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1、食品蛋白质的测定食品蛋白质的测定20130809一、测定意义 蛋白质是生命的物质基础,蛋白质是食品重要的营养指标。二、测定方法凯氏定氮法 多种方法来测定食品中的蛋白质含量,如凯氏定氮法、水杨酸比色法、紫外分光光度法、Lowry法等。最基本、最常用、最可靠的方法是凯氏定氮法。凯氏定氮法1、原理 总氮含量，乘以转换系数，间接求出蛋白质含量。2、凯氏定氮分类 分常量凯氏定氮法、半微量凯氏定氮法、微量凯氏定氮法。按取样量（蒸馏时，所取样液相当于样品的量）：常量凯氏定氮法500mg；半微量凯氏定氮法100-500mg；微量凯氏定氮法10-100mg。按所用装置：(图3-16,3-16,3-17,3-18
2、 常量凯氏定氮装置、微量凯氏定氮装置常量凯氏定氮装置、微量凯氏定氮装置半微量凯氏定氮 装置凯氏定氮法方法提要凯氏定氮法测定蛋白质含量分四步：即消化、蒸馏与吸收、滴定、计算。(1)消化 消化反应 消化装置(3-16,3-19)2）蒸馏与吸收（3）滴定 指示剂：溴甲酚绿甲基红（5：1），酒红（酸式色）灰色（变色点）兰色（碱式色）；次甲基蓝甲基红（1：2），紫红（酸式色）兰紫色（变色点）绿色（碱式色）。（4）计算其中：0.0141亳摩尔盐酸相当于氮的克数 M：标准盐酸的摩尔浓度。W：每份样品的克数。F：蛋白质换算系数，又称氮-蛋白质换算系数。多数蛋白质换算系为数6.25。不同的食品采用不同的换算系数
3、。见下表：4、凯氏定氮法的特点及适用范围（1）费时，操作复杂；测定食品蛋白质的最准确的方法，作标准方法；半自动化、全自动化阶段。（2）本法测定的为粗蛋白 非蛋白氮 纯蛋白质的定量（3）消化用H2SO4，不用HNO3和HClO4。食品脂肪的测定20130809测定脂肪的意义测定脂肪的意义食品中的脂肪主要包括脂肪（甘油三酸食品中的脂肪主要包括脂肪（甘油三酸酯）类脂化合物（脂肪酸、糖酯和甾醇）。酯）类脂化合物（脂肪酸、糖酯和甾醇）。脂肪是食品中具有最高能量的营养素，也是脂肪是食品中具有最高能量的营养素，也是事物中的三大营养素之一，食品中脂肪含量事物中的三大营养素之一，食品中脂肪含量的高低是衡量食品营
4、养价值的指标之一。在的高低是衡量食品营养价值的指标之一。在食品加工生产过程中，加工的原料、半成品、食品加工生产过程中，加工的原料、半成品、成品的脂类含量对食品的风味、组织结构、成品的脂类含量对食品的风味、组织结构、品质、外观、口感等都有重要影响。品质、外观、口感等都有重要影响。测定脂肪测定脂肪方法（一）（一）*索氏提取法索氏提取法（二）（二）酸水解法酸水解法（三）（三）*罗紫罗紫-哥特里法哥特里法（碱性乙醚提取法）（碱性乙醚提取法）（四）（四）巴布科克法和盖勃法巴布科克法和盖勃法（五）（五）氯仿氯仿甲醇提取法甲醇提取法 过去测定脂肪普遍采用的是索式提取法，这种方法至今仍被认为是测定多种食品脂类
