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1、 ICS 65.020.01 CCS B 16 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 2956 2023 马铃薯干 腐 病菌PCR 检测方 法 Detection of pathogenic fungus for potato dry rot by PCR method 2023-04-26 发布 2023-05-26 实施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 2956 2023 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 原理.1 5 试 剂与 仪器.1 试剂.1 溶液 配制.1 仪器.2 6 操 作步 骤.2 对
2、照 的设 立.2 取样.2 马铃 薯组 织样 品 DNA 提取.2 PCR 扩增.2 7 琼 脂糖 凝胶 电泳.3 8 结果.3 试验 成立 的条 件.3 结果 判定.3 DB15/T 2956 2023 II 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。本文件 由内 蒙古 自治 区农 牧厅提 出。本文件 由内 蒙古 自治 区马 铃薯标 准化 技术 委员 会（SAM/TC 40）归口。本文件 起草 单位：内蒙 古 自治区 产品 质量 检验 研究 院、内蒙 古中 加农 业生 物 科技有 限公 司、乌 兰察
3、布市检 验检 测中 心、内蒙 古朱日 和镇 综合 保障 和技 术推广 中心。本文件 主要 起草 人：刘晓 权、赵 莉、张 键、吕文 霞、高俊、齐桂 敏、任 玮、赵欣、孙翠 翠、孙 辉远、姜涛、王 斌、常 青、李燕、田 艳花、包美 丽、刘广 晶、连普 琛、俎 爱忠、毕 晓宇、董 林峰、李建 青、姬媛琦、陈曦、胡 越然、王 勐。DB15/T 2956 2023 1 马铃薯干 腐病 菌 PCR 检测方法 1 范围 本文件 规定 了马 铃薯 干腐 病菌PCR 检 测方 法。本文件 适用 于马 铃薯 块茎 中干腐 病菌 的检 测。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用
4、 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。马铃薯 干腐 病 potato dry rot 由镰刀 菌属（Fusarium spp.）真 菌引 起的 病害。该 病在马 铃薯 生长 期和 贮藏 期均可 发生，主 要 危害块茎，病斑 多发 生于薯 块脐部。发病 初期 薯块表 面出现 黑褐色 凹陷 病斑，随后扩 大形成 轮纹
5、状褶皱；后期薯 块内部 变空，整个 薯块变 硬、变 轻、干缩，呈灰褐 色或深 褐色，干燥 时薯块 内部长 满白 色菌丝；湿度大 时发 病处 变红 呈糊 状。4 原理 本文件 采用 聚合 酶链 式反 应（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法 检测 马 铃薯干 腐病 菌。其 原理是：以马 铃薯 干腐 病菌 保守序 列设 计特 异性 引物，以基 因组 DNA 为模 板，在Taq DNA 聚合 酶的 作用 下进行PCR 扩 增，根据PCR 扩 增 结果判 断该 样品 中是 否含 有目的 片段，从 而达 到鉴 定 马铃薯 干腐 病菌 的目 的。5 试剂与 仪器 试剂 5.1.
6、1 以下所 有试 剂，除另 有规 定外，均使 用分 析纯 试剂；水为 符 合 GB/T 6682 中 规定的 一级 水。5.1.2 植物基 因组 提取 试剂 盒、2 Taq PCR Master Mix、无 水乙醇、50 TAE 电泳 缓冲 液、溴化 乙锭、DNA Marker、6 DNA Loading Buffer 等 均从 试剂 公 司购买。溶液配 制 DB15/T 2956 2023 2 5.2.1 1TAE 电 泳缓 冲液 量取50 TAE 电 泳缓 冲液20 mL，加水 定容 至1 L。5.2.2 1.5%琼 脂糖 凝胶 称取1.5 g 琼脂 糖，加入100 mL 的1 TAE 电
7、 泳缓 冲液，微波炉 加热 至琼 脂糖 融化，待溶液 冷却 至50 左右时，加 入5 L 溴化 乙 锭溶液，摇 匀，倒入 制胶 板中均 匀铺 板，凝固 后取 下梳子，备 用。5.2.3 溴化乙 锭溶 液（10 mg/mL）称取溴 化乙 锭100 mg，加 水溶解，定 容至10 mL。仪器 PCR仪、台 式高 速离 心机（离心力1180 g 12470 g）、电 泳仪、水 平电 泳槽、凝 胶成像 仪、水 浴锅、移液器、高 压蒸 汽灭 菌锅、4 冰箱、普 通天 平（感量0.01 g）。6 操作步 骤 对照的 设立 检测体 系以 马铃 薯干 腐病 菌的DNA 作 为阳 性对 照，以 不添加DNA 模
8、板 的反 应体 系 作为阴 性对 照。取样 一块地 取发 病马 铃薯 块茎 组织，将样品 保存 于4 冰箱中，DNA 提取 时将 马铃 薯块茎 组织 切成0.1 g见方小 块，样品 需现 用现 取。马铃薯 组织 样 品DNA 提取 将样品 置于 灭过 菌的 研钵 中，加 液氮 研磨 成粉 末，转至1.5 mL 离 心管，利 用 植物基 因组DNA 提取 试剂盒提 取。PCR 扩增 6.4.1 PCR 扩 增引 物 以核糖 体5.8S rDNA 和28S rDNA 基因 的间 隔序 列ITS:（Intergenic Transcribed Spacer）设计 引物，引 物序 列如 下：上游 引
9、物：5-TTGGTTGTAGCTGGTCTATTT-3。下游引 物：5-TATCACGCTGAGTGGAACCA-3。扩增片 段为309 bp。用超纯 水将 上、下游 引物 分别配 制成 工作 浓度 为10 ng/L 的溶 液。6.4.2 PCR 反 应体 系 马铃薯 干腐病 菌PCR 扩增 反 应体系 如表1 所示，按照 以 下顺序 加入相 应试 剂到PCR 管中，混匀并 离心10 s，使混 合液 都沉 降到PCR 管底。DB15/T 2956 2023 3 表1 PCR 扩 增反 应体 系 PCR反应物 加入PCR反应体系的体积 uL ddH2O 9.5 2 Taq PCR Master
10、Mix 12.5 上游引物（10 ng/L）1.0 下游引物（10 ng/L）1.0 模板 DNA 1.0 总体积 25.0 6.4.3 PCR 反 应程 序 第1步：94，4 min。第2步：94，40 s；61，40 s；72，20 s，28个循 环。第3步：72，7 min。PCR 产 物置 于4 冰 箱保 存 备用。7 琼脂糖 凝胶 电泳 使用1.5%的 琼脂 糖凝 胶，取5 L PCR 扩 增产 物，加 到1 L 6 DNA Loading Buffer 中混 匀、上 样，用DNA Marker 作 为分 子量 标记，进行 凝胶 电泳。电 泳结束 后在 凝胶 成像 仪的 紫外透 射光 下观 察，凝胶 上是否出 现预 期大 小的 特异 性DNA 条带，并 拍照 记录。8 结果 试验成 立的 条件 阳性对 照检 测到 预期 大小 的特异 性扩 增条 带，阴性 对照没 有条 带，表明 试验 有效。结果判 定 若待检 样品 在309 bp 对应 位置出 现特 异性 条带，则 判定样 品为 阳性；若 待检 样品没 有出 现条 带，则判定为 阴性。