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1、实验九实验九 玻璃器皿的清洗包扎，玻璃器皿的清洗包扎，培养基的配制及灭菌培养基的配制及灭菌一、目的要求一、目的要求 l1 1、明确培养基的配制原理。、明确培养基的配制原理。l2 2、通过对牛肉膏蛋白胨培养基的配制，掌握配制、通过对牛肉膏蛋白胨培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。培养基的一般方法和步骤。l3 3、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围 l4 4、了解干热灭菌的原理和应用范围。、了解干热灭菌的原理和应用范围。l5 5、了解紫外线灭菌的原理和方法。、了解紫外线灭菌的原理和方法。l6 6、玻璃器皿的清洗包扎要熟练操作。、玻璃器皿的清洗包扎要
2、熟练操作。二、基本原理二、基本原理l牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。它含有牛肉膏、蛋白胨和它含有牛肉膏、蛋白胨和NaClNaCl。其中牛肉膏为。其中牛肉膏为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而提供氮源，而NaClNaCl提供无机盐。在配制固体培提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下常用浓度下9696时溶化，一般实际应用时在沸时溶化，一
3、般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在烧焦。琼脂在4040时凝固，通常不被微生物分时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。质量和气温的不同而有所不同。由于这种培养基多用于培养细菌，因此，由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其要用稀酸或稀碱将其pHpH调至中性或微碱性，调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。牛肉膏蛋白胨培以利于细菌的生长繁殖。牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：养基的配方如下：牛肉膏牛肉膏 3g 3g 蛋白胨
4、蛋白胨 10g 10g NaCl 5g NaCl 5g 琼脂琼脂151520g 20g 水水 1000ml pH 71000ml pH 74 47 76 6干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。白质凝固变性而达到灭菌的目的。l紫外线灭菌是用紫外线灯进行的，波长紫外线灭菌是用紫外线灯进行的，波长为为200200300nm300nm的紫外线都有杀菌能力，的紫外线都有杀菌能力，其中以其中以260nm260nm的杀菌力最强。的杀菌力最强。为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外线灯以前，可在无菌室内（或接种箱内
5、）线灯以前，可在无菌室内（或接种箱内）喷洒喷洒3 35 5的石炭酸溶液，一方面使空的石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。面也可以杀死一部分细菌。超净工作台内紫外灯（线）灭菌三、器材三、器材 l牛肉膏，蛋白胨，牛肉膏，蛋白胨，NaClNaCl，琼脂；，琼脂；1mol/L NaOH1mol/L NaOH，1mol/L HCl1mol/L HCl；试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，扭力天平，牛角匙，高压蒸养基分装器，扭力天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，汽灭菌锅，pHpH试纸（
6、试纸（pH 5pH 55 59 90 0），），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。l培养皿，试管，吸管，电烘箱等。培养皿，试管，吸管，电烘箱等。l牛肉膏蛋白胨培养基，培养皿（牛肉膏蛋白胨培养基，培养皿（6 6套一包），套一包），手提式高压蒸汽菌锅等。手提式高压蒸汽菌锅等。l紫外线灯，紫外线灯，3 35 5石炭酸或石炭酸或2 23 3来苏尔溶来苏尔溶液，牛肉膏蛋白胨平板液，牛肉膏蛋白胨平板 。四、操作步骤四、操作步骤l一、称量l准确、迅速，一种药品一把药勺，勿盖错药瓶盖l二、溶化l水的加法、加热搅拌l三、调pHl忌调过头后来回调培养基的制备l四、过滤l五、分
7、装l1、液体分装：试管高度的1/4左右l 三角瓶容积的1/2l2、固体分装：试管高度的1/5左右（制斜面）l 半固体：1/3左右（垂直穿刺）l马丁氏培养基定容；瓶口棉塞培养基的制备l六、加塞l七、包扎l八、灭菌l一般15磅（121）20分钟l九、摆斜面l温度、斜面长度（试管的1/2）l十、无菌检查l37培养2448小时常用培养基l一、牛肉膏蛋白胨培养基l应用最广泛的细菌基础培养基。l配方：l牛肉膏 3.0gl蛋白胨 10.0glNaCl 5.0gl水 1000ml lpH 7.4-7.6 常用培养基l二、高氏号培养基l用于培养、观察放线菌形态特征；l加入适量的抗菌物质（抗生素、酚）用于分离放线
8、菌（选择性培养基）。常用培养基l高氏号培养基配方：l可溶性淀粉 20g 按配方顺序依次溶解否则lNaCl 0.5g 产生沉淀lKNO3 1.0g lK2HPO4.3H2O 0.5g 抗生素现用现加,温度不宜lMgSO4.7H2O 0.5g 过高否则易分解lFeSO4.7H2O 0.01gl琼脂 15-25gl水 1000mllpH 7.4-7.6 常用培养基l三、马丁氏培养基l用于分离真菌的选择性培养基l配方：lKH2PO4 1.0g 另加孟加拉红和链霉素lMgSO4.7H2O 0.5g 抑制细菌、放线菌生长l蛋白胨 5gl葡萄糖 10gl琼脂 10-20gl水 1000mllpH 自然试管分
9、装试管分装摆斜面摆斜面摆斜面实物图摆斜面实物图五、实验报告五、实验报告l结果结果 检查培养基灭菌是否彻底。试管清洁如何，检查培养基灭菌是否彻底。试管清洁如何，培养基制备的合不合理。培养基制备的合不合理。玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗器皿包扎器皿包扎器皿包扎器皿包扎 六、思考题六、思考题（1 1）培养微生物的培养基应具备哪些条件？为）培养微生物的培养基应具备哪些条件？为什么？什么？（2 2）在配制培养基的操作过程中应注意些什么问）在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？图题？为什么？图5 5通气塞通气塞A A配制时纱布塞法；配制时纱布塞法；B B灭菌时包牛皮纸；灭菌时包牛皮纸；C C培养时纱布翻出培养时纱布翻出（3 3）培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何）培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？检查灭菌后的培养基是无菌的？l（4 4）干热灭菌完毕后，在什么情况下才能开）干热灭菌完毕后，在什么情况下才能开箱取物？为什么？箱取物？为什么？l（5 5）高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅）高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压力降到力降到0 0时才能打开排气阀，开盖取物？时才能打开排气阀，开盖取物？l紫外线杀菌的原理是什么？紫外线杀菌的原理是什么？全自动高压蒸汽灭菌锅