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1、 基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,并通过在生物体外进行DNA 重组等技术，赋予生物以新的遗传特性,从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术.（一）基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程实质（原理）结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人们需要的新的生物类型和生物产品人们需要的新的生物类型和生物产品切割 拼接 导入 表达基因重组基因工程的若干问题:DNA重组技术(基因工程)的 基本工具做工程是需要工具的.一、限制性核酸内切酶（限制酶）“分子手术刀
2、”主要来源及种类：原核生物、约4000种1.限制酶“分子手术刀”作用：能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间(此处叫“切点”)的磷酸二酯键断开(注意:不是氢键).注意:一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并且只能在一个特定的切点上切割DNA分子。即：特异性.(注意:特异性表现在两个方面.)作用部位在DNA的骨架上限制酶的特异性表现在:特定的脱氧核苷酸序列 特定的切点.AATTGCCTTAAGDNA双链及“磷酸二酯键”磷酸二酯键 1.大肠杆菌(EcoR)的一种限制酶能识别的脱氧核苷酸序列是(用碱基表示)_;切点在_之间。限制酶看图回答:GAATTC
3、G和A在G和A之间被限制酶切断的是化学键是_.EcoR 黏性末端黏性末端Go back Go backEcoR 黏性末端黏性末端Go back Go backSma 平末端平末端平末端平末端 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，产生相同黏性末端吗？会产生相同的黏性末端.思考:DNA连接酶“分子缝合针”DNA连接酶将DNA片段之间的缝隙“缝合”起来，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。DNA连接酶作用部位在DNA骨架上互补的黏性末端的碱基通过氢键连接成碱基对，DNA连接酶的种类(根据来源分)及其在功能上的异同.-见课文P5.来源功能同异名称E.ColiDNA连接酶T4DN
4、A连接酶大肠杆菌T4噬菌体形成磷酸二酯键只能:互补的黏性末端黏性末端和平末端均可 异:DNA连接酶:是将几个DNA片段连接起来;不需DNA模板.DNA聚合酶:则是将脱氧核苷酸连接(聚合)成DNA;需以DNA的一条链为模板.提示:注意比较基因工程中的DNA连接酶和DNA复制中的DNA聚合酶的作用有何异同?同:两种酶都是形成磷酸二酯键.-导入过程需要运输“目的基因”的工具运载体。注意:一般地,不能将目的基因直接导入受体细胞.三、“分子运输车基因进入受体细胞的运载体需要的条件：有1多个限制酶切点，供外源基因插入其中对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制，提供大量的目的基因有某些标记基因，鉴定鉴定受
5、体细胞中是否有重组重组DNADNA，便于筛选，便于筛选常用运载体：细菌的质粒 噬菌体或某些动植物病毒假如目的基因导入受体细胞后不能复制，转基因生物能有预想的效果吗？作为分子运输车载体，如果没有切割位点行吗？霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？载有目的基因的载体有没有进入受体细胞，肉眼看不到，如何去鉴定它是否进入？什么是质粒?是一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体(即原核的DNA)之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子.质粒是基因工程最常用的载体.小结:质粒是小型、环状的DNA分子.基因工程的基本操作程序主要包括四个基本步骤：1）目的基因的获取2）“基因表达载体”的构建
6、3）将目的基因导入受体细胞(即“转化”)4）目的基因的检测与鉴定步骤一：目的基因的获取什么叫目的基因?主要是指编码蛋白质的结构基因.获取目的基因的途径有哪些?1.从“基因文库”中获取.2.利用“PCR技术”扩增.3.直接人工合成(适合于基因较小且已知其核苷酸顺序)-见课文.共三条.从基因文库中获取“目的基因”：什么叫“基因文库”?分为:1.基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.2.部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.如cDNA文库.将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含
