物理损伤，重组和转座的物理损伤，重组和转座等。但是这些错误和损伤将会被细胞内大量的修复系统修等。但是这些错误
29、和损伤将会被细胞内大量的修复系统修复，使突变率降到最低限度。自然突变的一个最主要的原复，使突变率降到最低限度。自然突变的一个最主要的原因是碱基能以称之为互变异构体因是碱基能以称之为互变异构体(taumertaumer)的不同形式存在，的不同形式存在，互变异构体能够形成不同的碱基配对，因此在互变异构体能够形成不同的碱基配对，因此在DNADNA复制时，复制时，当腺嘌呤以正常的氨基形式出现时，便与胸腺嘌呤进行正当腺嘌呤以正常的氨基形式出现时，便与胸腺嘌呤进行正确配对确配对(A-T)(A-T)；如果以亚氨基；如果以亚氨基(iminoimino)形式形式(互变异构互变异构)出现出现时，则与胞嘧啶配对，这
30、意味着时，则与胞嘧啶配对，这意味着C C代替代替T T插入到插入到DNADNA分子分子中，如果在下一轮复制之前未被修复，那么中，如果在下一轮复制之前未被修复，那么DNADNA分子中的分子中的A-TA-T碱基对就变成了碱基对就变成了G-C G-C 突变机制突变机制n n自发突变的频率是很低的，一般为自发突变的频率是很低的，一般为1010-6-6-10-10-10-10。许多化学、物理和生物因子能够提高其突变频许多化学、物理和生物因子能够提高其突变频率，将这些能使突变率提高到自发突变水平以率，将这些能使突变率提高到自发突变水平以上的物理、化学和生物因子称为诱变剂上的物理、化学和生物因子称为诱变剂(
31、mutagen)(mutagen)。所谓诱发突变并非是用诱变剂产。所谓诱发突变并非是用诱变剂产生新的突变，而是通过不同的方式提高突变率。生新的突变，而是通过不同的方式提高突变率。常用的诱变剂有：常用的诱变剂有：n n (1)(1)碱基类似物碱基类似物(Base analog)(Base analog)n n例如：例如：5-5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶(胸腺嘧啶结构类似物胸腺嘧啶结构类似物)和和2-2-氨基嘌呤氨基嘌呤(腺嘌呤结构类似物腺嘌呤结构类似物)，在，在DNADNA复制过复制过程中能够整合进程中能够整合进DNADNA分子，但由于它们比正常分子，但由于它们比正常碱基产生异构体的频率高，因此出现碱基
32、错配碱基产生异构体的频率高，因此出现碱基错配的机率也高，从而提高突变频率。的机率也高，从而提高突变频率。(2)插入染料(intercalating dye)这是一类扁平的具有三个苯环结构的化合物，在分子形态上类似于碱基对的扁平分子。所以它们是通过插入DNA分子的碱基对之间，使其分开，从而导致DNA在复制过程中的滑动，这种滑动增加了一小段DNA插入和缺失的机率，导致突变率的增加，常引起移码突变。溴化乙锭和吖啶橙是这类诱变剂的代表。(3)直接与DNA碱基起化学反应的诱变剂 最常见的有亚硝酸、羟胺和烷化剂。亚硝酸能引起含NH2基的碱基(A.G.C)产生氧化脱氨反应，使氨基变为酮基，从而改变配对性质造
33、成碱基置换突变。羟胺(NH2OH)几乎只和胞嘧啶发生反应，因此只引起GCAT的转换。甲磺酸乙酯(EMS)和亚硝基胍(NTG)都属于烷基化试剂，其烷基化位点主要在鸟嘌呤的N-7位和腺嘌呤N-3位上。但这两个碱基的其它位置以及其它碱基的许多位置也能被烷化，烷化后的碱基也像碱基结构类似物一样能引起碱基配对的错误。亚硝基胍是一种诱变作用特别强的诱变剂，因而有超诱变剂之称，它可以使一个群体中任何一个基因的突变率高达1%，而且能引起多位点突点，主要集中在复制叉附近，随复制叉的移动其作用位置也移动。此外，硫酸二乙酯(DES)、乙基磺酸乙酯(EES)以及二乙基亚硝酸胺(DEN)等也都是常用的诱变烷化剂。n n
34、4)4)辐射辐射n n紫外线紫外线(ultraviolet,(ultraviolet,简称简称UV)UV)是实验室中常用的是实验室中常用的非电离辐射诱变因子，其作用机制也了解得比较非电离辐射诱变因子，其作用机制也了解得比较清楚，由清楚，由UVUV引起的主要损伤是相邻碱基形成二聚引起的主要损伤是相邻碱基形成二聚体体(dimerdimer)，阻碍碱基的正常配对而导致碱基置换，阻碍碱基的正常配对而导致碱基置换突变。另方面当细胞用一种称之为突变。另方面当细胞用一种称之为SOSSOS的倾向错的倾向错误误()()的修复系统来修复损伤时，还会导致高频率的修复系统来修复损伤时，还会导致高频率的突变。的突变。x
