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1、实验四实验四 微生物菌落的观微生物菌落的观察和细菌的运动性观察察和细菌的运动性观察目目 的的 要要 求求n学会观察、识别各种不同的微生物菌落的方法。学会观察、识别各种不同的微生物菌落的方法。n掌握平板菌落计数的方法，运用所学的知识详细的掌握平板菌落计数的方法，运用所学的知识详细的描述所分离平板上的各种微生物菌落。描述所分离平板上的各种微生物菌落。n了解普通光学了解普通光学显微微镜的构造和原理，熟悉其使用的的构造和原理，熟悉其使用的正确方法。正确方法。n学学习并掌握油并掌握油镜的使用方法，学会用的使用方法，学会用压滴法或滴法或悬滴滴法法观察察细菌运菌运动性的基本技性的基本技术。实实 验验 原原
2、理理 对于一些难区别的菌落还应该借助显微镜来观察其细胞形态以进一步做对于一些难区别的菌落还应该借助显微镜来观察其细胞形态以进一步做出正确的判断。出正确的判断。微生物类别微生物类别菌落特征菌落特征单细胞微生物单细胞微生物菌丝状微生物菌丝状微生物细菌细菌酵母菌酵母菌放线菌放线菌霉菌霉菌主要主要特征特征细细胞胞形态特征形态特征小而均匀小而均匀个别有芽孢个别有芽孢大而分化大而分化细而均匀细而均匀粗而分化粗而分化相互关系相互关系单个分散或按单个分散或按一定方式排列一定方式排列单个分散或单个分散或假丝状假丝状丝状交织丝状交织丝状交织丝状交织菌菌落落含水情况含水情况很湿或较湿很湿或较湿较湿较湿干燥或较干燥干
3、燥或较干燥干燥干燥外观特征外观特征小而突起小而突起或大而平坦或大而平坦大而突起大而突起小而紧密小而紧密大而疏松大而疏松或大而致密或大而致密参考参考特征特征菌落透明度菌落透明度透明或稍透明透明或稍透明稍透明稍透明不透明不透明不透明不透明菌落与培养基结合度菌落与培养基结合度不结合不结合不结合不结合牢固结合牢固结合较牢固结合较牢固结合菌落的颜色菌落的颜色多样多样单调单调十分多样十分多样十分多样十分多样菌落正反面颜色差别菌落正反面颜色差别相同相同相同相同一般不同一般不同一般不同一般不同细胞生长速度细胞生长速度一般很快一般很快较快较快慢慢一般较快一般较快气味气味一般有臭味一般有臭味多带酒香多带酒香常有泥
4、腥味常有泥腥味霉味霉味（一）普通光学显微（一）普通光学显微镜的构造：镜的构造：1、机械部分：机械部分：镜臂、臂、镜座、粗座、粗调节器、器、细调节器、聚光升降螺旋、器、聚光升降螺旋、载物台等。物台等。-支持、支持、调节、固定等作用、固定等作用2、光学系统：光学系统：接物接物镜、接目接目镜、照明装置、照明装置、聚聚光器等。光器等。1.1.物物镜转换器器2.2.接物接物镜3.3.游游标卡尺卡尺4.4.载物台物台5.5.聚光器聚光器6.6.彩彩虹光虹光阑7.7.光源光源8.8.镜座座9.9.电源开关源开关10.10.光源滑光源滑动变阻器阻器11.11.粗粗调螺旋螺旋12.12.微微调螺旋螺旋13.13
5、.镜臂臂14.14.镜筒筒15.15.目目镜16.16.标本本移移动螺旋螺旋显微镜的放大倍数和分显微镜的放大倍数和分辨率辨率 1.放大倍数放大倍数=接物接物镜放放大倍数大倍数接目接目镜放大倍放大倍数数 2.显微镜的分辨率显微镜的分辨率 是是表示表示显微微镜辨析物体辨析物体（两端）两点之（两端）两点之间距离距离的能力。的能力。nD：物镜分辨出物体两点间的最短距离；物镜分辨出物体两点间的最短距离；NA，数值孔径数值孔径，是物镜的参数之一是物镜的参数之一；：入射光的波长入射光的波长（可见光平均可见光平均0.550.55 m m)n:物镜和被检标本间介质的折射率；物镜和被检标本间介质的折射率；（空气为
6、空气为1.0，水为，水为1.33，玻璃为，玻璃为1.5，甘油为，甘油为1.47，香柏油为香柏油为1.52。）：镜口角镜口角（即入射角）：（即入射角）：是指从物镜光是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度径的边缘所张的角度。n比比如，肉眼所能感受的光波平均长度为如，肉眼所能感受的光波平均长度为0.55m，假如，假如NA=0.65的接的接物物镜，它的分辨力镜，它的分辨力D=*0.55/0.65=0.42m以下的两点间的距以下的两点间的距离就离就分辨不分辨不出来了，即使使用倍数更大的接目镜使其总放大率增加也仍出来了，即使使用倍数更大的
7、接目镜使其总放大率增加也仍分辨分辨不出，不出，只有改用数值孔径更大的接物镜才行。只有改用数值孔径更大的接物镜才行。n显微镜的分辨率可用公式表示为：显微镜的分辨率可用公式表示为：D=/2NA=/2nsin(/2)（二）油（二）油镜的使用原理的使用原理n油镜，即油浸接物镜。当油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散使光线受到曲折，发生散射，射，降低了视野的照明度降低了视野的照明度。n加入中间的介质是一层香加入中间的介质是一层香柏油（柏油（其折射率与玻片的其折射率与
