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1、农产品中碳水化合物的分析农产品中的碳水化合物通常包括糖分、淀粉、纤维素、半纤维素以及果胶等。它们都是农产品常规分析的重要项目。1.1 糖分的分析农产品中的主要糖分有单糖(葡萄糖和果糖)及双糖(蔗糖)。它们都溶于水也溶于酒精，统称水溶性糖。单糖具有还原的特性，称还原糖；蔗糖不具还原性，称非还原糖。但蔗糖经水解为单糖后就又具有还原性。糖的还原性与测定方法有密切关系，大多数的测定方法是依据这一还原性质来定量测定它的含量的。 糖分分析从分析意义来看，可分为三种：植株中少量可溶性糖的测定，以研究植物不同生育时期体内碳、氮代谢；农产品水果、蔬菜中糖分含量测定，以评价其品质；糖用作物如甘蔗、甜菜中的糖分测定
2、，为加工提供参考数据。因此，糖分的分析，对于鉴定农产品果蔬品质，以及对于改进栽培技术和选择合适的加工、贮存条件都很必要。植物组织中的水溶性糖包括葡萄糖、果糖(还原糖)和蔗糖(非还原糖)。它们的测定首先须用水在80浸提出来，也可以用酒精浸提。后者是在样品中含淀粉和蔗糖高时采用。双糖须经水解转化为还原糖后再测定。还原糖的测定方法很多，有重量法、容量法、比色法及旋光法等。本节介绍容量法：铜还原直接滴定法，以适用于瓜果、蔬菜等含糖量高的样品的测定。铜还原直接滴定法是以标准糖滴定试剂为基准与绘制标准曲线类似，准确性较高。蒽酮比色法，以适于植株及谷物籽粒含糖量较低的样品的测定；此法还可用于样品未经水解转化
3、测定可溶性总糖量。此法操作简便、快速、灵敏度高，因不同糖类皆可与蒽酮反应产生有色溶液，不同糖的反应产物颜色有差异以及显色强度随时间而变化，故此法准确度稍差，可作为快速测定法。1.1.1 果蔬含糖量的测定 (铜还原直接滴定法：斐林试剂直接滴定法)目的及原理：测定果蔬及其加工品中糖分含量的基本原理，是根据还原糖(果糖和葡萄糖)可以还原斐林试剂而生成氧化铜这一特性。斐林试剂由甲乙二种溶液混合而成，试剂甲为硫酸铜溶液，试剂乙为氢氧化钠与酒石酸钾钠的混合液，甲乙二液混合后，硫酸铜与氢氧化钠生成氢氧化铜沉淀。CuSO4+2NaOH Na 2SO4+Cu(OH)2氢氧化铜在酒石酸钾钠存在时呈溶液状态： HO
4、CHCK OCHCOOK CaCu(OH)2+ HOCHCOONa OCHCOONa+2H2O此溶液与还原糖作用，在加热滴定时即产生红色的氧化亚铜沉淀： O OCHCOOKCH2OH(CHOH)4C H + 2Cu OCHCOONa +2H2OCH2OH(CHOH)4COOH + Cu2O HOCHCOONa+O HOCHOOK滴定终点可以借有机染料次甲基蓝作指示剂来决定，次甲基蓝在碱性溶液中被过量的还原糖还原成“无色染基”，溶液的蓝色即行消失，但无色染基在常温下极易被大气中氧所氧化变成原来的蓝色，故滴定时瓶中溶液须保持沸腾状态，以免影响滴定结果。蔗糖转化后，所得转化糖的重量增加，计算时应将转
5、化糖量减去水解前还原糖量再乘以0.95，才是实际的蔗糖量。主要仪器：恒温水浴锅、分析天平、酒精灯等。试剂：配制(1)斐林试剂甲：溶解硫酸铜34.639克于500ml容量瓶中，加水稀释至刻度。 (2)斐林试剂乙：溶解酒石酸钠173克(或用25克甘油代替)及氢氧化钠50克于500 毫升容量瓶中，加水稀释至刻度静置12日，用石棉过滤后备用。(3)标准转化糖及斐林试剂的标定：称取纯蔗糖9.5克溶于50ml水中，加6mol/L盐酸5ml，在2025室温下静置五天(或者煮沸15分钟)，使蔗糖转化，冷却后移入1000ml容量瓶中，加水稀释至刻度，再由稀释了的糖液中吸取100ml放入500ml的容量瓶中，加1