35、-x-射线、射线、r-r-射线，快中子等属于电离辐射，射线，快中子等属于电离辐射，作用机理尚不十分清楚，与作用机理尚不十分清楚，与UVUV不同的是电离辐不同的是电离辐 射射可通过玻璃和其它物质，穿透力强，能达到生殖可通过玻璃和其它物质，穿透力强，能达到生殖细胞，因此常用于动物和植物的诱变育种。细胞，因此常用于动物和植物的诱变育种。n n5）热n n短时间的热处理也可诱发突变，据认为热的作用是使胞嘧啶脱氨基而成为尿嘧啶，从而导致GCAT的转换，另外，热也可以引起鸟嘌呤脱氧核糖键的移动，从而在DNA复制过程中出现包括二个鸟嘌呤的碱基配对，在再一次复制中这一对碱基错配就会造成GCCG颠换 n n(6
36、)生物诱变因子n n 转座因子也是实验室中常用的一种诱变因子，它们在基因组的任何部位插入，一旦插入某基因的编码序列，就引起该基因的失活而导致中断突变，而且由于转座因 子Tn、Mu带有可选择标记(抗生素抗性等)，因此可容易地分离到所需的突变基因。3节：突变与育种节：突变与育种n n一、自发突变与育种n n1、生产育种n n2、定向育种n n用某一特定环境长期处理某一微生物群体，同时不断地进行移种传代，以达到积累和选择合适的自发突变体的一种古老育种方法。n n近年发展代谢类似物的梯度培养皿法。二、诱变育种二、诱变育种n n利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后
37、设法采用简便、快速、高效的筛选方法，从中挑选少数符合目的的突变株，以供生产科研之用。n n主要步骤：主要步骤：1、出发菌株的选择、出发菌株的选择n n用作出发菌株有：野生型菌株；生产菌株；经过诱变的菌株。2、菌悬液制备、菌悬液制备n n一般采用单孢子或单细胞悬液。n n制备菌悬液时要注意生理状态、均一性、细胞浓度、菌悬液介质（生理盐水或缓冲液）。3、诱变处理、诱变处理n n1）常用诱变剂：n n物理诱变剂：紫外线（UV）、X射线、n n射线、快中子（0.2-10Mev）。n n化学诱变剂：硫酸二乙酯DES，甲基磺酸乙酯EMS，亚硝基胍NTG。n n2）诱变剂量：n n凡是在高诱变率基础上，既能
38、扩大变异幅度，又能使变异移向正变范围的剂量就是合适剂量。以致死率确定。n n3）处理方法：n n采用复合处理，包括诱变剂先后使用，同时使用和重复使用，提高效果。4、变异菌株的分离和筛选、变异菌株的分离和筛选n n诱变处理后一般要经过后培养和变异株筛选。n n一般将筛选分为初筛和复筛。n n初筛重点在于分离培养尽可能多菌株，采用预先设计的相同培养条件，以量为主，准确性其次，减少漏筛机会。n n复筛以质为主，反复多次。4节节:基因重组与杂交育种基因重组与杂交育种n n杂交hybridization：两个性状不同的菌株或变种之间进行细胞结合，遗传物质交换重新组合成新的性状。n n基因重组gene r
39、ecombination：两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合后，形成新遗传型个体的方式。一、原核微生物的基因重组一、原核微生物的基因重组n n（一）转化一）转化 transformationtransformationn n概念概念：受体菌直接吸收了来自供体菌的：受体菌直接吸收了来自供体菌的DNADNA片段，片段，通过交换，把它组合到自己的基因组中，从而获通过交换，把它组合到自己的基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的现象。得供体菌部分遗传性状的现象。n n转化后的受体菌，称转化后的受体菌，称转化子转化子transformanttransformantn n根据感受
