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1、北 京农 学院自编教材指导书植物生理学试验指导2023 版李奕松 姬谦龙 马兰青葛秀秀 杨明峰 王文平 赵筱萌编北京农学院生物科学与工程学院2023.2目 录 试验室特别提示试验一 质壁分别法测定细胞渗透势4试验二 小液流法测定植物组织水势5试验三 叶绿体色素的提取分别理化性质及定量测定7试验四 植物根系活力的测定TTC 法10试验五 过氧化氢酶CAT活性的测定12试验六 植物硝酸复原酶NR活性的测定14试验七 植物细胞膜透性的测定16试验八 植物光合速率的测定17 试验室特别提示一、 试验室纪律要求1. 依据规定，穿好试验服进入试验室。2. 不允许将食品和饮用水带进试验室。3. 依据教师指定
2、的试验台进展试验，不允许私自调换位置。4. 试验课中制止大声喧哗、跑动和打闹。二、 试验安全留意事项5. 留意电源使用安全，制止湿手拔插插头。6. 水浴锅锅盖开启关闭时，留意避开蒸汽烫伤。7. 留意抽气泵安全使用。8. 留意使用分光光度计时参比液体样品不能满溢洒漏。三、 试验课程要求9. 提前预习试验指导内容，生疏试验原理和步骤。10. 检查台面用具是否完好，假设否，须报告进展补充调整。11. 清洗器皿程序：“自来水去污粉自来水去离子水”。12. 试验原始结果记录需要指导教师审查签字。13. 试验后填写仪器使用记录。14. 试验完毕清洁试验器皿和台面、地面卫生。15. 离开试验课堂需要得到指导
3、教师批准。试验一 质壁分别法测定细胞渗透势一、原理：在生活细胞和外界溶液构成的渗透体系中，水分总是从高水势一方流向低水势一方。将植物组织放入一 系列不同浓度的蔗糖溶液中，经过一段时间以后，有的细胞吸取水分，细胞膨胀；有的失去水分，细胞发生 质壁分别。假设在某一溶液中细胞脱水到达平衡时刚好细胞处在临界质壁分别状态，此时细胞内的压力势等 于零，外界溶液的渗透势等于细胞渗透势，故此外界溶液称为该组织的等渗溶液，其浓度称之为该组织的等 渗浓度。依据公式即可计算出该组织细胞液的渗透势。在实际测定时，由于临界质壁分别状态难以在显微镜 下直接观看到，所以一般均以细胞初始质壁分别状态作为推断组织等渗浓度的标准
4、。假设细胞质壁分别较为 明显，可依据引起质壁分别的溶液浓度，与相邻的不引起质壁分别的溶液浓度，取其平均值，求出组织等渗 浓度，并计算出溶液的渗透势，即为该组织细胞的渗透势。二、材料与设备：1. 植物材料：洋葱鳞茎、大葱、蚕豆叶片或其它植物叶片。2. 设备：显微镜 1 台、培育皿 7 套；滴管；载玻片、盖玻片各 5 片；镊子 1 把；单面刀 1 片；滤纸适量。3. 试剂：1.00 mol/L 蔗糖溶液，0.03%中性红溶液.三、试验步骤：11221. 以 1.00 mol/L 蔗糖溶液为母液,依照公式C V =C V 配制 0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mol/L 蔗糖溶液各
5、 10ml 于枯燥清洁的小培育皿内备用。留意盖上培育皿盖，防止蒸发浓缩。2. 用刀片在洋葱鳞茎内表皮上划出边长为 5mm 的小方格，用镊子剥取内表皮数块浸入盛有 0.03%中性红溶液的小培育皿内，染色 3min，取出后放入盛有自来水的小培育皿内，冲洗中性红留存在细胞间隙、细胞壁等上面的浮色，用滤纸吸干内表皮上的多余水分。3. 在盛有不同浓度蔗糖溶液的培育皿内分别放入染过色并漂洗后的内表皮数块。 20min 后，按从高浓度到低浓度蔗糖溶液的挨次各取出内表皮小块，依次开头镜检，绘图记录质壁分别状况，求出组织细胞的等渗 溶液浓度。四、结果计算：由所得到的组织细胞的等渗浓度和测定时的室温，用下式计算植
