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1、第二章第二章 生物制药工艺技术基础生物制药工艺技术基础工艺基础第二章生化药物生化药物微生物药物微生物药物重组重组DNADNA药物药物天然生物天然生物材料材料选材选材提取提取分离纯化分离纯化精品精品微生物菌微生物菌种种构建基因构建基因工程菌工程菌发酵发酵提取提取分离纯化分离纯化精品精品发酵发酵提取提取分离纯化分离纯化精品精品工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节第一节第一节 生化制药物工艺技术基础生化制药物工艺技术基础生物材料生化药物？选材提取粗制精制工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节一、生物材料的选择：一、生物材料的选择：原则：原则：目的物含量高，易获得，易提取，无害目的物含量
2、高，易获得，易提取，无害需考虑的问题：需考虑的问题：种属、发育生长阶段、原料的环境、种属、发育生长阶段、原料的环境、生物状态生物状态注意的问题：注意的问题：生物材料的采集与质控，包括：品种鉴生物材料的采集与质控，包括：品种鉴 定、防止污染与感染、定、防止污染与感染、冷冻保存冷冻保存工艺基础第二章一、生物材料的选择1.生物材料来源生物材料来源动物脏器；血液、分泌物及其他代谢物；海洋生物；植物；微生物2.生物生物材料采集与质控材料采集与质控鉴定（物种）有效成分含量高避免污染、腐败变质冷冻保存工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节二、二、生物活性物质生物活性物质常用的提取方法与优化常用的提取方
3、法与优化（一（一）几种常用提取方法）几种常用提取方法 1酸、碱、盐水溶液提取方法酸、碱、盐水溶液提取方法2 2表面活性剂提取方法表面活性剂提取方法3 3有机溶剂提取有机溶剂提取 4 4.双水相萃取双水相萃取法法 5 5超临界萃取法超临界萃取法工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节（二）提取方法与优化（二）提取方法与优化1.溶剂选择溶剂选择2.选择添加剂选择添加剂 保护剂；酶抑制剂3.提取条件提取条件温度；pH；盐；表面活性剂工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节三浓缩与干燥三浓缩与干燥 1.1.浓缩方法：浓缩方法：盐析盐析；有机溶剂沉淀；葡聚糖凝胶浓缩；聚乙二醇浓缩 超滤超滤；真空
4、浓缩真空浓缩或薄膜浓缩 （书（书P31页）页）工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节2.2.干干 燥燥低温真空干燥；喷雾干燥；冷冻干燥冷冻干燥工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节四、分离纯化四、分离纯化1.生化制药工艺中分离纯化特点生化制药工艺中分离纯化特点:(1)生物材料组成复杂 (2)目的物含量低 (3)易变性易变性、失活 (4)分离方法有很大经验成分 (5)步骤多，逐级分离 (6)产品验证与化学上纯度概念不完全相同工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节2.分离纯化原理：分离纯化原理
5、：纯化纯化 根据目的蛋白与杂质之间的差异进行纯化。根据目的蛋白与杂质之间的差异进行纯化。1.1.根据蛋白质的根据蛋白质的pIpI的不同进行纯化，其方法有：的不同进行纯化，其方法有：1 1）pIpI沉淀法沉淀法 2 2）pIpI沉淀法与盐析法相结合沉淀法与盐析法相结合 3 3）等电聚焦法）等电聚焦法 2.2.蛋白质分子形状和大小的不同进行纯化，其方法有蛋白质分子形状和大小的不同进行纯化，其方法有 1 1）凝胶过滤）凝胶过滤 2 2）超滤法）超滤法 3 3）离心法离心法 4 4）透析法）透析法3.3.蛋白质的溶解度不同进行纯化，其方法有：蛋白质的溶解度不同进行纯化，其方法有：1)1)盐溶与盐析法盐
6、溶与盐析法 2 2）结晶法）结晶法 3 3）有机溶剂沉淀法）有机溶剂沉淀法4.4.蛋白质电离性质不同进行分离：离子交换法蛋白质电离性质不同进行分离：离子交换法5.5.蛋白质功能专一性不同进行纯化：亲和层析法、假亲和层析法蛋白质功能专一性不同进行纯化：亲和层析法、假亲和层析法6.6.蛋白质在溶剂系统中分配不同进行纯化：萃取法蛋白质在溶剂系统中分配不同进行纯化：萃取法7.7.蛋白质的选择性吸附的性质进行纯化：吸附法蛋白质的选择性吸附的性质进行纯化：吸附法工艺基础第二章3.分离纯化方法的选择分离纯化方法的选择（1）分离纯化的早期使用方法的选择）分离纯化的早期使用方法的选择特点：特点：提取液中的物质十
