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1、PCR 荧光检测试剂盒生产质量把握规程一. 微量加样器的使用规定1. 微量加样器校正：: 使用微量加样器吸 10l 10 次是否为 100l。2. 加样前吸头润湿： 当吸头排空时，仍会有一些残留的液体以薄膜的形式吸附在吸头里面，所以，在加样时先吸打液体数次，充分润湿吸头管腔,以保证加样的全都性。3. 加样时吸头应靠试管壁：加样时吸头的液体顺着管壁流出，防止液滴的形成由于其外表张力的作用而阻挡样本的释放。4. 吸头是否与加样器上吸头套筒密封：样器上吸头与套筒密封完好。5. 加样时留意第一停点和其次停点：吸液是应留意大拇指按下按钮至第一停点，缓渐渐慢吸入液体。停留 1s，然后将吸头提离液面。用吸纸
2、抹去吸嘴外面可能黏附的液滴。放液时经过第一停点，停 1-2s 后，连续按压到其次停点， 排出剩余液体。6. PCR 反响原液由于有甘油在冷的状态较黏稠,易于 1 次吸取数人份，慢一些。7. 边加边看,直观估量,防止跳管。8. 低温冷藏批量DNA 提取液、PCR 反响液 A 和 B 取出时是否充分混匀后,分装使用，PCR 反响液 A 和 B 是否避光低温冷藏和使用。9. 配 PCR 反响液应先加缓冲液再加 PCR 反响液充分混匀,必要时倒置混匀, 再离心,或用灭菌吸头上下吸几次。10. PCR 反响液包括样品应充分混匀:保证 PCR 反响曲线呈 S 形，全阴性样品呈近似水平曲线。二PCR 试验操
3、作规程程序操作检查操作1混匀方法每一次提示留意倒置混匀、移液器吹打、震荡，50000rpm离心 1 分钟。2取血清样本1） 因水分蒸发变浓2） 冻状、混浊按1法混匀,再取 25 l 加水 5 l 混匀。温水浴 37 溶解按 1 法混匀, 或12023rpm 离心 5 分钟，取清液。3取质控品冻状、混浊温水浴37溶解按1法混匀或12023rpm离心 5 分钟，取清液。4血清样本稀释混匀血清阴性血清 40 l 加阳性血清 10 l，按1法混匀。5 倍稀释5质控品稀释混匀质控品血清稀释液 40 l 加质控品 10 l，按1法混匀 5 倍稀释。6血清样本 DNA 提取DNA 提取液完好血清样本按1法混
4、匀，取 30 l 加 DNA提取液 60 l，按1法混匀，98 8 分钟变性, 0冷却 2-3 分钟，12023rpm，离心 10 分钟,吸取上清液。7质控品DNA 变性分装，有效，呈清液状态，未反复加热、质控品按1法混匀，取 30 l5000rpm离心 1 分钟，98 5 分钟变性,5000rpm，冻融离心 1 分钟,吸取上清液。8PCR 反响液混匀状态取 25 l 反响液加 5 l 提取DNA，按1法混匀，5000rpm 离心 1 分钟， 5000rpm，离心 1 分钟,吸取上清液。9PCR 反响室温 10-30PCR 反响槽四角不放管。10设阴性比照阴性混匀血清CT3811阳性参考品各浓
5、度呈梯度以 PCRA 反响液制作标准曲线，呈直线。12阴性质控品B各浓度呈梯度以 PCRA 和 B 反响液制作标准曲线，呈直线。*血清稀释液：全阴性血清再加 2 倍 HBV DNA 提取液混匀, 5000rpm，离心 1 分钟，混匀血清 98 5 分钟变性,12023rpm，离心 10 分钟,吸取上清液。三.超净工作台的使用、维护保养与清洁标准操作规程 1.目的建立一个超净工作台的使用、维护保养与清洁标准操作程序，使操作过程标准化。2.职责质量部 QC 负责本文件的起草，质量部及 QC 检验人员负责本标准的实施。3.范围本标准适用于超净工作台的使用、维护和保养与清洁。4.内容4.1 超净工作台
