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1、 实验二实验二 血糖定量测定血糖定量测定(Folin-Wu(Folin-Wu法法)有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。有些无色溶因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。有些无色溶因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。有些无色
2、溶因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。有些无色溶液虽对可见光无吸收作用，但所含物质可以吸收特定波液虽对可见光无吸收作用，但所含物质可以吸收特定波液虽对可见光无吸收作用，但所含物质可以吸收特定波液虽对可见光无吸收作用，但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。分光光度法是利用物质特有的吸长的紫外线或红外线。分光光度法是利用物质特有的吸长的紫外线或红外线。分光光度法是利用物质特有的吸长的紫外线或红外线。分光光度法是利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的技术。使用的仪器则收光谱来鉴别物质或测定其含量的技术。使用的仪器则收光谱来鉴别物质或测定其含量的技术。使用的仪器则收光谱来鉴别物质或测定
3、其含量的技术。使用的仪器则称为分光光度计称为分光光度计称为分光光度计称为分光光度计 。分光光度技术分光光度技术分光光度计的组成和构造分光光度计的组成和构造组成：各种型号的紫外组成：各种型号的紫外/可见分光度计，不论是何种型式，基本上可见分光度计，不论是何种型式，基本上都由五部分组成：都由五部分组成：（1 1）光源；）光源；（2 2）单色器（包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统）；）单色器（包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统）；（3 3）样品室；）样品室；（4 4）接收检测放大系统；）接收检测放大系统；（5 5）显示或记录器。）显示或记录器。国产分光光度计近年来已有很大的发展，各种档次
4、的分光光度计都国产分光光度计近年来已有很大的发展，各种档次的分光光度计都已更新升级换代，可见光系列有：已更新升级换代，可见光系列有：721721、722722、723723等型号，紫外等型号，紫外/可可见光系列有：见光系列有：751751、752752、753753、754754、756756等型号。等型号。分光光度法在生化实验技术中的应用分光光度法在生化实验技术中的应用 因为分光光度法极为灵敏、精确、快速和简便，在复因为分光光度法极为灵敏、精确、快速和简便，在复杂组分的系统中，不需要分离，即能检测出其中所含有的杂组分的系统中，不需要分离，即能检测出其中所含有的极少量物质。因此，分光光度法目前
5、已成为生物化学及其极少量物质。因此，分光光度法目前已成为生物化学及其他生物科学相关领域研究中广泛使用的方法之一。他生物科学相关领域研究中广泛使用的方法之一。在在生生化化实实验验中中主主要要用用于于氨氨基基酸酸含含量量的的测测定定、蛋蛋白白质质含含量量的的测测定定、核核酸酸的的测测定定、酶酶活活力力测测定定、生生物物大大分分子子的的鉴鉴定定和酶催化反应动力学的研究等。和酶催化反应动力学的研究等。754754型操作规程型操作规程1.1.开启电源，用可见光测定时打开钨灯即可，如使用紫外测定则还需打开氘灯，开启电源，用可见光测定时打开钨灯即可，如使用紫外测定则还需打开氘灯，指标灯亮，使仪器预热指标灯亮
6、，使仪器预热20min20min以上。以上。2.2.按按“Mod”Mod”键选择测试方式，使开关置于键选择测试方式，使开关置于TT。3.3.打开样品室盖（光门自动关闭），按打开样品室盖（光门自动关闭），按00TT键进行机械调零，使数字显示为键进行机械调零，使数字显示为“0.00”0.00”。4.4.将参比样品和被测样品分别倒入比色皿中，放置比色架中，旋动波长调节旋钮，将参比样品和被测样品分别倒入比色皿中，放置比色架中，旋动波长调节旋钮，把测试所需的波长调节至刻度线处。把测试所需的波长调节至刻度线处。5.5.盖上样品室盖，将参比溶液比色皿置于光路，调节透过率盖上样品室盖，将参比溶液比色皿置于光路
7、，调节透过率“100”100”按钮，使数按钮，使数字显示为字显示为100100T T。然后按。然后按“Mod”Mod”键选择开关置于键选择开关置于“A”A”，使显示数字为，使显示数字为“0.000”0.000”，反复转换，反复转换“A”A”、“T”T”为为0 0、100100三次，可进行吸光度值测量。三次，可进行吸光度值测量。6.6.吸光度吸光度A A的测量：按的测量：按“Mod”Mod”键选择开关置于键选择开关置于“A”A”使得参比溶液数字显示为使得参比溶液数字显示为0.0000.000，然后移入被测溶液，显示值即为试样的吸光度，然后移入被测溶液，显示值即为试样的吸光度A A值。值。7.7.