7、分复杂，目的蛋白浓度较稀。提取液中的物质十分复杂，目的蛋白浓度较稀。方法选择原则方法选择原则：低分辨能力到高分辨能力，而且负荷量较大为合适。低分辨能力到高分辨能力，而且负荷量较大为合适。（2）各种分离纯化方法的使用程序）各种分离纯化方法的使用程序原则原则：相同性质的纯化方法一般不重复使用。纯化方法顺序先后的安排上要相同性质的纯化方法一般不重复使用。纯化方法顺序先后的安排上要考虑到有利于减少工序，提高效率。考虑到有利于减少工序，提高效率。（3）分离纯化后期的保护性措施）分离纯化后期的保护性措施（4）对每一步骤方法的优势进行综合评价）对每一步骤方法的优势进行综合评价 每一个分离纯化步骤方法的好坏，
8、除了从分辨每一个分离纯化步骤方法的好坏，除了从分辨本领和重现性二方面考虑外，本领和重现性二方面考虑外，还注意方法本身的还注意方法本身的回收率的高低。回收率的高低。工艺基础第二章生化药物生化药物微生物药物微生物药物重组重组DNADNA药物药物天然生物天然生物材料材料选材选材提取提取分离纯化分离纯化精品精品微生物菌微生物菌种种构建基因构建基因工程菌工程菌发酵发酵提取提取分离纯化分离纯化精品精品发酵发酵提取提取分离纯化分离纯化精品精品工艺基础第二章第二节第二节 微生物制药工艺技术基础微生物制药工艺技术基础工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节一、菌种的选育与保藏一、菌种的选育与保藏 (一一)菌
9、种的选育菌种的选育1 1自然选育自然选育 依据自发突变自发突变原理，通过不断分离筛选，除去衰变菌落，选择高产菌，达到强化、复壮、稳定生产目的。方法：方法：（1 1）平板划线法）平板划线法 （2 2）稀释平板法）稀释平板法工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节2诱变育种诱变育种（1）出发菌株的选择）出发菌株的选择 稳定性稳定性；具备某种优良性状的菌株；对诱变剂敏感；生理状态及生长时间（2）诱变处理）诱变处理 化学诱变；物理诱变；生物诱变（3）筛选：）筛选：随机筛选；半理性化筛选工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节突变株筛选流程突变株筛选流程第一轮第一轮一个出发菌株诱变处理诱变处理2
10、00个单细胞菌株初初 筛筛每株1瓶50株复复 筛筛每株4瓶5株工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节突变株筛选流程突变株筛选流程第二轮第二轮5个出发菌株诱变处理诱变处理40株40株40株40株40株初初 筛筛每株1瓶50株复复 筛筛每株4瓶5株第第三三第第四四轮轮同同第第二二轮轮工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节3、现代菌种选育技术、现代菌种选育技术 杂交育种 原生质体融合原生质体融合 基因工程技术 工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节（二）菌种保存（二）菌种保存1.保存目的：防止退化保存目的：防止退化2.菌种退化检查方法菌种退化检查方法 单位容积中发酵液的活性物质含量
11、；琼脂平皿上的单菌落形态；不同培养时期菌体细胞的形态和主要遗传特征。如形成孢子能力；发酵过程的pH变动情况；发酵液的气味、色泽。工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节4.菌种保藏方法：菌种保藏方法：斜面低温保存 液体石蜡封藏法 甘油冷冻法 冷冻干燥法 液氮保藏法工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节二、微生物的培养（一）微生物生长所需六大营养要素（一）微生物生长所需六大营养要素碳源氮源能源生长因子无机盐水工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节（二）微生物培养基1.按成分来源：合成培养基，天然培养基2.按培养基状态：固体，半固体，液体3.按培养基用途：孢子培养基种子培养基发酵培
12、养基工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节（三）培养基与发酵设备的灭菌蒸汽灭菌法蒸汽灭菌法实罐灭菌（实消）；空罐灭菌（空消）；连续灭菌（连消）工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节（四）微生物的培养1.培养装置培养装置 恒温箱 震荡培养器 发酵罐等工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节2.培养方法培养方法 固体培养法固体培养法 斜面培养；平板培养；穿刺培养 液体培养法液体培养法 静置培养 振荡培养 通气搅拌培养工艺基础第二章1.发酵过程的变化规律发酵过程的变化规律（1）分批发酵：分批发酵：指在一封闭培养系统内含有初始限制量的基指在一
