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1、第三章第三章 预处理和固液分离预处理和固液分离预处理第三章第一节第二节第三节知识回顾1.基因工程制药上游技术包括哪几个？2.固定化酶的主要方法有哪些？预处理第三章第三章 生物材料的预处理和液固分离预处理第三章第一节第一节 生物材料的预处理生物材料的预处理第二节第二节 细胞破碎细胞破碎第三节第三节 液液固分离固分离了解生物材料预处理的目了解生物材料预处理的目的，掌握去除杂蛋白和金的，掌握去除杂蛋白和金属离子的方法和原理属离子的方法和原理掌握常用细胞破碎的方法，掌握常用细胞破碎的方法，各种方法的优缺点和适用各种方法的优缺点和适用范围范围了解液固分离的方法和设了解液固分离的方法和设备备本章内容本章内
2、容知识目标知识目标预处理第三章第一节第二节第三节第一节第一节 生物材料的预处理生物材料的预处理预处理第三章第一节第二节第三节为什么要对生物材料进行预处理？为什么要对生物材料进行预处理？生物材料的特点：生物材料的特点：1.活性物质含量低，杂质多活性物质含量低，杂质多 2.易变性失活易变性失活 预预处处理理的的目目的的在在于于去去除除杂杂质质和和稳稳定定滤滤液液性性质质，以以利于提取和精制的后续工艺顺利进行利于提取和精制的后续工艺顺利进行预处理第三章第一节第二节第三节一、选择预处理方法的依据一、选择预处理方法的依据 1.生物活性物质来源和存在状态生物活性物质来源和存在状态:胞内 、胞外、前体2.后
3、续工艺要求后续工艺要求3.目的物的稳定性目的物的稳定性 影响生物活性的条件：酶，溶液酸碱度、重金属离子、机械搅拌、温度、空气和光等。预处理第三章第一节第二节第三节二、动物材料的预处理二、动物材料的预处理 组织：用绞肉机将组织绞成糜细胞：匀浆、组织捣碎、反复冻融等预处理第三章第一节第二节第三节三、细胞培养液的预处理三、细胞培养液的预处理（一）杂蛋白质的去除（一）杂蛋白质的去除 1、加入凝聚剂 2、加入絮凝剂 3、吸附 4、等电点沉淀 5、加各种沉淀剂沉淀 6、变性沉淀预处理第三章第一节第二节第三节1 1、凝聚、凝聚(coagulation)(coagulation)凝聚作用是指在某些电解质电解质
4、作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。预处理第三章第一节第二节第三节凝聚的原理凝聚的原理在发酵液中加入具有相反电性的电解质：在发酵液中加入具有相反电性的电解质：中和胶粒电性，降低双电层排斥力。中和胶粒电性，降低双电层排斥力。离子的水化作用，破坏胶粒的水化层。离子的水化作用，破坏胶粒的水化层。预处理第三章第一节第二节第三节影响凝聚作用的主要因素：无机盐的种类、化合价以及无机盐的用量等。阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+常用的凝聚剂有：Al2(SO4)318H2O、AlCl36H2O
5、、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等 思考：影响凝聚作用的因素？思考：影响凝聚作用的因素？预处理第三章第一节第二节第三节2 2、絮凝、絮凝 (flocculation)(flocculation)絮凝剂是天然的或人工合成的有机高分子化合物，具有长链线状的结构长链线状的结构，易溶于水易溶于水，其分子量可高达数万至一千万以上，在长的链上含有相当多的活性含有相当多的活性功能团。功能团。常用絮凝剂：壳聚糖、海藻酸钠、明胶及酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物和聚丙烯酸类等。预处理第三章第一节第二节第三节预处理第三章第一节第二节第三节影响絮凝效果的因素主要有：影响絮凝效果的因素主要有：（1）絮凝剂的分子量；
6、（2）絮凝剂的用量；（3）溶液pH值；（4）搅拌速度和时间预处理第三章第一节第二节第三节3 3、吸附、吸附 直接加入吸附剂，如活性炭；加入反应物，利用其生成的沉淀物来吸附蛋白质，使其凝固 2K4Fe(CN)6+3ZnSO4K2Zn3Fe(CN)62+3K2SO4氯化钙氯化钙+磷酸盐磷酸盐 磷酸钙盐磷酸钙盐预处理第三章第一节第二节第三节4.4.变性沉淀变性沉淀(物理、化学）物理、化学）5.5.等电点（等电点（PIPI）沉淀）沉淀6.6.加入沉淀剂加入沉淀剂预处理第三章第一节第二节第三节（二）多糖的去除（二）多糖的去除加入酶使多糖转化为单糖加入阳离子表面活性剂（CTAB，CPC）形成络合物（三）高
7、价金属离子去除（三）高价金属离子去除离子交换法沉淀法 Ca2+，Mg2+，Fe3+预处理第三章第一节第二节第三节第二节第二节 细胞破碎（细胞破碎（cell disruptioncell disruption）预处理第三章第一节第二节第三节细胞破碎细胞破碎细胞破碎（细胞破碎（cell disruptioncell disruption）技术是指利用外力破技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物充分释放出来的坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物充分释放出来的技术。技术。随着随着重组重组DNADNA技术和组织培养技术技术和组织培养技术的重大进展，以前的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规