8、玻片的相近相近），则几乎不发生折），则几乎不发生折射，射，增加了视野的进光量，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰从而使物象更加清晰。实实 验验 材材 料料n实验三所作的平板培养物：实验三所作的平板培养物：qA，在，在细菌细菌培养基上生长的各种菌落；培养基上生长的各种菌落；qB，在，在霉菌霉菌培养基上生长的各种菌落。培养基上生长的各种菌落。n实验二所作的实验二所作的试管斜面试管斜面，酒精灯、接种环等。，酒精灯、接种环等。n盖玻片、凹玻片、接种环、酒精灯。盖玻片、凹玻片、接种环、酒精灯。n菌种：大肠杆菌菌种：大肠杆菌E.coli，枯草杆菌，枯草杆菌B.subtilis或实验三所或实验三所培养菌
9、种培养菌种实 验 程 序（观察描述菌落特征）n运用所掌握的各种微生物菌落的特点，观察、识别、描述所运用所掌握的各种微生物菌落的特点，观察、识别、描述所做样品的两个平板上的所有菌落做样品的两个平板上的所有菌落,并将结果填入并将结果填入表表1中。中。n常用的菌落描述词语：常用的菌落描述词语：n大小：大小：大、中、小、针尖状大、中、小、针尖状n形状：形状：圆形、隆起、扁平、假根状、不规则状等；圆形、隆起、扁平、假根状、不规则状等；n边缘情况：边缘情况：整齐、波形、裂叶状、锯齿状等整齐、波形、裂叶状、锯齿状等n表面情况：表面情况：干燥、湿润、光滑、皱褶、颗粒状、龟裂状干燥、湿润、光滑、皱褶、颗粒状、龟
10、裂状等；等；样样品品来源来源培养基培养基类类型型菌落菌落类类型型特征描述特征描述菌落数菌落数（近似（近似值值）大小大小形状形状颜颜色色表面情况表面情况边缘边缘情况情况A1A2B3B4A1A2B3B4表表1平板菌落特征描述平板菌落特征描述n定义定义:根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征而设计的计数是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征而设计的计数方法，即方法，即一个菌落代表一个单细胞一个菌落代表一个单细胞。统计菌落数目，。统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。即可计算出样品中的含菌数。n此法所计算的菌数是培养基上长出来的
11、菌落数，故又此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。称活菌计数。n对土壤中的微生物进行计数对土壤中的微生物进行计数,将结果填入表将结果填入表2中。中。实实 验验 程程 序序（平板菌落计数）（平板菌落计数）表表2土壤中微生物计数结果土壤中微生物计数结果 稀稀释释度度10-510-61g样样品活菌数品活菌数12平均平均12平均平均细细菌菌落菌菌落数数霉菌菌落霉菌菌落数数计数方法计数方法:每克土壤的菌数每克土壤的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数同一稀释度几次重复的菌落平均数稀释倍数稀释倍数 计算结果时，常按下列标准从接种后的计算结果时，常按下列标准从接种后的2个或个或3个稀释度
12、中选择一个合适的稀个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出每克菌剂中的含菌数。释度，求出每克菌剂中的含菌数。（1）同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。（2）细菌、放线菌、酵母菌以每皿细菌、放线菌、酵母菌以每皿30300个菌落为宜个菌落为宜，霉菌以每皿霉菌以每皿10100个菌落为宜。个菌落为宜。选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算。计算。实实 验验 程程 序序显微镜（油镜）的使用：显微镜（油镜）的使用：1、用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。用前检查：零件是否