13、封闭培养系统内含有初始限制量的基质的发酵方法。经过质的发酵方法。经过4个期：迟滞期（也称迟缓期）、对数生长期、个期：迟滞期（也称迟缓期）、对数生长期、减速期（也称衰减期）和稳定期（也称静止期）。减速期（也称衰减期）和稳定期（也称静止期）。（2）补料分批发酵：补料分批发酵：指在分批培养过程中，连续地或间歇地指在分批培养过程中，连续地或间歇地补加培养基（或某营养成分），不从发酵罐中间断地放出培养液。补加培养基（或某营养成分），不从发酵罐中间断地放出培养液。（3）连续发酵：连续发酵：指培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出指培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的发酵液的过程。含有产品的发酵液的
14、过程。三、发酵工程技术基础三、发酵工程技术基础工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节2.发酵过程的重要影响参数与控制发酵过程的重要影响参数与控制 （1）温度的影响及与控制温度的影响及与控制 （2）pH的影响与控制的影响与控制 （3）溶氧的影响与控制溶氧的影响与控制 （4）二氧化碳的影响与控制）二氧化碳的影响与控制 （5）泡沫的影响与控制）泡沫的影响与控制 工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节第三节第三节 生物技术药物制造技术基础生物技术药物制造技术基础工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节一、一、基因工程制药技术基础基因工程制药技术基础基因工程药物制造过程基因工程药物制造过
15、程工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节基因工程制药上游主要过程基因工程制药上游主要过程（1）获得目的基因；（2）构建DNA重组体；（3）将重组体导入宿主细胞；（4）工程菌的克隆与鉴定；（5）目的基因扩增与蛋白表达。略过略过工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节质粒DNA外源DNA酶切酶切质粒染色体引入受体由细胞分裂来增殖基因工程操作过程模式图工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节基因工程主要操作技术基因工程主要操作技术1目的基因的获得目的基因的获得（1）cDNA文库文库 纯化目的mRNA，逆转录成cDNA mRNA的分离 cDNA
16、第一链的合成 cDNA第二链的合成 cDNA与载体连接 转染或转化 筛选目的克隆工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节（2）PCR法或逆转录法或逆转录PCR（RT-PCR）典型PCR反应包括：模板变性 94以上(12)退 火 5055(12)延 伸 72 (12)在高温聚合酶作用下，以DNA单链 为模板，由引物起始从53延伸。工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节（3）化学合成法）化学合成法 在已知DNA序列或多肽的一般结构时，如链长在 60bp100bp可用化学合成法直接合成DNA。工艺基础第
17、二章第一节第二节第三节第四节第五节2DNA重组体的构建重组体的构建根据宿主菌不同，选择根据宿主菌不同，选择基因载体基因载体（VectorVector）（1 1）E.coliE.coli质粒非表达型质粒非表达型 pBR322，表达型pUC，实用型pBV220，PET系统，噬菌体DNA作为载体，非表达型gt10，表达型gt11。（2 2）芽孢杆菌）芽孢杆菌 pUB110 pE194pUB110 pE194和和pC194pC194（3 3）链）链 霉霉 菌菌 pIJ101 pSG5pIJ101 pSG5 cDNA与载体连接方法：同聚尾连接法 人工接头连接法工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节
18、3重组体的表达系统重组体的表达系统（1）原核表达系统）原核表达系统 E.coli；芽孢杆菌Bacillus；链霉菌Streptomyces 优点：易大量生产，成本低，周期短 缺点：多为胞内表达、提取困难，易生成包含体、含起始密码Met(AUG)，有内毒素毒性工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节（2）真核表达系统）真核表达系统 酵母表达 毕赤酵母（pichia psatoris）受甲醇诱导 优点：易培养无毒性，易高密度发酵（100g/L），高表达，成本低，产物可糖基化，有分泌表达。动物细胞 哺乳动物细胞CHO（仓鼠细胞）昆虫细胞家蚕细胞工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节4表达产