6、的主要组成局部：高效过滤器、中效过滤器、通风机、电气把握及排气管道局部。4.2 安放点的选择：4.2.1 应安放于卫生条件较好的地方，便于清洁，门窗能够密封以避开外界的污染空气对室内的影响。4.2.2 安放位置应远离有震惊及噪音大的地方。4.2.3 严禁安放在产生大尘粒及气流大的地方，以保证操作区空气的正常流动。4.3 使用前的检查：4.3.1 接通超净工作台的电源。4.3.2 旋开风机开关，使风机开头正常运转，这时应检查高效过滤器出风面是否有风送出。4.3.3 检查照明及紫外设备能否正常运行，如不能正常运行则通知工程部检修。4.3.4 工作前必需对工作台四周环境及空气进展超净处理，认真进展清
7、洁工作，并承受紫外线灭菌法进展灭菌处理。4.3.5 净化工作区内严禁存放不必要的物品，以保持干净气流流淌不受干扰。4.4 使用：4.4.1 使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒。4.4.2 接通电源，提前 50 分钟翻开紫外灯照耀消毒，处理净化工作区内工作台外表积存的微生物，30 分钟后，关闭紫外灯，开启送风机。4.4.3 工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的干净气流不受干扰。4.4.4 操作完毕后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关， 用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。4.4.5 最终开启工作台紫外灯，照耀消毒 30 分钟后，关闭紫外灯，切断电
8、源。4.4.6 每二月用风速计测量一次工作区平均风速，如觉察不符合技术标准， 应调整调压器手柄，转变风机输入电压，使工作台处于最正确状况。4.4.7 每月进展一次维护检查，并填写维护记录。4.5 清洁4.5.1 每次使用完毕，马上清洁仪器，悬挂标识，并填写仪器使用记录。4.5.2 取样完毕后，先用毛刷刷去干净工作区的杂物和浮尘。4.5.3 用细软布擦拭工作台外表污迹、污垢目测无清洁剂残留，用清洁布擦干。4.5.4 要常常用纱布沾上酒精将紫外线杀菌灯外表擦干净 ,保持外表清洁, 否则会影响杀菌力气.4.5.5 效果评价:设备内外外表应当光亮干净，没有污迹。四.检验方法操作标准1. 混匀：反响液混
9、匀，按人份量取出，加样，再混匀后 5000 rpm 离心数秒(按原说明进展)。2. 准确：反响液及样本混匀后,每一步加样准确(按原说明进展)。3. 颖血清样本： 血清样本混匀后离心5000 rpm 离心数秒，取 30l，加 2 倍量 DNA 提取液 60l 混匀 100 8-9 分钟变性，放置冰箱 0冷却 2-3 分钟, 12023rpm 离心 5 分钟，取出全部上清液置另 1 管混匀，再取 5l 加样。4. 长期放置冰箱冷藏血清样本：取 25l，加无菌水 5l 加 2 倍量 DNA 提取液 60l 混匀 98 8-9 分钟变性，放置冰箱 0冷却 2-3 分钟, 12023rpm 离心 5 分
10、钟，取出全部上清液置另 1 管混匀，再取 5l 加样.5. DNA 提取液处理并冷藏保存血清样本：DNA 提取液处理：血清样本混匀，取 200l，加 DNA 提取液 400l 混匀 98 5 分钟变性，放置冰箱 0冷却 2-3 分钟, 12023rpm 离心 5 分钟，取出全部上清液置另 1 管混匀，冷藏保存，按 100l /管分装冷藏保存.保存血清样本使用：取 1 管分装冷藏保存血清样本，溶化后混匀，5000 rpm 离心数秒，再取 30-40l 98 5-6 分钟变性，放置冰箱 0冷却 2-3 分钟, 5000 rpm 离心数秒，再取 5l 加样.6. 质粒 DNA 有关质控品P 和 N：