5、含量的代表性的方法，但对于某些样品测定结果往往偏低，而巴布科克法、益勒式法、罗斯-哥特里法主要用于乳、及乳制品中脂类的测定，而酸水解法测出的脂肪为游离态脂和结合脂全部脂类。适用范围与特点索氏提取法适用于脂类含量较高，结合态的脂类含量较少，能烘干磨细，不宜吸湿结块的样品的测定。此法只能测定游离态脂肪，而结合态脂肪无法测出，要想测出结合态脂肪需在一定条件下水解后变成为游离态的脂肪方能测出。另外此法是经典方法，对大多数样品结果比较可靠，但需要周期长，溶剂量大。提取常用试剂及其特点提取常用试剂及其特点乙醚：乙醚：溶解能力强，沸点低（溶解能力强，沸点低（34.6），易燃，），易燃，可含约可含约2%的水分
6、。因含水乙醚会同时抽出糖分等成的水分。因含水乙醚会同时抽出糖分等成分，所使用时，必须采用无水乙醚作提取剂，且待分，所使用时，必须采用无水乙醚作提取剂，且待测样品应无水分。测样品应无水分。乙醚不能溶解结合态脂肪。乙醚不能溶解结合态脂肪。石油醚：石油醚：溶解能力比乙醚弱，沸程溶解能力比乙醚弱，沸程3545，无，无乙醚易燃，吸水比乙醚少，乙醚易燃，吸水比乙醚少，也不能提取结合态脂肪。也不能提取结合态脂肪。氯仿甲醇混合液：氯仿甲醇混合液：价格高、毒性强、对脂蛋白、价格高、毒性强、对脂蛋白、磷脂提取效率高。磷脂提取效率高。罗紫罗紫哥特里法哥特里法GB5413.3第一法第一法此法为国际标准化组织（此法为国
7、际标准化组织（ISO），联合国粮农组织），联合国粮农组织/世界世界卫生组织（卫生组织（FAO/WHO）等采用，为乳、炼乳、奶粉、）等采用，为乳、炼乳、奶粉、奶油等脂类定量的国际标准法。奶油等脂类定量的国际标准法。它适用于各种液状乳它适用于各种液状乳（生乳、加工乳、部分脱脂乳、脱脂乳等）、各种炼乳、（生乳、加工乳、部分脱脂乳、脱脂乳等）、各种炼乳、奶粉、奶油及冰淇淋。除乳制品外，也适用于豆乳或加奶粉、奶油及冰淇淋。除乳制品外，也适用于豆乳或加工成乳状的食品。工成乳状的食品。本法适用于能在碱性溶液中溶解或至少能形成均匀混本法适用于能在碱性溶液中溶解或至少能形成均匀混悬胶体的样品，是乳品脂肪测定公认
8、的标准方法悬胶体的样品，是乳品脂肪测定公认的标准方法乳乳是是多多种种物物质质组组成成的的混混合合物物，它它不不是是简简单单的的分分散散体体系系，而而是是具具有有胶胶体体特特性性的的多多种种分分散散体体系系。故故在在乳乳脂脂类类测测定定中中，用用有有机机溶溶剂剂不不能能直直接接提提取取，而而必必须须先先行行破破坏坏胶胶体体状状态态进进而而破破坏坏脂脂肪肪球球膜膜，使使脂脂肪肪游游离离，再再用用有有机溶剂进行提取、定量。机溶剂进行提取、定量。1、原理、原理罗紫罗紫哥特里法的原理是利用破坏乳的胶体性状及脂肪球膜，使非脂成分溶哥特里法的原理是利用破坏乳的胶体性状及脂肪球膜，使非脂成分溶解于氨解于氨-乙
9、醇溶液中而脂肪游离出来，再用乙醚乙醇溶液中而脂肪游离出来，再用乙醚-石油醚提取出脂肪，蒸馏去石油醚提取出脂肪，蒸馏去除溶剂后，残留物即为乳脂。除溶剂后，残留物即为乳脂。2、仪器、仪器恒温水浴（恒温水浴（60-700C和和1000C）毛氏抽脂瓶毛氏抽脂瓶电热恒温烘箱（电热恒温烘箱（80-120）3、试剂试剂250g/L氨水（相对密度氨水（相对密度0.91）95%（体积分数）乙醇（体积分数）乙醇乙醚：不含过氧化物乙醚：不含过氧化物石油醚石油醚4、操作步骤 氨-乙醇处理 乙醚-石油醚提取 回收溶剂（1）仪器准备）仪器准备恒重三角瓶，恒重三角瓶，（2）抽提）抽提称取乳粉称取乳粉1克左右（或牛奶克左右（