6、物细胞的渗透势。s= -iCRTMPa ：为细胞渗透势，以MPa 表示。Si ：为溶液的等渗系数蔗糖溶液的i=1。 C：等渗溶液的浓度mol/L。 T：为确定温度，T=273+tK，t 为试验时的室温。R：为气体常数，R=0.008314LMPa/molk试验二 小液流法测定植物组织水势一、原理水势表示水分的化学势，水分从水势高处流向低处。植物体细胞之间、组织之间以及植物体和环境之间的水分移动方向都由水势打算。当植物细胞或组织分别放在一系列浓度递增的溶液中时，假设植物组织的水势小于溶液的渗透势，则组 织吸水而使外界溶液浓度变大；反之，则组织水格外流而使外界溶液浓度变小。假设植物组织的水势与溶液
7、的 渗透势相等，则二者水分保持动态平衡，所以外界溶液浓度不变，而外界溶液的渗透势即等于所测植物组织 的水势。溶液浓度不同，比重不同，当两个不同浓度的溶液相遇时，稀溶液由于比重小而上浮，浓溶液则由 于比重较大而下沉。取浸过植物组织的溶液一小滴为了便于观看可先染色，放在原来浓度的溶液中，观 察液滴升降状况即可推断浓度的变化，如小液滴不动，则表示溶液浸过植物组织后浓度未变，即外界溶液的 渗透势等于组织的水势。二、材料与设备：1. 植物材料：胡萝卜肉质根或其它作物的叶片。2. 设备：青霉素小瓶或小试管1210mm6 支均具塞；大试管15150 mm6 支具塞；10 ml 移液管 2 支；1 ml 移液
8、管 2 支；毛细滴管 6 支；打孔器 1 个；温度计 1 支；解剖针 1 支；镊子 1 把。三、试验步骤：11221、以 1.00 mol/L 蔗糖溶液为母液,依照公式 C V =C V 配制一系列不同浓度的蔗糖溶液 0.05，0.1，0.2 ，0.3，0.4，0.5mol/L于 6 支干净、枯燥的大试管中，各管加塞，并编号。按编号挨次在试管架上排成一列，作为比照组。2、另取 6 支干净、枯燥的青霉素小瓶，编定序号，按挨次放在试管架上，作为试验组。然后由比照组的各试管中分别取溶液 1ml 移入一样编号的试验组试管中，加塞，备用。3、取胡萝卜肉质根或剪下具有代表性的颖叶片马上用打孔器打园片。留意
9、试验材料的取样部位 肯定要全都，假设为叶片组织要避开大的叶脉局部。快速将适量植物材料放在青霉素小瓶或小试管中。一 般胡萝卜肉质根放入 8 片厚约 1mm左右，叶片材料放入 20 片左右。摇动小瓶，使植物材料浸入到溶液中。留意这个过程操作要快，防止水分蒸发。放置 20min。在此期间摇动小瓶 2-3 次，使组织和溶液之间进展充分的水分交换。4、20min 后，分别在各小瓶中参加甲烯兰粉末少许，摇匀，使溶液为蓝色。按浓度依次分别用毛细吸管吸取少量蓝色溶液，轻轻插入相应浓度的试管中，伸至溶液中部，留神缓慢地放出蓝色溶液一小滴，渐渐 取出毛细管留意避开搅混溶液。观看并记录液滴的升降状况：假设有色液滴向
10、上移动，说明浸过植物组织的蔗糖溶液浓度变小，植物组织失水，说明植物组织的水势高于该浓度溶液的渗透势；假设有色液滴向下移动，说明浸过植物组织的蔗糖溶液浓度变大，植物组织吸 水，说明植物组织的水势低于该浓度溶液的渗透势；假设液滴静止不动，则说明植物组织的水势等于该浓度 溶液的渗透势。在测定中，假设在前一浓度溶液中液滴下降，而在后一浓度溶液中液滴上升，则该组织的水 势为前后二种浓度溶液渗透势的平均值。四、结果计算记录液滴静止不动的试管中蔗糖溶液的浓度。由所得到的等渗浓度和测定的室温，按下式计算植物组织的水势。W ：为植物组织水势，以MPa 表示。W= - iCRTMPai ：为溶液的等渗系数蔗糖溶液