11、用全阴性血清与质粒 DNA 按 9:1 混匀,5000rpm，离心 1 分钟,再加 2 倍 HBV DNA 提取液混匀, 5000rpm，离心 1 分钟， 混匀血清 98 5 分钟变性,12023rpm，离心 10 分钟,吸取上清液, 取出全部上清液置另 1 管混匀，冷藏保存，按 100l /管分装冷藏保存.有关质控品使用：取 1 管分装冷藏保存质控品，溶化后混匀，5000 rpm 离心数秒，再取 30-40l 98 5-6 分钟变性，放置冰箱 0冷却 2-3 分钟, 5000 rpm 离心数秒，再取 5l 加样.五.防止荧光定量 PCR 产物污染的质控规程1.目的标准荧光定量PCR 试验和生
12、产的操作过程，确保操作过程中无PCR 产物污染。2.适用范围本标准适用于荧光定量 PCR 试验和生产的操作过程。该规程参照中华人民共和国艾滋病核酸检测技术标准。3. 职责划分操作人员依据此标准操作标准进展荧光定量 PCR 试验和生产，质检部经理负责监视。4. 质量保证体系4.1 试验室和生产工作区质控体系4.1.1 试验室和生产工作区原则上应分为四个独立工作区，分别是试剂预备区(GMP 车间超净工作室)、样品处理区质检室 1、扩增区质检室 2和扩增产物分析区质检室 3。前两区为扩增前区，后两区为扩增后区。各区的功能是：(1)样品处理区：样品登记、分装。各种组织匀浆或细胞裂解，进展核酸提取、保存
13、和加样。2)试剂预备区：PCR 扩增试剂的配制、分装和保存。(3) 扩增区：一般 PCR 扩增及荧光定量 PCR 扩增。(4) 扩增产物分析区：PCR 扩增产物的电泳、杂交、成像、测定、结果分析、报告。4.1.2 用有效的方法对操作区域和共用器具在试验前后进展清洁及消毒推举的程序是：a. 试验前将次氯酸钠溶液或 70%乙醇涂布于操作台或器具外表，两分钟后用纸巾擦除。b. 移入盛放污染材料的器皿、所需的试剂、耗材和样品，进展试验。c. 一个试验区域在同一时间段只进展一种试验。d. 试验完毕后移出个人专用材料至个人专用区域保管；封好污染材料盛放器皿并移出至污物袋；移出共用器具至特地区域保管；将次氯
14、酸钠溶液或70%乙醇涂布于操作台或器具外表，两分钟后用纸巾擦除；翻开紫外灯照耀至少 15 分钟。4.1.3 试验工作区内必需穿好试验工作服，并戴口罩，进展试验操作时依据要求戴不同规格的手套。4.1.4 PCR 产物分析使用相对封闭的系统或共用分析软件时，如特定的凝胶成像分析检测系统及分析软件或荧光定量 PCR 仪及分析软件，每位试验人员都要准确的命名自己的设置程序及分析结果，使用完毕后需整理好所用的仪器并保存好自己的试验分析结果。4.1.5 各区域的仪器、设备、器具和试剂应为该区专用，不得穿插使用。4.2 荧光定量 PCR 扩增试验过程把握体系：4.2.1 样品的采集和处理4.2.1.1 用于
15、一般 PCR 或荧光定量 PCR 检测的样品有细胞、全血、血浆、各种组织和其他分泌物，有时还包括生物制品。4.2.1.2 采集样品应避开微生物和核酸污染所用器皿必需无菌或属于一次性用品，RNA 类样品所用器皿必需没有 RNA 酶污染。4.2.1.3 处理样品应在样品处理区由专人进展。处理和保存用于抽提 DNA 或RNA 的样品应避开 DNA 或 RNA 酶造成的降解，通常要求在采样后 1 小时内处理并低温保存。4.2.1.4 处理后的样品应分装、标记需用防水的笔填写，并做好试验记录，冻存于-20以下，DNA 或 RNA 类样品应冻存于-60或保存在液氮中。4.2.2 核酸RNA/DNA提取4.