10、或牛奶10克），放入毛氏抽脂瓶克），放入毛氏抽脂瓶中，乳粉加入中，乳粉加入10ml50-550C的水的水，混匀。加入，混匀。加入2ml氨水氨水，充分混合后立即放入充分混合后立即放入65 50C的水浴的水浴中，加热中，加热15-20分钟分钟。取出毛氏抽脂瓶，冷却至室温。加入取出毛氏抽脂瓶，冷却至室温。加入10ml乙醇乙醇，缓和并彻，缓和并彻底混合，加入两滴刚果红，再加入底混合，加入两滴刚果红，再加入25ml乙醚乙醚振摇振摇1min，再加入再加入25ml石油醚石油醚，震荡，震荡30秒秒.静至静至30min，待分层清晰，待分层清晰后，将有机层倒入至已恒重的接受瓶中。再加乙醚、石油后，将有机层倒入至已
11、恒重的接受瓶中。再加乙醚、石油醚（醚（2-3次）的次）的重复提取重复提取（每次用（每次用15ml），将），将有机层合并有机层合并于同一接受瓶中。于同一接受瓶中。（3）蒸发溶剂、烘干、称重）蒸发溶剂、烘干、称重将接受瓶放置将接受瓶放置1000C水浴中蒸去醚液后，置于水浴中蒸去醚液后，置于100-1050C烘箱干燥烘箱干燥2小时，取出置干燥器中，冷却室温后称量，反复小时，取出置干燥器中，冷却室温后称量，反复操作直至恒重。操作直至恒重。m25、结果计算、结果计算m2m1粗脂肪（粗脂肪（%）=x100m样样m2接受瓶和脂肪的质量，接受瓶和脂肪的质量，gm1接受瓶质量，接受瓶质量，gm样样样品质量，样品
12、质量，g巴布科克法和盖勃法1、原理、原理用浓硫酸溶解乳中的用浓硫酸溶解乳中的乳糖和蛋白质等非脂成乳糖和蛋白质等非脂成分，将牛奶中的酪蛋白钙分，将牛奶中的酪蛋白钙盐转变成可溶性的重硫酸盐转变成可溶性的重硫酸酪蛋白，使脂肪球膜被破酪蛋白，使脂肪球膜被破坏，脂肪游离出来，再利坏，脂肪游离出来，再利用加热离心，使脂肪完全用加热离心，使脂肪完全迅速分离，直接读取脂肪迅速分离，直接读取脂肪层的数值，便可知被测乳层的数值，便可知被测乳的含脂率。的含脂率。2、适应范围与特点、适应范围与特点这两种方法都是这两种方法都是测定乳脂肪的标准方法测定乳脂肪的标准方法，适用于鲜乳及乳制品脂肪的测定。对含糖多适用于鲜乳及乳
13、制品脂肪的测定。对含糖多的乳品（如甜炼乳、加糖乳粉等），采用此的乳品（如甜炼乳、加糖乳粉等），采用此方法时糖易焦化，使结果误差较大，故不适方法时糖易焦化，使结果误差较大，故不适宜。宜。此法操作简便，迅速。对大多数样品来说此法操作简便，迅速。对大多数样品来说测定精度可满足要求，但不如重量法准确。测定精度可满足要求，但不如重量法准确。3、仪器、仪器 巴布科克氏乳脂瓶：颈部刻度有0.08.0%，0.010.0%两种，最小刻度值为0.1%，盖勃氏乳脂计：颈部刻度为0.08.0%，最小刻度为0.1%乳脂离心机 盖勃氏离心机 标准移乳管4、试剂、试剂硫酸：相对密度1.8160.003（20C），相当于90
14、91%硫酸 异戊醇：相对密度0.8110.002（20C），沸程128132C。5、测定方法、测定方法精密吸取精密吸取17.6mL样品，倒入巴布科克氏乳脂瓶中，再取样品，倒入巴布科克氏乳脂瓶中，再取17.5mL硫酸，沿瓶硫酸，沿瓶颈缓缓注入瓶中，将瓶颈回旋，使液体充分混合，至无凝块并呈均匀棕色。颈缓缓注入瓶中，将瓶颈回旋，使液体充分混合，至无凝块并呈均匀棕色。置乳脂离心机上，以约置乳脂离心机上，以约1000r/min的速度离心的速度离心5min，取出，加入，取出，加入80C以上的以上的水至瓶颈基部，再置离心机中离心水至瓶颈基部，再置离心机中离心2min，取出后再加入，取出后再加入80C以上的水
