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1、基因工程菌的构建-真核细胞表达系统 学习目标熟悉并掌握如何构建有效的真核表达系统理解并识记不同类真核表达体系的优缺点原核VS真核n原核表达系统缺点：缺乏合适的转录后加工机制，不宜表达真核生物基因组基因 缺乏合适的翻译后加工机制，表达产物不能适当折叠和修饰；很难表达大量的可溶性蛋白，不利于纯化n真核表达系统优点：具有转录后加工能力，外源基因是cDNA或基因组DNA均可具有蛋白质折叠和翻译后加工系统可使重组蛋白分泌表达，有利于纯化n真核表达系统缺点：真核细胞生长缓慢，操作复杂，产物量比较低，生产成本比较高等酵母表达系统n常用酵母表达系统：n酿酒酵母，裂殖酵母，甲醇酵母，克鲁维酵母n甲醇酵母表达系统
2、：以甲醇为唯一碳源和能源n巴斯德毕赤酵母优点：使用甲醇脱氢酶启动子，使用甲醇强烈诱导，转录效率比较高；表达质粒容易被整合到毕赤酵母的基因组中，基因稳定不容易丢失；转录后修饰外源蛋白可以分泌表达蛋白表达量高AOXFLD1pFDH昆虫表达系统n病毒转染，利用昆虫细胞和杆状病毒载体来表达外源蛋白，昆虫杆状病毒系统n优点：允许表达较大的外源基因，可同时表达多个外源基因有效进行翻译后修饰胞内表达和分泌型表达易于培养且生长速度快，无需二氧化碳甚至血清，产量高昆虫宿主专一性，生物安全性高哺乳动物细胞表达系统n优点：重组蛋白实现精确折叠，形成正确构象完成复杂的的蛋白质翻译后加工更好分泌外源蛋白目的蛋白不易降解n缺点：操作技术要求高细胞生长慢表达效率较低成本高放大生产困难n分类瞬时表达系统稳定表达系统诱导表达系统工程细胞株筛选n生物学实验是“概率性事件”n加压筛选遗传标记编码产物物筛选药物物作用机理作用机理APH-氨基糖苷磷酸转移酶G418APH灭活G418DHFR二氢叶酸还原酶氨甲喋呤DHFR変体抗氨甲碟呤HPH-潮霉素B磷酸转移酶潮霉素BHPH灭活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷激酶氨甲喋呤TK合成TMPXGPRT-黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤木酮糖苷 ADA-灭活Xyl-A感谢聆听