7、有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library)类似从图书馆里取书.利用PCR技术扩增“目的基因”.1.概念:PCR即“聚合酶链式反应”,是一种在生物体外复制特定DNA片断的技术.2.原理:DNA的半保留复制.3.过程:(见图).4.优点:大量获取目的基因.(指数式扩增,近2n)提示:PCR的基本操作(过程):PCR是一种反复循环的DNA合成反应过程,其基本反应有三个步骤：1.变性:通过加热(高温)使模板DNA完全变性成为单链,同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除.2.退火:将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；3.延伸:将温度升高,热稳定DNA聚合酶(即
8、耐高温)以脱氧核苷酸为原料催化合成DNA链延伸.以上三步为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的.提示与思考:1.图中的“模板DNA”就是已知核苷酸序列的2.引物是人工合成的,与模板DNA(即目的基因)互补3.加热的作用是使_.4.聚合酶(Tap酶)是指_(选:DNA聚合酶;RNA聚合酶),其特点是_.5.原料是_.6.每扩增一次,目的基因的数目增加_.DNA解链目的基因每循环(扩增)一次,就需要添加 引物.两个人工合成目的基因 如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接合成。1.通过反转录法合成:又分为:目
9、的基因的mRNA(已知)单链DNA双链DNA(即目的基因)反转录反转录合成合成2.直接合成.根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因化学合成化学合成提示“基因表达载体”就是已插入 的载体.目的基因基因表达载体的构建 3.启动子:是有特殊结构的DNA片断,位于目的基因的首端,是RNA聚合酶的识别和结合的部位.有它才能驱动目的基因转录出MRNA.最终获得蛋白质.(不是复制!)4.终止子:位于目的基因
10、的尾端.作用是终止转录.5.标记基因:是为了鉴别受体细胞里是否已经含有目的基因,从而将含目的基因的细胞筛选出来.如“抗生素基因”、“荧光标记基因”等.6.复制原点是载体复制(不是转录)时的起点.什么叫转化?将目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定(如复制)和表达(即转录、翻译为特定蛋白质及表现特定性状等)的过程.提示:注意,目的基因是随着基因表达载体被导入受体细胞的,而不是被单独导入的.步骤三：转化-将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞-.农杆菌转化法提示:(1)农杆菌及农杆菌转化法:农杆菌是土壤中的一种细菌.能感染双子叶植物和裸子植物.其细胞里含Ti质粒,该质粒上含有一
11、段DNA叫“T-DNA”(叫“可转移的DNA”).将目的基因插入到该“T-DNA”中,通过使农杆菌感染植物,而将目的基因转化入植物细胞并将其插入到植物细胞中的染色体的DNA上.(2)将目的基因导入植物细胞的方法还有:基因枪法和花粉通道法.2.将目的基因导入动物细胞-显微注射法.用口径为1m的DNA注射器，将大量目的基因片段(注意:是含目的基因的“基因表达载体”,而不是裸的目的基因)注入到受精卵的核内，然后把经过注射的受精卵移植到另一只雌性动物的子宫内，使受精卵发育为转基因动物。什么叫显微注射技术？1）将细菌用，以增大细菌 的通透性。2）使含有目的基因的 进入受体细胞。3）目的基因在受体细胞内，
12、随其繁殖而复制，由于细菌 的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。CaCl2处理重组DNA繁殖3.将目的基因导入微生物细胞感受态细胞法.大肠杆菌细胞是最常用的微生物受体细胞细胞壁 通过转化以后,目的基因是否真正插入到了受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达呢?这只有通过检测、鉴定才能得知.提示:目的基因的检测与鉴定检测鉴定检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定方法方法-方法DNA分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）抗原抗体杂交DNA分子杂交原理：DNA分子杂交是基因诊断最基本的方法之一。其基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用一段已知基因的核苷酸序列作为探针，与被测基因进行接触，若两者的碱基完全配对成双链，则表明被测基因中含有已知的基因序列。基因探针只能和_(选:目的基因;非目的基因)杂交.例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。-个体生物学水平的鉴定检测目的基因是否翻译成蛋白质