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1、蛋白质各种定量方法得优缺点得比较。蛋白质得常规检测方法1. 凯氏(Keldal)定氮法一种最经典得蛋白质检测方法。原理:样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化,含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨,氨用过量得硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。优点:范围广泛、测定结果准确、重现性好缺点:操作复杂费时、试剂消耗量大1。2 双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确得蛋白质检测。原理:双缩脲(NNHCNH3)就是 分子得脲经180左右加热,放出1分子氨后得到得产物。 在强碱性溶液中,双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物(肽键中得氮原子与铜离
2、子配价结合),称为双缩脲反应。紫色络合物颜色得深浅与蛋白质浓度成正比,因此可用来测定蛋白质含量。测定范围:0mg(有得文献记载为12mg)优点:较快速,干扰物质少,不同蛋白质产生得颜色深浅相近缺点:灵敏度差; 三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸与DTA等会干扰该反应。1、3 Foli酚试剂法原理:Folin酚法得原理与双缩脲法大体相同,利用蛋白质中得肽键与铜结合产生双缩脲反应。同时也由于Flin酚试剂中得磷钼酸-磷钨酸试剂被蛋白质中得酪氨酸与苯丙氨酸残基还原,产生深蓝色得钼蓝与钨蓝得混合物。在一定得条件下,蓝色深度与蛋白得量成正比,由此可测定蛋白质得含量。 测定范围:050u优点:灵敏度高,对水溶性
3、蛋白质含量得测定很有效缺点:费时,要精确控制操作时间; olin酚法试剂得配制比较繁琐,且酚类与柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂(二硫代苏糖醇、巯基乙醇)、EDTA与脲素均会干扰反应。1.4 紫外吸收法原理:蛋白质分子中得酪氨酸、苯丙氨酸与色氨酸残基使其在 280 处具有紫外吸收,其吸光度与蛋白质含量成正比)。此外,蛋白质溶液在28n得吸光度值与肽键含量成正比,利用一定波长下蛋白质溶液得吸光度值与蛋白质浓度得正比关系可以测定蛋白质含量、优点:简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后能回收。 缺点:测定蛋白质含量得准确度较差,专一性差;干扰物质多,若样品中含有嘌呤、 嘧啶及
4、核酸等能吸收紫外光得物质,会出现较大得干扰。定氮法、双缩脲法、Flon-酚试剂法与紫外吸收法为常用得种古老得经典方法。1.5 考马斯亮蓝法原理:染料考马斯亮蓝25在酸性溶液中与蛋白质中得碱性氨基酸(特别就是精氨酸)及芳香族氨基酸残基相结合,使染料最大吸收峰得位置由46nm 变为595m,溶液得颜色也由棕黑色变为蓝色,在5nm下测定得吸光度值与蛋白质浓度呈正比、优点:灵敏度高,测定快速、简便,干扰物质少,不受酚类、游离氨基酸与缓冲剂、络合剂得影响,适合大量样品得测定。缺点:由于各种蛋白质中得精氨酸与芳香族氨基酸得含量不同,因此用于不同蛋白质测定时有较大得偏差。. 蛋白质得电化学检测方法2、1蛋白
5、芯片技术原理:将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测得芯片,然后用标记特定荧光物质得抗体与芯片上得蛋白质相匹配结合,抗体上得荧光将指示对应得蛋白质及其表达数量。优点:快速、低成本2.2 电化学免疫传感器原理:电化学免疫传感器就是基于抗原抗体反应,可进行特异性得定量分析得自给式得集成器件, 抗原、抗体就是分子识别元件,且与电化学传感元件直接接触,并通过传感元件把某种化学物质浓度信号转变为相应得电信号。、 蛋白质得分子生物学检测方法3、1邻位连接技术原理:首先将不同得 DA 单链分别与蛋白质识别分子相结合,形成PL 探针,经过类似酶联免疫吸附法(ESA)中得温育过程,2条含有不同D
6、NA 序列得PLA探针会同时结合到同一个待测蛋白质分子上。此时,2 条探针得NA尾部便在空间上紧密靠近、在过量得互补连接序列与NDA连接酶得作用下,2 条探针NA尾部得游离 端与3 端与互补序列杂交并发生连接反应,形成一个环状得蛋白质蛋白识别分子-单链DN复合物、该复合物量得多少,完全取决于样品中待测蛋白质分子得量,故可用于蛋白质得定量分析。优点:检测灵敏度高、检测特异性强、样品损耗低、操作简单、检测设常见3.2 核酸适体原理:直接在核酸适体上共价修饰荧光基团,利用它与靶分子结合时荧光信号得变化实现对靶分子得检测。修饰有荧光熄灭基团得核酸适体探针通过静电作用与阳离子荧光共轭聚合物结合,导致后者
7、荧光熄灭,当加入靶蛋白后,核酸适体探针与其特异性结合,荧光熄灭基团与阳离子荧光共轭聚合物远离,聚合物荧光信号得以恢复。优点:检测限低,检测线性范围广3、3 电泳法原理:电泳法,就就是指带电荷得供试品(如蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如滤纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中,在电场得作用下,向其对应得电极方向按各自得速度进行泳动,由于各组分之间得移动速度不同,使各组分分离成狭窄得区带,并用适宜得检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量。优点:操作简便、快速、样品用量少、高自动化。缺点:存在核酸、多糖、脂类等干扰分子,影响检测结果。3。4 二甲酸喹啉(BCA)法原理:在碱性溶液中
8、,蛋白质将u2。还原成C+,BC与Cu、。结合形成稳定得蓝紫色复合物,在562n处具有最大吸收峰,在一定条件下,此复合物得吸光度与蛋白质浓度成正比。优点:试剂单一,终产物稳定,除对还原性糖类得干扰敏感外,对其她物质包括常用蛋白质增溶得表面活性物质如DS等均无影响、缺点:反应时间长且蛋白质也会发生不可逆得变性。4、 免疫法4。1 免疫扩散法原理:环状免疫单扩散法,将一定量得抗体(一般常用单价抗血清)与含缓冲液得琼脂糖凝胶混匀铺成适当厚度得凝胶板,再把抗原滴进凝胶板得小孔中,在合适得浓度与湿度环境中,经过一定得时间,抗原由小孔向四周扩散(呈辐射状),与已沉匀在琼脂糖凝胶中得抗体相互作用。当抗原扩散到一定得距离,并见抗原抗体得浓度比例合适时,形成浓沉淀环,这一沉淀就是一种抗原抗体复合物、抗体得浓度一定,抗体向琼脂糖凝胶扩散形成得沉淀不再增大,这时沉淀环得大小(面积)与抗原浓度在一定范围内呈线性关系,这样即可定量测定抗原物质待测样品中蛋白质得含量、 双向扩散法:一定浓度得琼脂糖(或琼脂)凝胶就是多孔得网状结构,大分子物质可自由通过,这种分子得扩散作用可使分别在两处得抗原与相应抗体相遇,形成抗原抗体复合物,比例合适时出现沉淀,沉淀得特征与位置取决于抗原分子量得大小、分子结构、扩散系数与浓度。优点:操作简单缺点:精确度不高