40、态建立方式，可以分为自然遗传转化根据感受态建立方式，可以分为自然遗传转化(natural genetic transformation)(natural genetic transformation)和人工转化和人工转化(artificial transformation)(artificial transformation)，前者感受态的出现，前者感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性；后者则是通过是细胞一定生长阶段的生理特性；后者则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNADNA的能力，的能力，或人为地将或人为地将DNADNA导入细胞内。导入细胞内。自然转化
41、：细菌生长到一定的阶段分泌一种小分子的蛋白质，称为感受态因子，这种感受态因子又与细胞表面受体(图中的M)相互作用，诱导一些感受态一特异蛋白质表达，其中一种是自溶素(autolysin)，它的表达使细胞表面的DNA结合蛋白及核酸酶裸露出来，使其具有与DNA结合的活性。线型DNA分子的结合和进入细胞：DNA以双链形式在细胞表面的几个位点上结合并遭到酶的切割，核酸内切酶首先切断DNA双链中的一条链，被切断的链遭到核酸酶降解，成为寡核苷酸释放到培养基中，另一条链与感受态一特异蛋白质结合，以这种形式进入细胞，并通过 同源重组以置换的方式整合进受体染色体DNA，经复制和细胞分裂后形成重组体 n n人工转化
42、人工转化n n 这是在实验室中用多种不同的技术完成的转化，包括用CaCl2处理细胞，电穿孔等。为许多不具有自然转化能力的细菌(如大肠杆菌)提供了一条获取外源DNA的途径，也是基因工程的基础技术之一。（二）转导（二）转导transductionn n概念：通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象。n nU型管实验：n n两株营养缺陷型LA-22（色氨酸缺陷型，try-)，溶源性细菌（受体）；LA-2（组氨酸缺陷型，his-），敏感菌（供体）；温和性噬菌体P22。n n图示证实接合过程的“U”型管实验（Bernard Davis，1950）
43、l结果在LA-22端出现原养型his+try+。（三）接合三）接合conjugationn n概念：通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA的过程。也称杂交。含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛 不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛（四）原生质体融合四）原生质体融合Protoplast Fusionn n通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，又称细胞融合。n n主要步骤n n1、原生质体制备：n n2、原生质体融合：n n3、再生成正常细胞：n n检出融合细胞。二、真核微生物基因重组二、真核微生物基
44、因重组n n（一）有性杂交n n一般指性细胞间的接合和随之发生染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式。n n（二）准性生殖parasexual reproductionn n类似于有性生殖但更为原始的一种生殖方式。可使同一生物的两个不同来源的体细胞经融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。三、基因工程三、基因工程gene engineeringn n在体外将外源DNA进行切割和连接，插入到载体分子中，形成重组DNA分子，再导入到受体细胞中，使外源基因在受体细胞中表达的过程。亦称DNA体外重组技术。主要步骤主要步骤n n1、从生物有机体基因组中，分离出带目的基因的DNA片段。n n2、将
45、片段连接到能自我复制的载体上，形成重组DNA。n n3、重组DNA转移到适当的受体细胞内。n n4、筛选获得了重组DNA的受体细胞克隆。n n5、克隆基因的表达，产生出人类所需物质。PCR技术技术1.直接从基因组中扩增直接从基因组中扩增（1）提取基因组）提取基因组DNA作模板作模板（2）根据目的基因序列设计引物）根据目的基因序列设计引物（3）PCR扩增扩增PCR技术Polymerase Chain Reaction双链双链DNA在在受热受热后，配对碱基的氢键断裂，后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为两条链分开成为单链单链。TGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTA
46、CGTATGCATGCATATCTTGAAC3 5 5 3 3 5 5 3 TAGAACTTGACGTACGTA95oC（1）DNA模板变性模板模板模板（模板（template）95oCTGCATGCATATCTTGAAC3 5 5 TAGAACTTGACGTACGTA3 人工合成的单链人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板与所要扩增的模板DNA双链的双链的5端相同端相同。（2）DNA模板与引物复性(退火）模板模板模板模板ATCTTGAAC5 3 ACGTACGTA5 3 引物引物引物引物引物（引物（primer）:40-65oCDNA聚合酶按碱基配对原则
47、在模板上延聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸伸DNA链。链。（3）DNA链的延伸TGCATGCATATCTTGAAC3 5 5 TAGAACTTGACGTACGTA3 模板模板模板模板ATCTTGAAC5 ACGTACGTA5 TaqTaq72oC理论上理论上25-30次循环就可以合成次循环就可以合成225-230条条DNA。变性变性复性（退火）复性（退火）延伸。延伸。（5）1个循环的结果个循环的结果（4）新一轮循环开始DNA elongation需要的模板量极低。需要的模板量极低。4.PCR的特点（1）特异性强）特异性强 PCR使用专门合成的使用专门合成的DNA引物引物。延伸过程是在延伸过程是
48、在高温高温下进行。下进行。（2）敏感性高）敏感性高 这就避免了一般这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物聚合酶污染和非引物延伸形成的延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。提高了反映的特异性。理论上只要一条模板链，理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约次循环就可合成约109条！条！RT-PCR：对模板的纯度要求低。对模板的纯度要求低。（5）可以扩增）可以扩增mRNA （4）简便 先用先用逆转录酶逆转录酶将将mRNA合成合成cDNA，再以，再以cDNA为模板进行扩增。为模板进行扩增。（3）快速）快速 整个整个PCR过程约过程约2-4小时即可完成。小时即可完成。不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已
49、固定或包不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。埋的组织切片也可以直接用于作模板。PCR技术的应用现代分子生态学现代分子生态学n n微生物生态学研究什么？n n1，有什么n n2，做什么n n3，能做什么n n4，我们利用他们做什么n n对环境中微生物种群的类型和数量进行及时和准确的分析测定在微生物生态研究中十分重要，传统的微生物分析测定方法，包括显微镜微生物形态观察、选择性培养基计数、纯种分离和生理生化鉴定等，在环境样品研究中都存在巨大缺陷。n n近年来，人们运用微生物生物化学分类的一些生近年来，人们运用微生物生物化学分类的一些生物标记，包括呼吸链泛醌、脂
50、肪酸和核酸，来进物标记，包括呼吸链泛醌、脂肪酸和核酸，来进行环境样品中的微生物种群分析。行环境样品中的微生物种群分析。n n其中，以其中，以16S 16S rRNArRNADNADNA为基础的分子生物学技为基础的分子生物学技术已成为普遍接受的方法，该技术主要利用不同术已成为普遍接受的方法，该技术主要利用不同微生物在微生物在16S16S核糖体核糖体RNA(RNA(rRNArRNA)及其基因及其基因(rDNArDNA)序列上的差异来进行微生物种类的鉴定和定量分序列上的差异来进行微生物种类的鉴定和定量分析。析。变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Elec