8、测量完毕后，关闭电源，清洗比色皿。测量完毕后，关闭电源，清洗比色皿。8.8.仪器使用结束后，按要求填写仪器使用登记。仪器使用结束后，按要求填写仪器使用登记。注意事项：注意事项：、每台仪器所配套的比色皿是通过透射配对的，不能相互调换。、每台仪器所配套的比色皿是通过透射配对的，不能相互调换。、使用比色皿时要将透光面对准光路，勿用手触摸比色皿透光面，比色皿盛液约、使用比色皿时要将透光面对准光路，勿用手触摸比色皿透光面，比色皿盛液约2/32/3左右，溶液中不能有气泡、悬浮物等，以免影响测试精度。左右，溶液中不能有气泡、悬浮物等，以免影响测试精度。、只能在、只能在“T”T”档时打开样品室盖。档时打开样品
9、室盖。、开关盖子及推拉转换时，轻拿轻放，以免溶液溅出腐蚀仪器。、开关盖子及推拉转换时，轻拿轻放，以免溶液溅出腐蚀仪器。、清洗比色皿的过程中，光面只能用擦镜纸、清洗比色皿的过程中，光面只能用擦镜纸擦。擦。血糖定量测定血糖定量测定(Folin-Wu(Folin-Wu法法)CuCu2+2+(CuSO4CuSO4 )还原糖还原糖 CuCu+(Cu(Cu2 2O)O)CuCu2 2O O +酸性钼酸试剂酸性钼酸试剂 蓝色钼化合物蓝色钼化合物实验原理实验原理葡萄糖的醛基具有还原性。无蛋白血滤液中的葡萄糖与碱葡萄糖的醛基具有还原性。无蛋白血滤液中的葡萄糖与碱性铜试剂混合加热后，被氧化成羧基，而碱性铜试剂中的
10、二性铜试剂混合加热后，被氧化成羧基，而碱性铜试剂中的二价铜则被还原成砖红色的氧化亚铜（价铜则被还原成砖红色的氧化亚铜（CuCu2 2O O）沉淀。氧化亚铜）沉淀。氧化亚铜又可使磷钼酸还原成低价的蓝色钼化合物。血滤液中的糖含又可使磷钼酸还原成低价的蓝色钼化合物。血滤液中的糖含量和产生的氧化亚铜量成正比，氧化亚铜的量与形成钼化合量和产生的氧化亚铜量成正比，氧化亚铜的量与形成钼化合物的量成正比，可用比色法于物的量成正比，可用比色法于-nmnm下测定。下测定。测定血糖含量时必须先除去其中的蛋白质，制成测定血糖含量时必须先除去其中的蛋白质，制成无蛋白滤液，再行检验。向抗凝血中加入钨酸钠、无蛋白滤液，再行
11、检验。向抗凝血中加入钨酸钠、硫酸锌、氢氧化锌及三氯乙酸等均可制得无蛋白滤硫酸锌、氢氧化锌及三氯乙酸等均可制得无蛋白滤液，现常用钨酸法。钨酸钠与硫酸作用，生成钨酸，液，现常用钨酸法。钨酸钠与硫酸作用，生成钨酸，可使血红蛋白等变性、凝固、沉淀，离心或过滤除可使血红蛋白等变性、凝固、沉淀，离心或过滤除去沉淀，即得无蛋白血滤液，此种滤液还适用于测去沉淀，即得无蛋白血滤液，此种滤液还适用于测定非蛋白氮、肌酸和尿酸等定非蛋白氮、肌酸和尿酸等 Na Na2 2WO4+HWO4+H2 2SO4 HSO4 H2 2WO4+NaWO4+Na2 2SO4SO4实验操作实验操作、配制标准葡萄糖液、配制标准葡萄糖液、无
12、蛋白血滤液制备、无蛋白血滤液制备用用mlml移液管准确吸取抗凝血移液管准确吸取抗凝血mlml，缓缓，缓缓放入放入mlml锥形瓶内，加水锥形瓶内，加水mlml，溶血后加，溶血后加钨酸钠钨酸钠mlml，摇匀，再加，摇匀，再加.mol/LHmol/LH2 2SO4SO4mlml，随加随摇，加毕充分摇匀，随加随摇，加毕充分摇匀，放置分钟，至沉淀由鲜红变成暗棕色。放置分钟，至沉淀由鲜红变成暗棕色。用干滤纸过滤（先倾入液体少许，待滤纸润湿用干滤纸过滤（先倾入液体少许，待滤纸润湿后再全部倒入），并在漏斗上盖一表面皿。如后再全部倒入），并在漏斗上盖一表面皿。如滤液不清，需重滤。每毫升无蛋白血滤液相当滤液不清，
13、需重滤。每毫升无蛋白血滤液相当于于mlml全血。全血。血糖管血糖管试剂（试剂（mlml）空白空白标准标准样品样品无蛋白血滤液无蛋白血滤液.蒸馏水蒸馏水.葡萄糖标准液（工作液）葡萄糖标准液（工作液）.碱性铜试剂碱性铜试剂.混合，置沸水浴中加热混合，置沸水浴中加热minmin，于流动冷水中冷却，于流动冷水中冷却minmin（勿摇动）（勿摇动）酸性磷钼酸试剂酸性磷钼酸试剂.混匀，室温放置混匀，室温放置minmin，以蒸馏水定容至，以蒸馏水定容至mlml，混匀，倒入比色杯，混匀，倒入比色杯，用型分光光度计用型分光光度计nmnm波长比色（先以空白管调节零点，继测标准波长比色（先以空白管调节零点，继测标准
14、管及样品管）。记录各管吸光度值。管及样品管）。记录各管吸光度值。、血糖测定：、血糖测定：取具有取具有mlml刻度之血糖管支，编号，然后在血糖管中按下表进行操作：刻度之血糖管支，编号，然后在血糖管中按下表进行操作：、结果计算、结果计算根据比色结果计算每根据比色结果计算每mlml血液中所含葡萄糖的毫克数：血液中所含葡萄糖的毫克数：mlml全血含血糖毫克数全血含血糖毫克数OD1/OD2C10100OD1/OD2C10100其中其中C C标准葡萄糖含量（标准葡萄糖含量（mg/mlmg/ml）；）；OD1OD1样品液光密度样品液光密度OD2OD2标准液光密度标准液光密度思考题：思考题：Folin-wuFolin-wu血糖管的中间部分变细有什么作用？血糖管的中间部分变细有什么作用？