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1、项目十一项目十一 红霉素（硫氰酸盐）红霉素（硫氰酸盐）生产工艺生产工艺l红霉素（erythromycin，Er）是红色糖多孢菌的次级代谢产物，其抗菌谱和青霉素G相似，特别对抗酸杆菌、革兰氏阳性细菌、大病毒及立克次氏体有抗菌活性。红霉素为十四元大环内酯类抗生素，其分子是由红霉素内酯、红霉素糖和脱氧氨基己糖三部分组成。一、概述一、概述l硫氰酸红霉素不仅是兽用抗生素，还是大环内酯类原料药的母核，是合成国际医药市场上十分畅销的三大半合成红霉素（阿奇霉素、罗红霉素和克拉霉素）的关键中间体原料，从而，奠定了硫氰酸红霉素在国际医药原料药市场上的强势地位。l我国早在上世纪60年代已开始生产红霉素，80年代末至
2、90年代初才开始试生产硫氰酸红霉素。进入21世纪，国际市场包括我国对硫氰酸红霉素需求的不断上升。二、红霉素生产工艺二、红霉素生产工艺l红霉素发酵是以红色链霉菌（streptomyces Erythreus）为生产菌种l发酵生产中的培养基主要采用淀粉和葡萄糖作为碳源，豆饼粉、玉米浆和硫酸铵等作为氮源。在发酵过程中，定量流加前体丙醇，根据pH变化流加液化糖，同时依据补糖量流加黄豆油。菌丝在代谢过程中不断分泌红霉素。经过8d左右发酵，菌丝产生一定数量红霉素后，开始衰老断裂，即可放罐提取。l红霉素是一种碱性抗生素，在碱性情况下易溶于醋酸丁酯等有机溶剂，而在酸性时溶于水中，可与某些无机酸和有机酸形成盐，
3、因此，主要采用溶媒萃取法提取。（一）菌种工艺（一）菌种工艺l1、斜面孢子制备 l菌种为红色糖多孢菌（EM61）。斜面培养基成分为：淀粉0.5%，葡萄糖0.5%，鱼胨0.5%，玉米浆0.1%（湿重），氯化钠1.0%，磷酸二氢钾0.015%，甜菜碱盐酸盐0.05%，氯化钙0.008%，微量元素溶液0.2mL/100mL，琼脂2.0%2.2%。消前pH7.0（20%KOH调整）。l斜面孢子特征：高产菌落边缘圆、灰色，中间凸起正中有凹陷、中间白色，个别有梅花型，扎根较深。斜面培养时间及其变化情况斜面培养时间及其变化情况培养时间/h菌落变化情况24 长出菌落48 菌落白色略带黄，背面无色素72 菌落白色
4、一片，边缘上部呈现底色96 背面上半部底色呈豆沙色或咖啡色，正面浅黄白色120 底色变深，浅豆沙色，下部有底色，正面白色144 底色加深，正面白色168 底色加深，正面白色逐渐呈灰色192 正面孢子丰满浅鼠灰红色，底色呈深豆沙色或深咖啡色l2、摇瓶菌丝制备 l培养基配比为：蔗糖3%，玉米浆1.6%，硫酸铵0.2%，碳酸钙0.7%，黄豆油0.5mL/300mL三角瓶，20%NaOH调pH5.5左右。培养条件：在34、220240rpm摇瓶机振荡培养24h左右。l1、种子罐和发酵罐培养基配比（二）发酵工艺（二）发酵工艺 原材料名称配比/%一级种子罐 二级种子罐发酵罐淀粉-3.23.0黄豆饼粉-3.
5、54.5玉米浆1.73.2-糊精-3.2-蔗糖3.0-氯化钠-0.5-碳酸钙0.60.70.60.8黄豆油0.61.10.7消沫剂-0.02计算体积/m3110100消前体积/m30.887578消后体积/m3199092l2、培养基灭菌l中、小罐及糖、油罐均采用实罐消毒方式进行灭菌，正丙醇采用闷消方式灭菌。发酵罐采用连消方式灭菌。项目小罐中罐大 罐糖化罐植物油正丙醇空消连消压力/MPa0.10.14 0.10.14 0.140.180.30.080.12 0.150.2 0.2(闷消)温度/120128120128128132128132115123130135118122时间/min303
6、0406035/m330356060l消毒时，小罐、中罐、油罐及糖罐均预热到7080再进汽。大罐配料时预热到6570时打料。正丙醇管道的消毒压力必须保持在0.2MPa，消毒45min。丙醇计量罐，一般每周消毒一次。油管道消毒压力0.2MPa，时间为45min左右。糖罐道消毒压力0.3MPa，时间为60min左右。项目一级种子罐二级种子罐发酵罐 糖罐总糖/%3.27.54.56 还原糖/%0.440.40.33540氨基氮/(mg/100mL)806050 pH6.16.66.87.83.5l3、一级种子培养l培养基灭菌后，罐温降至37时，采用微孔压差法将摇动瓶种子或孢子接入罐中培养。罐温全程控