19、物的纯化表达产物的纯化（目的蛋白的分离纯化）（目的蛋白的分离纯化）工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节包含体包含体(inclusion bodies(inclusion bodies):大部分是表达产物（还有细胞蛋白和膜蛋白），一级结构正确、无活性，不溶于水，可用变溶剂SDS尿素，盐酸胍溶解，再稀释透析除去变性剂，使其复性。为防止或减少包含体的形成常用方法：（1）降低培养温度,从37降到30可显著降低包含体形成率；（2）以硫氧还原蛋白为载体进行融合表达。工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节二、酶工程制药技术基础二、酶工程制药技术基础 1.1.酶工程酶工程(enzyme engi
20、neering)(enzyme engineering)酶学与工程学互相渗透结合发展形成的生物技术，从应用目的出发，研究酶和应用酶的特异催化酶和应用酶的特异催化功能功能，并通过工程化过程将相应原料转化成所需产并通过工程化过程将相应原料转化成所需产物的技术物的技术。酶工程主要包括酶的生产、分离、纯化、酶的固定化、固定化酶的反应器、固定化酶的应用。工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节 2 2、固定化酶、固定化酶(immobilized enzyme)(immobilized enzyme)借助于物理和化学的方法把酶束缚在一定空间内并具有催化活性的酶制剂，包括固定化酶和固定化细胞两类。优点：
21、优点：（1）固定化后酶的稳定性提高（2）可重复使用、提高使用效率、降低成本（3）提高强度，便于连续、自动、规模化生产（4）反应后，酶的底物产物易分开，便于产物的分离、纯化3 3、固定化酶的制备方法、固定化酶的制备方法（1 1）吸附法吸附法：分为物理吸附法和离子吸附法；：分为物理吸附法和离子吸附法；（2 2）包埋法包埋法：网格型（凝胶、纤维），微囊型（人工细胞）；：网格型（凝胶、纤维），微囊型（人工细胞）；（3 3）共价键结合法共价键结合法：酶分子与载体分子，通过化学偶联使：酶分子与载体分子，通过化学偶联使酶与载体共价结合；酶与载体共价结合；（4 4）交联法交联法：用交联剂将酶分子交联固定化。：
22、用交联剂将酶分子交联固定化。工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节4 4、固定化酶的性质改变、固定化酶的性质改变 酶活力下降酶活力下降 ：空间结构、活性中心酶稳定性增加：酶稳定性增加：对温度、pH、酶变性剂和抑制剂的耐受程度等酶学特性的变化酶学特性的变化 ：底物专一性、最适pH、最适温度、动力学常数、最大反应速度等工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节5 5、固定化细胞、固定化细胞 （1）概念：）概念：将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞细胞固定化固定化，被固定的细胞称为固定化细胞（固定化细胞（immobilized cell）。（2）第二代固定化酶）第二代固定化酶，利用的
23、是细胞内的酶和酶系。（3）固定化细胞的方法）固定化细胞的方法：包埋法、载体结合法、交联法等（4）固定化细胞的优势）固定化细胞的优势：工艺简单，不需要酶的制备分离；酶的稳定性好；充分利用细胞内的酶和多酶体系，催化能力强。工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节第四节第四节 生物制药工艺中试放大设计生物制药工艺中试放大设计工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节自主学习，回答问题自主学习，回答问题1.1.什么是中试？中试的目的是什么？什么是中试？中试的目的是什么？2.2.中试的规模怎样？中试的规模怎样？3.3.中试放大的方法有哪些？中试放大的方法有哪些？工艺基础第二章第一节第二节第三节第四
24、节第五节自主学习自主学习第五节第五节 生物药物的研究与新药申报生物药物的研究与新药申报工艺基础第二章第一节第二节第三节第四节第五节第二章内容小结第第二二章章生生物物制制药药工工艺艺基基础础1.生化制药工艺基础生化制药工艺基础2.微生物制药工艺基础微生物制药工艺基础3.生物技术药物工艺基础生物技术药物工艺基础4.生物制造工艺中试放大生物制造工艺中试放大1.了解生化制药一般过程了解生化制药一般过程2.掌握提取、掌握提取、浓缩浓缩、干燥干燥等工艺等工艺1.了解微生物制药一般过程了解微生物制药一般过程2.掌握掌握菌种保藏菌种保藏、菌种选育菌种选育及及筛选等工艺筛选等工艺1.掌握基因工程技术原理和一掌握基因工程技术原理和一 般过程般过程2.掌握酶工程制药工艺基础掌握酶工程制药工艺基础3.掌握掌握固定化酶固定化酶、载体、宿主、载体、宿主等概念等概念1.了解中试放大的目的了解中试放大的目的2.了解中试放大的方法了解中试放大的方法5.生物药物研究与新药申报生物药物研究与新药申报了解生物新药研究过程了解生物新药研究过程