6、%酚酞23滴，以6mol/L氢氧化钠溶液中和后加水稀释至刻度，即为转化糖溶液。此液1ml含转化糖2毫克。吸取配制的斐林试剂甲乙各5ml，混合于250ml三角瓶中，由滴定管中滴入标准转化糖液10ml，在酒精灯上加热至沸，加次甲基蓝指示剂23滴，再由滴定管中徐徐滴入糖液，至蓝色完全褪尽，溶液呈清亮为止，根据滴定所用转化糖毫升数，校正斐林试剂10毫升相当的转化糖克数。注意全部滴定过程在沸腾状态下进行。(4)6mol/L氢氧化钠(5)6mol/L盐酸(6)1%次甲基蓝指示剂(7)中性醋酸铅(8)无水硫酸钠(少量)操作步骤样品中含糖量的测定：(1) 样品液的配制：称取切碎后的果蔬样品20克(或果脯5克)
7、置研钵中磨碎，倒入250ml容量瓶中，加水稀释至刻度(如果表面有气泡可以加酒精数滴以除气泡)，经1015分钟浸渍，将样品液过滤于干燥的三角瓶中备用。如蛋白质含量多的样品，在定容以前加25ml中性醋酸铅以除蛋白质，摇动混合10分钟后加水稀释至刻度，过滤，并以无水硫酸钠12克以除去过量的铅盐。(2) 还原糖的测定：吸取配好的样品液50ml放于100ml容量瓶中(要求每ml稀释后的样品液约含4mg的还原糖)，加水稀释至刻度，混合均匀后移入滴定管中备用。吸取斐林试剂甲乙各5ml，混合于三角瓶中先由滴定管中滴入样品液56ml，在酒精灯上加热至沸，加次甲基蓝指示剂23滴，继续由滴定管中徐徐滴入样品液，至蓝
8、色褪尽，溶液呈清亮时为止，记下消耗的样品液亳升数，重复滴定三次(每次相差应不超过用量的3%)取其平均值用下列公式计算：W=A/Bb/a100W100克样品中含还原糖的克数A 斐林试剂10毫升相当的还原糖克数B 滴定时所用样品液的毫升数a 样品的克数b 样品稀释的总毫升数(3) 蔗糖的测定：吸取上述配好的样品液50ml，移入100ml容量瓶中，加6mol/L的盐酸5ml置于水浴锅中煮沸10分钟，冷却后加入酚酞指示剂23滴，以6mol/L氢氧化钠中和，加水稀释至刻度，混合均匀倾入滴定管中，用已知斐林试剂如上法测定，并算出蔗糖含量。计算公式：W=(S2-S1)0.95W100克样品含蔗糖的克数S1水
9、解前100克样品中含的还原糖克数S2水解后100克样品中含的转化糖克数(4) 总糖含量%=蔗糖%+还原糖%1.1.2 作物可溶性糖的测定(蒽酮比色法)测定意义可溶性糖主要是单糖，即葡萄糖和果糖(也称还原糖)和双糖即蔗糖(也称非还原糖)组成，它是植物体内一种重要的碳水化合物，在一般植物及植物产品中，测定其含量多少，不仅能反映作物的生长状况，而且还能反映其品质。因此在植物分析中进行可溶性糖的测定颇为重要。测定原理糖类遇硫酸即脱水成为羟醛类： H HHOC COH CHCH 脱水 H2C CHCH HC CCHO + 3H2O O OH OH 然后，蒽酮与糖醛脱水、缩合，形成糖醛衍生物，呈蓝色，蓝色
10、的深浅，可做为定量的标准。 H H O C C O + HC CCHO O CH CH2OH O试剂配制(1)准确称取1.000g葡萄糖溶于1升容量瓶中，此清液为1000mg/L，从此液中吸取0、1、2、4、6、8、10毫升注入100毫升容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，此溶液即0、10、20、40、60、80、100mg/L糖溶液，分别吸取系列标准糖液各2ml分别注入7个比色管中，按照试样测定的方法进行处理并比色，以横坐标表示不同的糖浓度，纵坐标表示光度计的相应光密度。绘出葡萄糖的标准曲线。(2)蒽酮溶液称取01克蒽酮溶于100毫升72%的硫酸中，(每100毫升01%蒽酮溶液硫酸含量为比重
