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1、高中生物选修 3 1 1.2 基因工程的基本操作程序 学习目标 1.掌握从基因文库中获取目的基因的方法。(重难点)2.理解基因表达载体的构建是基因工程的核心。(重难点)3.掌握将目的基因导入受体细胞的方法。(重点)4.掌握目的基因检测与鉴定的方法。(重难点)|基础知识|基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。其中，基因工程的核心是基因表达载体的构建。一、目的基因的获取 1.目的基因：主要是指编码蛋白质的基因。2.获取方法(1)从基因文库中获取目的基因 a.基因文库：将含有某种生物不同基因的
2、许多 DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。b.种类 基因组文库：包含了一种生物所有的基因。部分基因文库：只包含了一种生物的一部分基因。c.提取依据：根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物 mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。(2)利用 PCR 技术扩增目的基因 a.PCR 含义：PCR 是一项在生物体外复制特定 DNA 片段的核酸合成技术。b.PCR 原理：DNA 双链复制。c.过程 高中生物选修 3 2 d.结果：每一次循环后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，n
3、为扩增循环的次数)。(3)人工合成法：如果基因较小，核苷酸序列又已知，可以通过 DNA 合成仪用化学方法直接人工合成。二、基因表达载体的构建 1.构建目的(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；(2)使目的基因能够表达和发挥作用。2.组成目的基因启动子位置：基因的首端功能：是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA终止子 位置：基因的尾端功能：终止转录标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因 三、将目的基因导入受体细胞 1.转化的概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.将目的基因导入植物细胞(1)农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶
4、植物和裸子植物常用的方法。(2)基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。(3)花粉管通道法：我国科学家独创的一种方法。3.将目的基因导入动物细胞(1)方法：显微注射技术。(2)常用的受体细胞：受精卵。4.将目的基因导入微生物细胞(1)方法：用 Ca2处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中 DNA 分子的生理高中生物选修 3 3 状态(这种细胞称为感受态细胞)。(2)受体细胞：原核生物(使用最广泛的是大肠杆菌)。(3)选择原核生物作为受体细胞的原因：繁殖快，多为单细胞、遗传物质相对较少等。四、目的基因的检测与鉴定 方法 分子水平检测 是否导入DNA 分子 检测转基因生物的 DNA 上是否
5、插入了目的基因。检测方法是采用 DNA 分子杂交技术 是否转录出mRNA 检测目的基因是否转录出了 mRNA。检测方法是采用分子杂交技术 是否翻译成蛋白质 检测目的基因是否翻译成蛋白质。检测方法是采用抗原抗体杂交技术 个体生物学水平的鉴定 除了分子检测外，有时还需要进行个体生物学水平的鉴定，如做抗虫或抗病的接种实验等|自查自纠|1.所有的目的基因都可以从基因文库中获取。()2.Taq 酶是用 PCR 仪对 DNA 分子扩增过程中常用的一种耐高温的 DNA 连接酶。()3.基因表达载体中含有启动子和密码子。()4.棉花植株受到损伤时，伤口处细胞会分泌酚类化合物，吸引农杆菌，引起植株感染。()5.