13、齐全，镜头是否清洁。2 2、打开光源，调节光亮度打开光源，调节光亮度 3、低倍镜观察：粗调、细调低倍镜观察：粗调、细调4、依次再进行中倍、高倍观察依次再进行中倍、高倍观察 5、油镜观察：油镜观察：高倍高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在，在标本中央本中央滴一滴香柏油，使油滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，浸入香柏油中，细调至看清物象至看清物象为止。止。6 6、换片：另换新片，必须从第三条开始操作。换片：另换新片，必须从第三条开始操作。7、用后复原：用后复原：观察完察完毕，上，上悬镜筒，先用擦筒，先用擦镜纸擦去擦去镜头上的油，然上的油，然后再用擦后再用擦镜纸沾
14、取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的擦去残留的二甲苯，后将二甲苯，后将镜体全部复原。体全部复原。一、一、结合标本片的观察，掌握油镜的使用方法；结合标本片的观察，掌握油镜的使用方法；观察各类微生物染色片，边观察边绘图。观察各类微生物染色片，边观察边绘图。二、细菌运动性的观察（压滴法二、细菌运动性的观察（压滴法）：）：n(1)制备菌液制备菌液：从幼龄菌斜面上，挑数环菌放在装有从幼龄菌斜面上，挑数环菌放在装有12mL无无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液。菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液。n(2)取取23环稀释菌液于洁净载玻片中央，再加入一环环稀释菌
15、液于洁净载玻片中央，再加入一环0.01%的美蓝水的美蓝水溶液，混匀。溶液，混匀。n(3)用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，这样可防止产生气泡。慢地放下盖玻片，这样可防止产生气泡。n(4)镜检镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用：将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用高倍镜观察。高倍镜观察。n要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。二、细菌运
16、动性的观察（悬滴法）：二、细菌运动性的观察（悬滴法）：n1.制备菌液：制备菌液：在幼龄菌斜面上，滴加在幼龄菌斜面上，滴加3-4mL无菌水，制成轻度混浊的菌无菌水，制成轻度混浊的菌悬液。悬液。n2.涂凡士林：涂凡士林：取洁净无油的盖玻片取洁净无油的盖玻片1块，在其四周涂少量的凡士林（或香块，在其四周涂少量的凡士林（或香柏油）。柏油）。n3.滴加菌液：滴加菌液：加加1滴菌液于盖玻片的中央，并用记号笔在菌液的边缘做一滴菌液于盖玻片的中央，并用记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。n4.盖凹玻片盖凹玻片将凹玻片的凹槽对准盖将凹
17、玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上，使两者粘在一起，然后翻玻片上，使两者粘在一起，然后翻转凹玻片，使菌液正好悬在凹槽的转凹玻片，使菌液正好悬在凹槽的中央，再用铅笔或火柴棒轻压盖玻中央，再用铅笔或火柴棒轻压盖玻片，使玻片四周边缘闭合，以防菌片，使玻片四周边缘闭合，以防菌液干燥。液干燥。n5.镜检镜检先用低倍镜找到标记，再稍先用低倍镜找到标记，再稍微移动凹玻片即可找到菌滴的边缘，微移动凹玻片即可找到菌滴的边缘，然后将菌液移到视野中央换高倍镜然后将菌液移到视野中央换高倍镜观察。观察。n由于菌体是透明的，镜检时由于菌体是透明的，镜检时可适当可适当缩小光圈
18、或降低聚光器以增大反差缩小光圈或降低聚光器以增大反差，便于观察。便于观察。n镜检时要仔细辨别是镜检时要仔细辨别是细菌的运动细菌的运动还还是是分子运动分子运动（即布朗运动）。（即布朗运动）。实实 验验 程程 序序（无菌操作技术（无菌操作技术）在酒精灯火焰旁操作，将所给的两种菌种无菌操在酒精灯火焰旁操作，将所给的两种菌种无菌操作，转接到大试管斜面，并贴标签，培养。作，转接到大试管斜面，并贴标签，培养。点燃酒精灯点燃酒精灯左手夹住两试管：斜面向上，左手夹住两试管：斜面向上，45450 0度角。度角。灼烧接种环灼烧接种环右手拔棉塞，管口过火右手拔棉塞，管口过火取菌取菌标记标记培养培养n将将观察到的菌落特征填入表察到的菌落特征填入表1中。中。n将平板菌落将平板菌落计数的数的结果填入表果填入表2中。中。n斜面接种要注意那些斜面接种要注意那些问题？n分分别绘出高倍出高倍镜和油和油镜下下观察到的某察到的某细菌（菌（如枯如枯草芽胞杆菌草芽胞杆菌）的基本形）的基本形态。n油油镜观察察时，为什么要滴加香柏油？并什么要滴加香柏油？并说明油明油镜观察察应注意什么注意什么问题？结果与思考题结果与思考题