11、的i=1。 C：为等渗溶液的浓度：mol/L。 T：为确定温度：T=273+tK，t 为试验时的室温。R：为气体常数：R=0.008314LMPa/molk试验三、叶绿体色素的提取、理化性质及定量测定I. 叶绿体色素的提取、理化性质一、原理：叶绿体中含有绿色素叶绿素 a 和 b和黄色素胡萝卜素和叶黄素。这两类色素能溶于有机溶剂， 且各种色素的脂溶性不同。依据它们在有机溶剂如乙醇、甲醇、丙酮等中的溶解特性，可将它们从叶子 中提取出来。叶绿素是一个双羧酸的脂，在碱的作用下，可发生皂化反响。在酸性条件下，叶绿素 啉环中心的镁可被氢取代，于是叶绿素成为褐色的去镁叶绿素。叶绿素中的镁也可被铜、锌等金属离
12、子取代，此时叶绿素仍 可保持绿色。叶绿素在光照下会发出暗红色的荧光。二、材料与设备：1. 植物材料：颖植物叶片。2. 设备：研钵一套；漏斗一个；剪子一把；细玻璃棒一支；烧杯50ml1 支；20ml 刻度试管 5 支；5 ml 刻度试管 2 支；25 ml 刻度吸管 2 支；酒精灯；石棉网；铁三脚架；滤纸适量。3. 试剂：丙酮； CaCO3; 80%丙酮；苯；醋酸酮粉末； 50%醋酸； KOH-甲醇溶液 20 克 KOH 溶于100ml 甲醇中三、试验步骤：1. 色素的提取取洗净颖的植物叶子 5 克，剪碎放入到研钵中，参加少量碳酸钙和石英砂，再少量屡次参加丙酮共10ml，研磨至丙酮染成深绿色，将
13、丙酮提取液滤入小烧杯内，再用10ml 丙酮重复研磨，过滤，滤液待用。2. 理化性质的测定1） 荧光现象取叶绿素提取液，放入试管中，在反射光下观看，溶液的颜色为暗红色，这是叶绿素辐射荧光的现象； 在透射光下为绿色，是由于叶绿素分子不吸取绿色光的缘由。2） 皂化作用用移液管吸取叶绿素提取液 5ml，放入到一大试管中，再参加 1.5ml 20% KOH-甲醇溶液，摇匀。紧接着参加 5ml 苯，马上摇匀。沿试管璧参加蒸馏水1 ml，轻轻转动试管，静置于试管架上，可看到溶液渐渐分成两层，上层是苯溶液，其中溶有黄色的类胡萝卜素，下层为稀的丙酮溶液，其中溶有绿色的皂化的叶绿素 a 和 b。3） 取代作用H+
14、 和 Cu2+ 对叶绿素分子中Mg2+的取代用移液管吸取叶绿素提取液 5ml，放入试管中，参加 50%醋酸数滴或浓HCL 12 滴，摇匀，可观看到溶液由绿色变成褐色，此时叶绿素分子中的Mg2+ 被 H+取代，为去镁叶绿素。之后将溶液倒一半于另一试管中，加醋酸酮粉末少许，微微加热，则溶液颜色又变成绿色，此时去镁叶绿素分子中的 H+被 Cu2+取代， 为铜代叶绿素。将两试管中的溶液进展比较。II. 叶绿素的吸取光谱与定量测定一、原理试验目的：把握紫外分光光度计的使用，学习测定叶绿素的含量及吸取光谱的测定方法。依据叶绿素对可见光有特定的吸取光谱，利用分光光度计在某一特定波长下测定其光密度，利用公式计
15、算叶绿素的含量。该法不但准确度高而且能在未分别的状况下，分别测定叶绿素a 和叶绿素b 的含量。叶绿素 a、b 在红光区的最大吸取峰分别位于 663nm 和 645nm ,又在波长 663nm 下叶绿素 a、b的 80%丙酮溶液的比吸取系数为 82.04 和 9.72，在波长 645nm 下分别为 16.75 和 45.60。其关系式：D663 = 82.04Ca + 9.72Cb(1)D645 = 16.75 Ca + 45.6Cb(2)D663 、D645：分别为叶绿素溶液在波长 663nm 和 645nm 的光密度。Ca 、Cb：分别为叶绿素a、b 的浓度，单位为mg/L解方程(1) (2