6、Ti 质粒上的 TDNA 可与植物受体细胞的染色体 DNA 整合在一起。()6.检测转基因生物的 DNA 上是否插入目的基因，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。()7.目的基因的检测和鉴定过程中，分子水平的检测方法都是DNA 分子杂交技术。()8.基因工程的四个步骤中都涉及碱基互补配对原则。()|图解图说|高中生物选修 3 4 基因工程的操作 PCR 技术扩增目的基因 限制酶破坏的 DNA 中的哪种化学键？提示：核苷酸之间的磷酸二酯键 归纳 常用受体细胞 导入方法 转基因动物 受精卵 显微注射法 转基因植物 体细胞 农杆菌转化法(主要适用于双子叶植物、裸子植物)基因枪法(单子叶)转基因
7、微生物 大肠杆菌 感受态细胞转化法 高中生物选修 3 5 农杆菌转化法是不是适用于将目的基因导入各种植物？提示：不是，主要适用于双子叶植物和裸子植物。探究点一 获取目的基因及基因表达载体的构建 1.目的基因的获取(1)你能推测由 mRNA 反转录形成 cDNA 的过程大致分为哪些步骤吗？提示 第一步，反转录酶以 mRNA 为模板合成一条与 mRNA 互补的 DNA 单链，形成 RNADNA 杂交分子；第二步，核酸酶使 RNADNA 杂交分子中的 RNA链降解，使之变成单链的 DNA；第三步，以单链 DNA 为模板，在 DNA 聚合酶的作用下合成另一条互补的 DNA 链，形成双链 DNA 分子。
8、(2)PCR 技术与 DNA 复制的比较 PCR 技术 DNA 复制 相 同 点 原理 DNA 双链复制(碱基互补配对)原料 四种游离的脱氧核苷酸 条件 模板、ATP、酶、引物等 不 同 点 解旋方式 DNA 在高温下变性解旋 解旋酶催化 场所 体外复制 主要在细胞核内 酶 Taq 酶 细胞内含有的 DNA 聚合酶 结果 在短时间内形成大量的 DNA片段 形成整个 DNA 分子 2.基因表达载体的构建(1)作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？提示 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子等。高中生物选修 3 6(2)启动子和
9、起始密码子有什么区别？终止子和终止密码子有什么区别？提示 启动子和终止子都是一段的 DNA 序列，分别位于基因的首端和尾端，分别负责调控基因转录的开始和结束。而起始密码子和终止密码子都是 mRNA 上的三个相连的碱基序列，分别决定翻译的起始和终止。(3)为什么处理目的基因和载体(质粒)的限制酶一般是同一种限制酶？提示 用同一种限制酶处理可以获得同一种黏性末端，以便于将二者连接起来。几种目的基因获取方法的比较 方法 从基因文库中获取 人工合成 从基因组文库中获取 从部分基因文库，如cDNA 文库中获取 化学合成法 反转录法 过程 【典例 1】下图是利用基因工程技术生产可食用疫苗的部分过程，其中
10、Pst、Sma、EcoR、Apa为四种限制性核酸内切酶。下列有关说法中正确的是()高中生物选修 3 7 A.图示过程是基因工程的核心步骤，所需的限制性核酸内切酶均来自原核生物 B.图示中构建基因表达载体时，需用到一种限制性核酸内切酶 C.一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列 D.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 解析 图示表示基因表达载体的构建过程，这是基因工程的核心步骤，所需的限制性核酸内切酶一般来自原核生物，A 错误；此表达载体构建时需要用到EcoR、Pst限制性核酸内切酶，B 错误；限制酶具有特异性，即一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷
11、酸序列并在特定的位点切割，C 错误；卡那霉素抗性基因作为标记基因，主要作用是筛选含有目的基因的受体细胞，D正确。答案 D【跟踪训练】用 PCR 技术将 DNA 分子中的 A1片段进行扩增，设计了引物、，其连接部位如图所示，X 为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分 DNA 片段是图中的()解析 利用 PCR 技术将 DNA 分子中的 A1片段进行扩增，当引物与母链通过高中生物选修 3 8 碱基互补配对结合后，子链延伸的方向总是从 5 端到 3 端，据此依题意和图示分析可知，扩增后得到的绝大部分DNA 片段如图 D 所示。答案 D 探究点二 将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定 如图为