11、184的浓硫酸74毫升)此试剂需新鲜配制，若在100毫升蒽酮试剂中加1克硫脲，则可以延长保存时间至一个月。测定步骤1提取：精确称取经磨细的干样品100毫克，置于一个15毫升的离心管中，加入10毫升80%酒精，在管口上盖一个塞子，保持在8085热水浴内，30分钟，取出离心，把上层清液轻轻移至一个50毫升烧杯中，照此法对残渣重复提取2次，以使可溶性糖提取完全。 把上述酒精提取液置于8085水浴上，使酒精蒸发，直到剩下3毫升液体为止。而后用蒸馏水定容至25毫升。作为可溶性糖的提取液。2测定：吸取5毫升的糖提取液至一个25毫升容量瓶中，用蒸馏水定容，取2毫升此稀释的糖提取液至一个具有塞的比色管中，然后
12、，沿管壁缓缓注入蒽酮试剂10毫 升，加完后立即摇动半分钟，放入沸水浴中加热10分钟，取出后放入冷水中迅速冷却，待10分钟后，使之显色稳定，于620nm波长光源下进行比色，测得光密度。结果计算根据光密度读数，自标准曲线上查出含糖量(mg/L)，然后，代入下列公式中计算：可溶性糖%(克/100克干样)= mg/L2525/510-6/样品重100注意：(1)不经分离而分别测定葡萄糖、果糖和蔗糖的蒽酮比色法基于以下两点：1.在50下葡萄糖与蒽酮不显色，在此温度下果糖显色3分钟的消光度与果糖在100显色35分钟的消光度几乎相等；2.稀碱与糖溶液共热时，可破坏葡萄糖和果糖，蔗糖不被破坏，因此，在不同温度
13、不同条件下不同糖标准工作液的操作下，可以分别测出水溶性总糖、蔗糖、果糖和葡萄糖的含量。2反应温度、显色时间、试剂和溶液初始温度均影响其显色状况，操作欠慎易引起误差。1.2淀粉的测定淀粉是由葡萄糖聚合成的高分子化合物。淀粉在酶或酸的作用下又水解成葡萄糖，这是淀粉经酶或酸水解后测定还原糖计算淀粉含量的理论基础。另外淀粉经分散和酸解后具有一定的旋光性，则是旋光法测定淀粉含量的基础。另外测定薯类淀粉可用比重法。本节介绍经典的酸水解与酶水解后测总还原糖的方法。1.2.1 谷物中淀粉的测定 (含多量淀粉样品的测定：HCl水解一铜还原直接滴定法)原理：淀粉在稀酸(1%HCl)的作用下，水解为糊精和麦芽糖，最
14、后都转化成葡萄糖：(C6H10O5)n+nH2On(C6H12O6)淀粉 葡萄糖然后用测定还原糖法测定葡萄糖，再乘上换算系数09即为淀粉含量。根据反应式淀粉与葡萄糖之比为：162.1：180.12=0.9：1即为0.9克淀粉水解后可得1克葡萄糖。此法优点是分析步骤简单，沸水浴中水解时间约34小时完成，所以采用较普遍。但其缺点是在酸水解淀粉的同时，谷物中的半纤维素和多缩戊糖也随之水解，这使测定结果产生正误差。主要仪器：恒温水浴锅、电热烘箱试剂：(1)1%HCl:23ml浓HCl(二级)加水至1L。(2)10%NaOH(3)10%中性醋酸铅：称取100gPb(OAC)2溶于1L水中，过滤。(4)甲
15、基红指示剂(5)I2KI溶液：称取2gKI溶于5ml水中，加入1gI2加水至1L保存于棕色瓶中。其余同1.1.1。操作步骤：称取风干磨细通过60目筛的样品，1.2.g(如系含脂肪高的样品须先脱脂)，放入250ml三角瓶中，加入1%HCl150ml，用具有长玻璃管的塞子塞紧(注1)，在沸水浴中加热(也可放入105烘箱中代替)，加热过程中须常常摇动，并注意三角瓶的液面浸入沸水中，同时切勿使三角瓶直接接触水浴锅底，以免跳动或样品焦化。经34小时后，取出试样少许，检查是否水解完毕。具体作法如下：用玻璃棒或皮头吸管吸少许带固体颗粒的悬液，放在白瓷板上，加1滴I2KI溶液，如固体不显蓝色、红色或紫色说明水