15、至脂肪以上的水至脂肪浮到浮到2或或3刻度处，再置离心机中离心刻度处，再置离心机中离心1min，取出后置，取出后置5560C水溶中，水溶中，5min后立即读取脂肪层最高与最低点所占的格数，即为样品含脂肪的百分数。后立即读取脂肪层最高与最低点所占的格数，即为样品含脂肪的百分数。6、说明及讨论、说明及讨论硫酸的浓度要严格遵守规定的要求，如过浓会使乳硫酸的浓度要严格遵守规定的要求，如过浓会使乳炭化呈黑色溶液而影响读数；过稀则不能使酪蛋白完全溶炭化呈黑色溶液而影响读数；过稀则不能使酪蛋白完全溶解，会使测定值偏低或使脂肪层混浊。解，会使测定值偏低或使脂肪层混浊。硫酸硫酸除可除可破坏脂肪球膜，使脂肪游离出来
16、外，还可破坏脂肪球膜，使脂肪游离出来外，还可增加液体相对密度，使脂肪容易浮出。增加液体相对密度，使脂肪容易浮出。盖勃法中所用盖勃法中所用异戊醇异戊醇的作用是的作用是促使脂肪析出促使脂肪析出，并能，并能降低脂肪球的表面张力，以利于形成连续的脂肪层。降低脂肪球的表面张力，以利于形成连续的脂肪层。加热加热（6570C水浴中）和水浴中）和离心离心的目的是的目的是促使脂肪促使脂肪离析。离析。巴布科克法中采用巴布科克法中采用17.6ml标准吸管取样标准吸管取样，实际上注入巴，实际上注入巴氏瓶中的样品只有氏瓶中的样品只有17.5ml，牛乳的相对密度为，牛乳的相对密度为1.03，故样品重，故样品重量为量为17
17、.51.03=18g。巴氏瓶颈的刻度（。巴氏瓶颈的刻度（010%）共）共10个大个大格，每大格容积为格，每大格容积为0.2ml，在，在60C左右，脂肪的平均相对密度左右，脂肪的平均相对密度为为0.9，故当整个刻度部分充满脂肪时，其脂肪重量为，故当整个刻度部分充满脂肪时，其脂肪重量为0.2100.9=1.8g。18g样品中含有样品中含有1.8g脂肪，即瓶颈全部刻度脂肪，即瓶颈全部刻度表示为脂肪含量表示为脂肪含量10%，每一大格代表每一大格代表1%的脂肪。的脂肪。故瓶颈刻度故瓶颈刻度读数即为样品中脂肪百分含量。读数即为样品中脂肪百分含量。每组样品只取两格乳脂瓶进行测定。放入离心机时，必每组样品只取
18、两格乳脂瓶进行测定。放入离心机时，必须对称放置。须对称放置。硫酸的浓度和用量必须严格按照规定硫酸的浓度和用量必须严格按照规定，沿瓶壁缓慢加，沿瓶壁缓慢加入，回旋摇动，使充分混合入，回旋摇动，使充分混合，否则易时脂肪层产生黑色块粒。，否则易时脂肪层产生黑色块粒。氯仿氯仿-甲醇提取法甲醇提取法索氏提取法对包含在组织內部的脂肪等不能完全提取出来，酸分索氏提取法对包含在组织內部的脂肪等不能完全提取出来，酸分解法常使磷脂分接而损失。而在一定的水分存在下，极性的甲醇及非极性的解法常使磷脂分接而损失。而在一定的水分存在下，极性的甲醇及非极性的氯仿混合溶液却能有效地提取结合态脂类，如脂蛋白、蛋白脂等及磷脂，此