12、抗虫棉的培育过程，请据图回答下列问题：(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？提示 目的基因是 Bt 毒蛋白基因，载体是 Ti 质粒。用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的黏性末端，便于构建基因表达载体。(2)该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的 DNA 上？提示 采用的方法是农杆菌转化法，由于 Ti 质粒上的 TDNA 可整合到受体细胞的染色体 DNA 上，而目的基因又插入到了 TDNA 上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体 DNA 上。(3)该实例中，检测目的基因是否表达常见的方法有
13、哪两种？提示 抗原抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。目的基因的检测与鉴定的方法汇总 高中生物选修 3 9 【典例 2】在检测抗虫棉培育是否成功的方法中，不属于分子水平检测的是()A.观察害虫吃棉叶后是否死亡 B.检测目的基因片段与 DNA 探针能否形成杂交带 C.检测目的基因转录形成的 mRNA 与 DNA 探针能否形成杂交带 D.检测目的基因表达产物能否与特定抗体形成杂交带 解析 A 项属于个体水平的鉴定，不是分子水平的检测；B 项属于分子水平的检测，利用的是 DNA 分子杂交技术，观察目的基因能否与 DNA 探针进行杂交形成杂交带；C 项属于分子水平的检测，利用的是 DNAmRNA 分子杂交技
14、术，观察目的基因转录形成的 mRNA 能否与 DNA 探针进行杂交形成杂交带；D 项属于分子水平的检测，利用的是抗原抗体杂交的原理，检测基因表达产物能否与特定抗体形成杂交带。答案 A 知识脉络 要点晨背 高中生物选修 3 10 1.基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。2.目的基因获取的方法有从基因文库中获取、利用 PCR 技术扩增等方法。3.基因表达载体包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等。4.目的基因导入植物受体细胞的方式有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法等；导入动物细胞的方法有显微注射法。5.目的基因导入微生物时要用 Ca2处理，使微生物的细胞处于感受态。6.检测目的基因是否导
15、入受体细胞的DNA 上，采用 DNA 分子杂交技术；检测目的基因是否转录，采用分子杂交技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质，采取抗原抗体杂交技术。1.在目的基因比较小，核苷酸序列又已知的情况下，获取目的基因最方便的方法是()A.化学合成法 B.基因组文库法 C.cDNA 文库法 D.多聚酶链式反应法 解析 在目的基因比较小，核苷酸序列又已知的情况下常采用化学合成法人工合成目的基因。答案 A 2.在基因工程的基本操作程序中，目的基因的获取途径不包括()A.从基因文库中获取目的基因 B.利用 PCR 技术扩增目的基因 高中生物选修 3 11 C.人工合成目的基因 D.利用 DNA 分子杂交技术，获取
16、目的基因 解析 获取目的基因有以下几种方法：从基因文库中获取目的基因；利用PCR 技术扩增目的基因；利用人工合成的方法获取目的基因。答案 D 3.细菌常常作为基因工程的受体细胞，其主要原因是()A.形体微小 B.结构简单 C.容易鉴别 D.繁殖速度快 解析 细菌常常作为基因工程的受体细胞首先细菌繁殖较快，当条件适宜时，细菌每 2030 分钟繁殖一次，故科学家选择细菌作为转基因的对象，能够在较短时间内通过细菌的大量繁殖来获得所需要的产品，D 正确。答案 D 4.将目的基因导入玉米茎尖分生区细胞和小鼠受精卵，常用的方法分别是()A.显微注射技术 农杆菌转化法 B.基因枪法 花粉管通道法 C.农杆菌
17、转化法 显微注射技术 D.基因枪法 显微注射技术 解析 玉米是单子叶植物，目的基因导入单子叶植物常用的方法是基因枪法；对于动物细胞来说，常用的方法是显微注射技术。答案 D 5.要检测受体 DNA 中是否成功插入了目的基因，需要用基因探针，这里的基因探针是指()A.用于检测疾病的医疗器械 B.带标记的与目的基因互补的核酸序列 C.带标记的蛋白质分子 D.人工合成的免疫球蛋白 解析 本题中基因探针是指用放射性同位素或荧光分子标记的与目的基因互高中生物选修 3 12 补的核酸序列，利用碱基互补配对原则，检测目的基因是否导入受体细胞的 DNA中。答案 B 6.下列一般不作为基因工程中的标记基因的是()A.四环素抗性基因 B.绿色荧光蛋白基因 C.产物具有颜色反应的基因 D.贮藏蛋白的基因 解析 标记基因位于运载体(质粒)上，以利于重组 DNA 的鉴定和选择，如四环素抗性基因、绿色荧光蛋白基因、产物具有颜色反应的基因等。答案 D