7、制在340.5，通入无菌空气，空气流量0.81.0vvm，罐压0.05MPa，全程开搅拌，转速140rpm。培养过程中每过段时间需取样作无菌试验，测pH、PMV（指菌体沉淀物体积）值，10h后取样观察菌丝形态，30h开始测黏度。l培养33h左右菌丝形态呈网状，菌丝体粗壮，分枝少，染色深且均匀，PMV在12%以上，pH回升至6.6左右，无杂菌，即可移入二级种子罐。l4、二级种子罐培养 l培养基灭菌后，罐温降至34时，用压差法将符合质量要求的一级种子接入二级罐中。全程控制罐温340.5，空气流量保持0.81.0vvm，罐压控制0.050.06MPa，全程搅拌，转速130rpm。l培养过程中，每过段
8、时间需取样作无菌试验，测pH、PMV、粘度，观察菌丝形态。培养13h左右，镜检菌丝呈网状，菌丝体细、长、直、分枝少，染色均匀，PMV在20%以上，无杂菌，即可移入大罐。l5、发酵罐培养 l培养基灭菌后，罐温降到36时，将搅拌转速调到80rpm，空气流量调至3000m3/h，罐压维持在0.025MPa，调溶氧显示100%，然后停搅拌接种，接种后，罐温控制340.5，搅拌转速80rpm，空气流量3000m3/。l培养过程中控制溶氧、pH,并流加补入糖、醇、油，其原则是：l6、发酵过程菌丝形态生长变化 阶段菌丝形态生长变化阶段孢子吸水膨胀、发芽，长出分枝，分枝旺盛，美兰着色深，原生质充实，菌丝呈丛状
9、阶段菌丝长成丛状，延长交织成网状，菌丝体较粗壮，分枝少，染色深且均匀阶段菌丝呈网状，菌丝体细、长、直、分枝少，染色均匀阶段菌丝呈网状，菌丝分节，断节有空泡，染色较浅，同时有新生细长着色较深的菌丝长出。衰老的菌丝逐渐自溶，菌丝状态模糊，放罐应控制在菌丝大量自溶阶段l1、预处理 l将发酵液放入预处理罐，待放到一半时，开启搅拌和空气搅拌（如有空气搅拌），边放罐边加ZnSO4和15%20%的NaOH维持pH7.08.0，待发酵液放完时，加够ZnSO4，调节pH8.08.4。ZnSO4加入量控制在3%5%（w/v），并控制滤速在8mL/5min以上，ZnSO4尽量少加，然后进板框压滤机压滤。l发酵液预处
10、理工艺控制点:发酵液的碱化pH控制在8.08.4，滤液pH控制在7.58.0，温度2030，滤液单位25004000U/mL，NaOH配制浓度20%。（三）提取工艺（三）提取工艺 l2、萃取（采用二级逆流静态提取）l在提取罐中加入上批二级提取的丁酯（如是第一次，则加入新鲜丁酯），将已经用15%20%NaOH溶液调好pH10.10.1的碱化液（调碱后的滤液）打入提取罐中。边打边滴入2%的破乳剂。l打完后，开动空气搅拌810min。静置1h后分层，转出下层水相进入另一罐进行二级萃取（新鲜丁酯已经打入备提取用）。l上层丁酯相经碟片式高速离心机分离，分离出清亮透明丁酯相即为红霉素抽提轻液。l醋酸丁酯萃
11、取工艺控制要点：lpH以pH计测定为准，一级萃取pH 10.10.1，二级萃取pH 10.50.1；醋酸丁酯加入量一级按1/121/13（v/v）加入，二级按1/151/16（v/v）加入；抽提温度32左右；丁酯萃取液要求清亮，无明显乳化层。l3、成盐结晶 l将分离轻液打入结晶罐中，升温至43，加入1/10（v/v）的饱和食盐水搅拌洗涤15min，然后静置45min分层，分尽下层乳化层和水。连续洗涤三次。洗涤后，开动搅拌，缓缓加入已经配制好的硫氰酸钠溶液，先慢后快，控制加入时间不得少于45min。滴加入50%的冰醋酸溶液，调节pH4.64.8。先慢后快，控制加入至调好pH的时间不得少于45mi
12、n。继续搅拌30min后，停止搅拌，冷却降温，静置30min后，温度降到28以下，即可开始分离。l工艺控制要点为：轻液洗涤温度4043，用饱和食盐水洗涤；硫氰酸钠加量以滤液总亿为准，按0.2kg/十亿加入；成盐pH控制4.64.8，温度43左右；硫氰酸钠浓度配制成20%，冰醋酸浓度配制成50%。l4、分离洗涤 l将成盐结晶液放入抽滤缸真空抽滤。抽滤缸中的湿盐用适量新鲜丁酯浸泡挖洗，约10min后再真空抽干。将湿盐转入混洗缸中，加入11.5倍的热蒸馏水充分混洗，离心，再用热蒸馏水淋洗23次，直至洗出的蒸馏水表面无明显溶媒即可。l工艺控制要点：过滤后用新鲜丁酯泡洗一次；蒸馏水温度控制在5060。l5、干燥包装 l将湿盐放入喷雾干燥器中，通入7580的热空气加热干燥23h。干燥后，收入桶中密闭保存，同时称重，通知质控部门取样检验。检验合格，按质控部门的包装通知进行包装，然后办理成品入库。l工艺控制要点：空气必须经高效过滤膜过滤；控制空气温度在7580。