8、模生产。认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。概述预处理第三章第一节第二节第三节一、机械法一、机械法 1 1、匀浆法、匀浆法 2 2、珠磨法、珠磨法 3 3、超声波、超声波三、化学法三、化学法 1 1、化学试剂处理、化学试剂处理 2 2、酶解法、酶解法 3 3、制成丙酮粉、制成丙酮粉二、物理法二、物理法 1 1、干燥、干燥 2 2、冻融、冻融 3 3、渗透压冲击、渗透压冲击预处理第三章第一节第二节第三节一、机械法（一）高压匀浆器（一）高压匀浆器（High pressure homogenizer)预处理第三章第一节第二节第三节预处理第三章第一节第二节第三节预处理第三章第一节第二节第三节高压匀
9、浆法适用的范围：酵母酵母和和大多数细菌大多数细菌细胞的破碎。细胞的破碎。料液细胞浓度可达到料液细胞浓度可达到20%左右。左右。团状和丝状菌易造成高压匀浆器的堵塞，不宜使团状和丝状菌易造成高压匀浆器的堵塞，不宜使用高压匀浆法。用高压匀浆法。预处理第三章第一节第二节第三节高压匀浆法使用注意事项高压匀浆器的操作温度上升约高压匀浆器的操作温度上升约-/10MPa/10MPa为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却冷却处理。处理。预处理第三章第一节第二节第三节（二）高速珠磨机（二）高速珠磨机（High speed bead High speed bead mi
10、llmill）预处理第三章第一节第二节第三节预处理第三章第一节第二节第三节高速珠磨机工作原理 磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻璃小珠相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起。预处理第三章第一节第二节第三节（三）超声波破碎（三）超声波破碎（Ultrasonication）预处理第三章第一节第二节第三节超声波振荡器工作原理当超声波在液体中传播时，出现细小的空穴，随之产生大量不稳定的气泡。空穴泡在超声波的继续作用下，又迅速闭合，产生极为强烈的冲击波压力，对悬浮细胞产生切应力切应力，促使其内部液体发生流动，而使细胞破碎。预处理第三章第一节第二节
11、第三节二、物理法（一）干燥法（一）干燥法 空气干燥、真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥空气干燥、真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥（二）反复冻融法（二）反复冻融法 缺点：提取效率低，缺点：提取效率低，10%左右左右（三）渗透压冲击法（三）渗透压冲击法 缺点：提取效率低，缺点：提取效率低，4-7%；不适用于革兰氏阳性菌不适用于革兰氏阳性菌预处理第三章第一节第二节第三节三、化学法（一）加入化学试剂（一）加入化学试剂 用碱处理用碱处理 用脂溶性有机溶剂用脂溶性有机溶剂 表面活性剂表面活性剂（二）酶解法（二）酶解法 溶菌酶，细胞蛋白酶，纤维蛋白酶，蜗牛酶，壳溶菌酶，细胞蛋白酶，纤维蛋白酶，蜗牛酶，壳聚糖酶等聚糖酶
12、等（三）制成丙酮粉（三）制成丙酮粉预处理第三章第一节第二节第三节四、选择破碎方法的依据（一）规模及成本 工业规模：高压匀浆和珠磨（二）目的物的稳定性（三）破碎效果和产物释放率预处理第三章第一节第二节第三节预处理第三章第一节第二节第三节预处理第三章第一节第二节第三节第三节第三节 液液-固分离固分离预处理第三章第一节第二节第三节（一）过滤方式（一）过滤方式 常规过滤常规过滤 错流过滤错流过滤一、过滤预处理第三章第一节第二节第三节错流过滤预处理第三章第一节第二节第三节（二）过滤设备1、板框过滤机、板框过滤机预处理第三章第一节第二节第三节2 2、真空鼓式过滤机、真空鼓式过滤机预处理第三章第一节第二节第
13、三节二、离心分离1、过滤式离心机预处理第三章第一节第二节第三节2、沉降式离心机预处理第三章第一节第二节第三节3、管式离心机、管式离心机预处理第三章第一节第二节第三节三、影响液-固分离的因素（一）悬浮物种类（一）悬浮物种类（二）悬浮液黏度（二）悬浮液黏度（三）其他因素（三）其他因素预处理第三章第一节第二节第三节第三章内容小结第第三三章章预预处处理理与与固固液液分分离离1.生物材料的预处理2.细胞破碎3.固液分离1.了解预处理的目的2.掌握去除杂蛋白去除杂蛋白和金属离金属离子子的方法和原理1.掌握常用细胞破碎的方法2.掌握各种方法的优缺点优缺点和适用范围适用范围3.掌握高压匀浆法高压匀浆法、高速珠高速珠磨法磨法、超声波法超声波法、酶法酶法破壁等概念1.了解固液分离的方法2.了解固液分离常用设备预处理第三章第一节第二节第三节复习思考题1.去除发酵液中杂蛋白有哪几种方法？2.去除发酵液中钙、镁、铁离子的方法有哪些？3.影响絮凝效果的主要因素有哪些？4.细胞破碎有哪些方法？各有什么特点？5.超声波破碎细胞的原理？6.术语：凝聚作用，絮凝作用，错流过滤，渗透压冲击法