16、解已完毕。所取溶液须无损地倒回三角瓶中，并用少量水冲洗，洗液全部收集在三角瓶中(也可于玻片上在低倍显微镜下观察颜色)。如水解不完全，应继续加热半小时后再进行检查，直到水解完全为止。水解结束后，冷至室温，加入甲基红34滴，用10%NaOH中和至微黄色为度(注2)。然后逐滴加入10%中性Pb(OAC)2约510ml，以沉淀蛋白质。静置片刻，待上部溶液澄清后，再加入几滴Pb(OAC)2溶液，检查蛋白质是否沉淀完全。继续滴加Pb(OAC)2溶液直至无白色絮状沉淀产生为止(注3)。将水解液过滤入250ml容量瓶中，用水洗涤三角瓶和沉淀数次，滤液全部收集于容量瓶中，加水定容。用吸管吸取50ml清液于100
17、ml容量瓶中，逐滴加入57ml饱和Na2SO4溶液以除去过量的醋酸铅(注4)，至不再产生白色PbSO4沉淀为止，加水定容后过滤。此即由淀粉水解而得到的葡萄糖溶液。然后将此淀粉水解完毕的葡萄糖待测液装入50ml滴定管中，按1.1.1操作步骤测定还原糖的含量。结果计算：淀粉，%=测得葡萄糖(mg)分取倍数/样品重(mg)0.9100式中0.9淀粉单元的式量为162.1，葡萄糖的分子量为180.1，两者之比为0.9，分取倍数一此操作中为250/50100=500注释注1在沸水浴上加热时用具有长约5060mm玻管的塞子塞三角瓶，为使溶液浓度在加热程中不致改变，加热蒸发的水，可由空气冷凝后滴回瓶中。注2
18、此处注意勿加入过量的碱，因单糖在碱性溶液中易分解。且在加入Pb(OAC)2沉淀蛋白质时会形成糖的铅盐沉淀。注3注意在近中性溶液中，也可能产生氢氧化铅的白色沉淀，必须与微带黄色或白色的絮状、较轻，悬浮在溶液中的蛋白质沉淀区分开。Pb(OAC)2沉淀较细、较重，能迅速地沉淀下来。注4 过量的Pb(OAC)2对下步测定有碍，必须除去。但如不立即测定还原糖，则可暂不除去铅，因为铅离子可以防腐。1.2.2 酶水解法 (一)适用范围 适于样品中含半纤维素及一些五碳聚糖高的样品，如草本植物(牧草等)的茎、叶中有较多的半纤维素；种子的淀粉含量虽高，但也有些五碳聚糖可被酸水解。若须取得精确结果，最好采用酶水解法
19、。淀粉酶有严格的选择性，它只水解淀粉而不水解其它成分。酶将淀粉先水解为麦芽糖及糊精，最后也都水解成葡萄糖。测定所得葡萄糖量，就可计算淀粉含量。试剂配制：(1)20%NaOH(2)甲苯(3)淀粉酶(4)2025%HCl(浓HCl696ml加水至1L)。(5)磷酸盐缓冲溶液：11.876gNa2HPO4溶液300ml与KH2PO4700ml混合即可。测定步骤：称取风干磨细并通过60目筛的样品1.0002.000g于250ml三角瓶中加少量冷水使样品湿润，迅速加入约100ml热水，并置于沸水浴中加热1h，使淀粉完全胶化，胶化时淀粉的外膜破裂，水能透入淀粉粒的内部，这时淀糖溶解，淀胶膨胀，形成浆状溶液
20、。 1h后取出三角瓶，冷却至约5055加入0.030.05g淀粉酶。此淀粉酶须事先加35ml水用玻棒研磨然后再加入，使它容易与溶液混合；否则淀粉酶干粉可能粘于三角瓶的内壁，或在液面上形成小块，从而减弱了淀粉酶的作用。加入淀粉酶后，立即加入磷酸盐缓冲液10ml，甲苯5滴，用软木塞紧，然后将三角瓶放置于4555恒温箱中保温2昼夜或更长。保温2昼夜后，将溶液冷却，洗入250ml容量瓶中，加水至刻度，混匀后过滤。取滤液100ml至250ml三角瓶中，加入20%HCl10ml放入沸水浴中3小时，塞以带有空气冷凝管的塞子，使淀粉水解生成的糊精和麦芽糖再经酶水解为葡萄糖。3小时后将内容物放冷，用20%NaO
21、H(约需10ml)中和至红色石蕊试纸变蓝色为止(若工作需延至次日测糖，则溶液暂勿中和，以防止微生物作用)。将已中和的糖液洗入250ml容量瓶中，用水定容，过滤得清液，即可测定其中还原糖量。测定步骤按1.1.1进行。 结果计算：淀粉%=还原糖(mg)取用量倍数/样品重(mg)、0.9100注释：加入淀粉酶时，若三角瓶内溶液温度高于55，若到7075，酶活性将大大降低，或将完全失去作用。因此保温温度必须严格控制于4555。酶水解保温时间因样品种类而异。有的样品如马铃薯淀粉的酶水解可延至5昼夜。糖化后的滤液100ml加入20%HCl10ml，为使溶液最后达2%HCl酸度，也可用其它浓度如25%HCl