19、氯仿混合溶液却能有效地提取结合态脂类，如脂蛋白、蛋白脂等及磷脂，此法对于法对于高水分生物试样如鲜鱼、蛋类等脂类的测定更为有效。高水分生物试样如鲜鱼、蛋类等脂类的测定更为有效。1、原理、原理氯仿氯仿-甲醇提取法的原理是将试样分散于氯仿甲醇提取法的原理是将试样分散于氯仿-甲醇混合液中，于水浴上轻微沸腾，甲醇混合液中，于水浴上轻微沸腾，氯仿氯仿-甲醇混合液与一定的水分形成提取脂类的有效溶剂，在使试样组织中结合甲醇混合液与一定的水分形成提取脂类的有效溶剂，在使试样组织中结合态脂类游离出来的同时与磷脂等极性脂类的亲合性增大，从而有效地提取出全态脂类游离出来的同时与磷脂等极性脂类的亲合性增大，从而有效地提
20、取出全部脂类。再经过滤，除去非脂成分，然后回收溶剂，对于残留脂类要用石油醚部脂类。再经过滤，除去非脂成分，然后回收溶剂，对于残留脂类要用石油醚提取，定量。提取，定量。2、仪器、仪器具塞三角瓶具塞三角瓶电热恒温水浴：电热恒温水浴：501000C提取装置提取装置布氏漏斗：布氏漏斗：11G-3，过滤板直径，过滤板直径40mm，容量，容量60100mL具塞离心管具塞离心管离心机：离心机：3000r/min。3、试剂氯仿：氯仿：97%（体积分数）以上。（体积分数）以上。甲醇：甲醇：96%（体积分数）以上。（体积分数）以上。氯仿甲醇混合液：按氯仿甲醇混合液：按2：1体积比混合。体积比混合。石油醚。石油醚。
21、无水硫酸钠：以无水硫酸钠：以1201350C干燥干燥12h。4、操作步骤、操作步骤提取提取准确称取均匀样品准确称取均匀样品5g于具塞三角瓶内（高水分食品可于具塞三角瓶内（高水分食品可加适量硅藻土使其分散），加入加适量硅藻土使其分散），加入60mL氯仿氯仿-甲醇混合液（对甲醇混合液（对于干燥食品，可加入于干燥食品，可加入23mL水）。连接提取装置，于水）。连接提取装置，于650C水水浴中，由轻微沸腾开始，加热浴中，由轻微沸腾开始，加热1h进行提取。进行提取。回回收溶剂收溶剂提取结束后，取下烧瓶用布氏漏斗过滤，并用氯仿提取结束后，取下烧瓶用布氏漏斗过滤，并用氯仿-甲甲醇混合液洗涤滤器，烧瓶及滤器中
22、试样残渣，滤液、洗涤液醇混合液洗涤滤器，烧瓶及滤器中试样残渣，滤液、洗涤液一并收集于具塞三角瓶内，置一并收集于具塞三角瓶内，置65700C水浴中回收溶剂，至水浴中回收溶剂，至烧瓶内物料呈浓稠态，而不能使其干，然后冷却。烧瓶内物料呈浓稠态，而不能使其干，然后冷却。石油醚萃取、定量石油醚萃取、定量 用移液管加入用移液管加入25ml石油醚，然后加入石油醚，然后加入15g无水硫无水硫酸酸钠钠，立立即即加加塞塞混混摇摇1min，将将醚醚层层移移入入具具塞塞离离心心沉沉淀淀管管进进行行离离心心分分离离（3000r/min）5min.用用10mL移移液液管管加加入入迅迅速速吸吸取取离离心心管管中中澄澄清清的
23、的石石油油醚醚10mL,于于已已称称量量至至恒恒量量的的干干燥燥称称量量瓶瓶内内，蒸蒸发发去去除除石石油油醚醚，于于1001050C烘烘箱箱中中烘烘至至恒恒量量（约约30min）。）。5、结果计算 （m2m1）x 2.5总脂肪（%）=x 100 m m-试样质量，g;m2-称量瓶与脂类质量，g;m1-称量瓶质量，g;2.5-从25mL乙醇中取10mL进行干燥，故乘以系数2.5。6、本法适用范围：、本法适用范围：结合态脂肪类的食品（鱼结合态脂肪类的食品（鱼.大豆类）大豆类）乳和乳制品中非脂乳固体的测定 GB 5413.392010 1 范围生乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳、调制乳、发酵乳中非脂乳固体的测