16、2.2.1 应在规定的区域内由专人按相应程序进展。4.2.2.2 应保证无细菌及核酸污染，试验材料和容器应经过消毒处理并一次性使用。4.2.2.3 提取 RNA 时应避开 RNA 酶污染，抽提 RNA 样品试验使用的移液器及离心管等用品必需用 DEPC 处理，去除 RNA 酶。4.2.2.4 配制 RNA 逆转录或 DNA 反响试剂，全部操作超过 10 分钟时应将反响管置于冰盒内，防止各种酶及样品 DNA 或 RNA 降解。4.2.3.3 进展逆转录反响时应避开 RNA 酶污染，试验使用的移液器及离心管等用品必需用 DEPC 处理，去除 RNA 酶。4.2.3.4 扩增仪应预热，时间不少于 2
17、0 分钟。4.2.3.5 进展内参基因的扩增actin 或 GAPDH，并设置递增 PCR 循环数，电泳确定逆转录的效率及 CDNA 样品的起始浓度，为荧光定量 PCR 试验做预备，成功的逆转录样品在 PCR 扩增时 25 个循环即可见清楚的内参条带。4.2.4 荧光定量 PCR 试验：4.2.4.1 应在样品处理区内加样。快速准确的将样品 DNA 或 RNA 留神参与装有反响液体的反响管内，盖紧盖子并做好标记。4.2.4.2 操作超过 10 分钟时应将反响管置于冰盒内，防止酶降解及副反响发生。4.2.4.3 严格依据荧光定量PCR 仪的操作手册启动机器，设置试验扩增程序， 保存文件，最好以日
18、期及样品名称命。PCR 扩增仪应预热，时间不少于 20 分钟。4.2.4.5 将反响管置于扩增仪上，开头扩增。4.2.4.6 反响完毕时停顿试验程序，取出反响产物，20保存。4.2.4.7 扩增结果分析和定量依据操作手册进展，对三孔平行的试验结果必需首先推断其是否准确孔间差异0.3 时应考虑舍弃该孔数据，并重进展该样品的荧光定量 PCR 试验，然后依据标准曲线计算出各样品的浓度。4.2.7.8 结果报告中应注明使用的试验方法、试验试剂、试验仪器及样品种类和样品量。4.3 客户沟通质量体系：4.3.1 收到样品后，由专业的负责人进展样品的清点和整理工作，以确保样品数目的准确性和样品的有效性。如有
19、问题，应准时的与客户进展沟通。4.3.2 在确保样品无误和有效的状况下，由专业的技术人员进展样品的处理工作核酸的抽提工作依据标准操作；并进展抽提的 DNA 或 RNA 的浓度测定。在此步骤试验完毕后，将结果整理，并准时的发送给客户。如有问题消灭， 则和客户准时沟通，保证明验的下一步工作。4.3.3 在确保核酸的抽提正确和有效的前提下，进展逆转录的试验过程依据标准操作进展。试验完毕后，将结果整理，并准时的发送给客户。如有问题消灭，则和客户准时沟通，保证明验的下一步工作。4.3.4 在确保逆转录正确和有效的前提下，进展样品的预试验过程。摸索检测基因的反响条件，并将结果准时通知客户。4.3.5 在预
20、试验成功的前提下，进展正式的荧光定量 PCR 试验。试验开头后， 每周和客户进展一次沟通可以通过 或 e-mail 及网络方式，汇报试验的进展状况，并认真记录客户提出的建议和意见，对消灭的问题随时协商解决。六试剂盒的生产和制备1 试剂盒的生产和制备地点 在 GMP 净化车间进展，净化车间内工作的人员应穿着符合要求的工作服和帽子。选材、式样及穿戴方式应与生产操作和空气干净度级别要求相适应，并不得混用。2 工艺用水 制水设备应满足水质要求并通过验证，经灭菌处理。3 微量加样器 使用前后用灭菌消毒的纸包好，置传递窗，紫外线消退 DNA30 分钟。4 生产区域定期清洁、清洗和消毒 生产区域定期清洁、清