22、调节。1.3 植物中粗纤维的测定(酸碱洗涤重量法)纤维是植物细胞壁的主要成分，常与木质素、半纤维素、果胶物质等伴生。同淀粉一样，纤维也是由葡萄糖聚合而成，但纤维素中的葡萄糖由1，4糖苷键连接，纤维素分子内和分子间都可形成氢键，因此它的理化性质较稳定。测定纤维素的洗涤法就是根据其化学性质稳定而用酸碱或洗涤剂将样品中的其他成分如淀粉、蛋白质等除去后而用重量法测定的。酸碱洗涤法测定纤维时，尚有部分木质素、半纤维素等留在纤维素中，另外纤维素本身也受到一定损失，因此将测定值称为“粗纤维含量”。用酸性洗涤剂的重量法测定时，所得的“酸性洗涤纤维”(ADF)包括了全部纤维素和木质素，因此通常测定结果比酸碱洗涤
23、重量法高。对食品和饲料而言，粗纤维是泛指食物中不被消化、分解和吸收的部分。因此酸性洗涤剂法的测定结果更有意义。本实验介绍酸碱洗涤重量法，该法系谷物籽粒(1986)、饲料(1987)和水果、蔬菜(1989)粗纤维测定的国家标准。方法原理样品相继与一定浓度的酸碱共煮一定时间，并分别经过滤分离，洗涤残留物等操作。酸可将糖、淀粉、果胶物质和部分半纤维素水解而除去。碱能溶解蛋白质、部分半纤维素、木质素和皂化脂肪酸而将其除去。残渣再经乙醚、乙醇处理后，所得残渣干燥后减去灰分质量即为粗纤维含量。试剂(1)1.25%硫酸溶液C(1/2H2SO4)=0.2550.005mol/L溶液浓度须经标定。(2)1.25
24、%氢氧化钠溶液C(NaOH)=0.3130.005mol/L溶液浓度须经标定。(3)95%乙醇(化学纯)(4)无水乙醚(化学纯)(5)石棉 将中等长度的酸洗石棉铺于蒸发器皿中，放在600马福炉中灼烧16h后，加入1.25%H2SO4沸煮30min，过滤，洗净酸，同样加1.25%NaOH煮沸30min，过滤，用1.25%H2SO4洗一次，再用水洗净，烘干后于600马福炉中灼烧2h。石棉用后可回收再用。 操作步骤称取23g风干样称准至0.0002g、0.84mm(20目)于500ml带有冷凝器的高形杯或三角瓶中(若样品水分含量高，将称样于80烘箱中干燥蒸发掉大部分水分，若脂肪1%时，用乙醚多次浸泡
25、，最后除去乙醚)。加入沸腾的1.25%H2SO4溶液200ml,装上冷凝器，立即加热，使其在12min内微沸，准确微沸301min后停止加热，将扎有200目尼龙筛绢的抽滤管插入试样液中，在10min内抽尽酸液，再用热水洗涤残渣至溶液呈中性(蓝石蕊不变色)后抽净洗液。用沸腾的1.25%NaOH溶液将抽滤管尼龙筛绢上的残渣冲洗入烧杯，加入1.25%NaOH溶液200ml，装上冷凝器立即加热，使其在12min内微沸，微沸30min，停止加热，同上法在10min内抽去碱液并用热水洗涤残渣至溶液呈中性(红色石蕊不变色)后抽净洗液。残渣用水冲洗到烧杯内，并转移到铺有石棉的古氏坩埚中，在抽滤瓶上抽尽水分，用95%乙醇洗三次，每次约20ml，再用乙醚洗三次，每次20ml(脱脂样品不用乙醚再洗)。将装有纤维的古氏坩埚于130下干燥2h，在干燥器中冷却约30min至室温后称量(m1)，将坩埚在600马福炉内灼烧30min，同上冷却后称量(m2)结果计算粗纤维%=(m1-m2)100/m0式中m1古氏坩埚+粗纤维+残渣中灰分(g)m2古氏坩埚+残渣中灰分(g)m0干样质量(扣除水分后的样重量)(g)注释(1)为了保持酸、碱浓度加热过程不致因水分蒸发而增加，应用带有冷凝球的烧杯或冷凝管的三角瓶来加热(2)如果溶液微沸时起泡较多，可预先加入几滴消泡剂如正辛醇等。