24、定方法2 原理先分别测定出乳及乳制品中的总固体含量、脂肪含量（如添加了蔗糖等非乳成分含量，也应扣除），再用总固体减去脂肪和蔗糖等非乳成分含量，即为非脂乳固体。先分别测定出乳及乳制品中的总固体含量、脂肪含量（如添加了蔗糖等非乳成分含量，也应扣除），再用总固体减去脂肪和蔗糖等非乳成分含量，即为非脂乳固体。先分别测定出乳及乳制品中的总固体含量、脂肪含量（如添加了蔗糖等非乳成分含量，也应扣除），再用总固体减去脂肪和蔗糖等非乳成分含量，即为非脂乳固体。试剂和材料平底皿盒：高20 mm25 mm，直径50 mm70 mm的带盖不锈钢或铝皿盒，或玻璃称量皿。短玻璃棒：适合于皿盒的直径，可斜放在皿盒内，不影响
25、盖盖。石英砂或海砂：可通过500 m孔径的筛子，不能通过180 m孔径的筛子，并通过下列适用性测试：将约20 g的海砂同短玻棒一起放于一皿盒中，然后敞盖在100 2 的干燥箱中至少烘2 h。把皿盒盖盖后放入干燥器中冷却至室温后称量，准确至0.1 mg。用5 mL水将海砂润湿，用短玻棒混合海砂和水，将其再次放入干燥箱中干燥4 h。把皿盒盖盖后放入干燥器中冷却至室温后称量，精确至0.1 mg,两次称量的差不应超过0.5 mg。如果两次称量的质量差超过了0.5 mg，则需对海砂进行下面的处理后，才能使用：将海砂在体积分数为25%的盐酸溶液中浸泡3d，经常搅拌。尽可能地倾出上清液，用水洗涤海砂，直到中
26、性。在160 条件下加热海砂4 h。然后重复进行适用性测试仪器和设备 天平：感量为0.1 mg干燥箱。水浴锅。分析步骤 总固体的测定 在平底皿盒中加入20 g石英砂或海砂（4.3），在100 2 的干燥箱中干燥2 h，于干燥器冷却0.5 h，称量，并反复干燥至恒重。称取5.0 g（精确至0.0001 g）试样于恒重的皿内，置水浴上蒸干，擦去皿外的水渍，于100 2 干燥箱中干燥3 h，取出放入干燥器中冷却0.5 h，称量，再于100 2 干燥箱中干燥1 h，取出冷却后称量，至前后两次质量相差不超过1.0 mg。X=M1-M2*100M试样中总固体的含量按式（1）计算：式中：X试样中总固体的含量
27、，单位为克每百克（g/100g）；m1皿盒、海砂加试样干燥后质量，单位为克（g）；m2皿盒、海砂的质量，单位为克（g）；m试样的质量，单位为克（g）。脂肪的测定（按GB 5413.3中规定的方法测定）。蔗糖的测定（按GB 5413.5中规定的方法测定）。XNFT=X-X1-X2(2)式中：XNFT试样中非脂乳固体的含量，单位为克每百克（g/100g）；X试样中总固体的含量，单位为克每百克（g/100g）；X1试样中脂肪的含量，单位为克每百克（g/100g）；X2 试样中蔗糖的含量，单位为克每百克（g/100g）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。分析结果的表述42