21、洗和消毒，高风险的生物活性物料其操作应使用单独的空气净化系统，与相邻区域保持负压， 排出的空气不能循环使用。5 质粒DNA 制备和提纯 在质粒DNA 制备和提纯过程中,全部器具都应灭菌消毒，紫外线照耀，确保无质粒DNA 和 PCR 产物污染。质粒DNA 制备和提纯后，马上分装，置放于用高压处理的容器中，60保存，防止质粒 DNA 集中和被 PCR产物汽溶胶污染。6 病毒(HBV)核酸定量标准品、阴性参考品、阳性参考品，质粒 DNA 和 PCR 产物污染防止 将标准品和参考品包装外表去除质粒 DNA 和 PCR 产物污染后，在超净工作条件下，分装，置放于用高压灭菌处理的容器中，60保存，防止质粒
22、 DNA 集中和被 PCR 产物汽溶胶污染。7 PCR 反响管的中 PCR 反响产物污染消退 应用尿嘧啶-N-糖基化酶UNG 酶对 DNA 中 dUTP 的酶解作用酶 PCR 反响产物 DNA.将 UNG 酶 100 u 单位浓度稀液稀释到 0.5u/ l ,每支 PCR 反响管中参与 0.2 l,进展 UNG 酶解,消退污染。含 dUTP 的 10mM dNTP 配制:原材料: dATP 100mM /250 l; dGTP 100mM /250 l; dCTP 100mM /250 l; dTATP 100mM /250 l;dUTP 100mM /250 l。配制 10mM dNTP:d
23、ATP 100mM /20 l; dGTP 100mM /20 l;dCTP 100mM /20 l; dTTP 100mM /10 l;dUTP 100mM /10 l; 合计 25 mM /80 l ,稀释 2.5 倍-10 mM /200 l。PCR 循环条件按以下设置：37 5 分钟 UNG 酶解反响，93 3 分钟预变性， 然后 93 30 秒-55 30 秒循环 10 次，93 30 秒-55 60 秒循环 30 次。37 5 分钟 UNG 酶解反响,使 PCR 反响产物污染完全消退。工序质量把握点质量把握工程频次原辅料由指定供给商供给内包装材料批批检验每一进厂批次生产前外包装材料
24、配制计量设备经过校验,在有效期内1 次/批投料双人复核称量七.质量监控点：符合质量标准纯化水符合质量标准1 次/周校准原辅料物料符合配制要求品种、数量克 隆 菌种 保 存与纯化纯化菌种菌种复壮、纯化、防污染1 次/2 月阳 性 标准 品 制备质粒制备纯度、浓度阳性标准品配存制、 分 装 、 低 温保1 次/批制备阴 性 质控 品 制备血清蛋白制备无 HBV、配制、分装、低温保存1 次/批PCR 反应 液 制备防污染、移液器准确加量、配制、分装、低温保存随时/班包材数量、无破损、色泽统一包装批号正确、清楚随时/班成品数量准确、包装码放符合要求试 剂 盒保存低温防止反复冻融，消灭菌斑随时/班干净八
25、.生物安全准则本标准旨在标准临床试验室的安全治理，内容着重在试验室和工作人员安全的一般要求，防火、用电、化学危急物品、微生物的安全要求，以保证明验室的安全运作，将事故把握在最低限度。为各级临床试验室的安全治理供给依据。1.工作人员和试验室安全的一般要求1.1 试验室工作区内确定制止吸烟。1.2 试验工作区内不得有食物、饮料及存在“手口”接触可能的其它物质。试验室工作区内的冰箱制止存放食物。1.3 试验工作区内制止使用扮装品进展扮装。1.4 处理腐蚀性或毒性物质时，须使用安全镜、面罩或其它保护眼睛和面部的防护用品。工作人员在试验室的危急区内不要佩戴隐形眼镜，除非同时使用护目镜或面罩。使用、处理能
26、够通过粘膜和皮肤感染的试剂，或有可能发生试剂溅溢的状况时，必需佩带护目镜、面罩或面具式呼吸器。1.5 试验室工作人员在脱下手套后、离开试验室前、接触患者前后、以及在进食或吸烟前都应当洗手。接触血液、体液或其它污染物时，应马上洗手。1.6 外衣试验服、工作服、和围裙应悬挂在远离散热器、蒸汽管道、供暖装置、以及有明火的地方，不要挂在压缩气瓶或灭火器上，也不要挂在门的玻璃隔板上，阻碍视线。“清洁”的和“非清洁”的个人防护服要分开存放。1.7 试验室的出口和通道必需保持畅通无阻，不准堆放物品、垃圾、装置、或设备。安全门必需保持畅通，不得堵塞。防火门前不能堆物，以确保失火时能够自动关闭。2. 试验室用电
27、安全准则2.1 作为仪器维护措施的一局部，应进展年度的安全用电检查并建立档案记录。试验室应装有足够的插座，分布要合理，以削减在插座上接上其它多用插座和避开拖拉过多的电线。2.2 全部电器设备的修理与维护只能由取得正式资格的修理人员进展。3.试验室微生物安全准则在临床试验室，工作人员在接触标本和操作过程中，可能被感染。临床试验室可能接触的微生物可分为三类：病毒、细菌、其他具有高毒力的病原体，如出血热病毒和立克次体。由于从病史和体检不能牢靠地鉴定全部病人的病原体，所以当接触和处理全部的体液时，均应执行“常规预防措施”。3.1 全部的单位都应执行“常规预防措施”。另外，每个试验室都应确定每个职员工作
28、岗位的潜接触的程度。一旦确定有接触潜在感染原的可能，应实行硬件把握和操作过程把握，以削减或消退接触这些潜在感染原的可能。各单位应供给相应的个人防护装备，如手套、工作服、试验服、面罩、面具、护目镜、安全镜和鞋套等。并讲解何时使用和如何使用。3.2 来自全部病人的血液和体液都被认为是具有传染性的。全部血液和体液的标本都应放置于具有安全盖的构造优良的容器里，以防在运输过程中发生泄漏。采集标本时应防止污染容器的外表或随标本的检验单。假设存在潜在的或实际的污染，则应再加一层包装例如：包装袋。全部的标本应加上生物危害标签。全部处理血液和体液例如：取下真空试管的塞子的工作人员都应戴上手套。假设有可能发生血液
29、或体液的喷溅，则应使用面部防护装备。3.3 血液或其他体液发生泄漏或工作完毕后及，均应使用适宜的化学杀菌剂对试验室工作区进展外表消毒。可使用颖配制的漂白粉溶液次氯酸钠 1:10 稀释液和 2.5甲酚溶液或其它有效的溶液对全部的工作台进展消毒。漂白剂溶液应至少作用 15 分钟，使用其它的消毒剂可参考其产品说明书。3.4 手或其他部位皮肤接触血液或其他体液后必需马上彻底清洗。在试验工作完毕后或取下手套后应马上洗手。在离开试验室之前应脱下全部的个人防护装备。3.5 必需承受通用的警告标志系统明确标识装有危急生物制品的容器或被 其污染的物品，在危急废弃物的容器、存放血液和其它有潜在传染性物品的冰箱、以及处理锐利物品的容器上，所贴的标签应标明通用的生物危害标志。3.6 生物安全橱是微生物试验室里把握生物危害的最好的方式之一。试验室应制定安全橱的维护规程，以确保安全橱内适宜的气流流速，并适时更换滤器。安全橱的放置应远离气流不稳定的地方，通风口的设置应依据产品说明书。在维护、移动和使用或处理安全橱之前必需对生物安全橱进展消毒。