16、)得：Ca = 12.7 D663 2.59 D6453Cb = 22.9 D645 4.67 D6634Ca 与Cb 相加，既得叶绿素总量CTCT = Ca + Cb = 20.3 D645 + 8.03 D663(5)依据叶绿素 a、b 在 652nm 处有一样的比吸光系数34.5，即可在此波长下测定光密度D652而求C出叶绿素总浓度：TD652 1000TC mg/L = (6)34.5二. 材料和设备：1. 试验材料：菠菜叶片2. 设备：756 紫外分光光度计，电子天平，研钵一套，漏斗一个，25ml 容量瓶一个3. 试剂：80%丙酮，CaCO3 粉末三. 试验步骤：1. 叶绿素提取液的
17、置备：称取颖干净的叶片去主脉0.1 克，剪碎，放入研钵中，参加少量CaCO3 粉末和石英砂，参加 80%丙酮，认真研磨成匀浆，再参加适量丙酮，连续研磨至组织残渣变为白色， 静止片刻，将提取液过滤至 25 ml 容量瓶中，再用 80%丙酮冲洗研钵和滤纸，将色素冲洗干净，最终用80%丙酮定容至 25 ml，摇匀、待用。2. 光密度测定与吸取光谱扫描：以 80%丙酮做比照，按以下步骤输入程序：1) 开机：依次翻开外部电源(如稳压器)、主机电源。2) 仪器自检 ：当翻开仪器电源时，仪器便进入自检程序，自检各项都“OK”后，进入选择工作方式界面； 预热半小时后进展以下操作。3） 光度测量未知叶绿素a、b
18、 总浓度的测定：3.1 进入光度测量(652nm,)： 在选择工作方式界面中按键进入光度测量。3.2 参数设置： 按 F1 键进展参数设置：选测光方式为“Abs”，按 RETURN 键退出；按F2 键进入测量模式；按 GOTO输入测量样品波长值。3.3 校零：在第一样品池中放入参比溶液，按 AUTOZERO 键，仪器进展自动校零，校完后取出参比溶液。3.4 测量： 将取出的参比溶液倒掉，换上样品溶液，放入第一样品池内，按STARTSTOP即可测量样品 Abs 值。4) 光谱测量4.1 进入光谱测量：在选择工作方式界面中按键进入光谱测量。RETURN4.2 参数设置：按 F1 进入参数设置：1测
19、量波长范围(700-300)；2记录范围0-3；3采样间隔1nm；4光度方式(一般为 Abs)；5扫描速度一般为中速。参数设置完后按键退出参数设置。4.3 基线校正：在第一样品池中放入参比溶液，按 AUTOZERO 键仪器进展基线校正，校完后取出参比溶液。4.4 扫描：将取出的参比溶液倒掉，换上样品溶液，放入第一样品池中，按STARTSTOP 仪器自动进展扫描。四、叶绿素含量的计算：按公式3、4分别计算叶绿素 a、b 的浓度，相加既得总浓度，也可按公式6直接算出叶绿素总浓度。然后按公式7或8算出叶绿素总含量：CT(mg/L) 提取液总体积(L) 稀释倍数叶绿素含量鲜重%= 100%7样品鲜重m
20、gCT(mg/L) 提取液总体积(L) 稀释倍数叶绿素含量mg/g= 8样品鲜重g试验四、植物根系活力的测定TTC 法一、原理根是植物的重要器官，它不断生长，具有吸取水分和矿质养分的功能，而且还能进展合成代谢，如氨基酸、植物激素等的合成。所谓根系活力是泛指根的吸取、合成代谢等等的力量。根系活力与吸取作用的强弱 有直接关系，与脱氢酶系活性的强弱成正比。TTC 法测定根系活力就是依据根系脱氢酶系氧化复原力量强弱而设计的。氯化三苯基四氮唑 TTC是标准氧化复原电位为 80mv 的氧化复原物质。其氧化态无色，并溶于水，但被复原后即生成不溶于水的三苯基甲腙，呈红色，它在空气中不会自动氧化，相当稳定，所以
21、可用TTC 作为脱氢酶的氢受体.植物根所引起的 TTC 复原，可因参加琥珀酸、延胡素酸、苹果酸得到加强；而被丙二酸、碘乙酸等所严峻抑制。所以TTC 复原量能表示脱氢酶活性，并作为根系活力的指标。二、材料与设备1. 植物材料：水培或砂培植物幼苗的根，或认真洗净泥土的植物幼苗的根。玉米根系兴旺，是较好的试验材料。2. 设备：721 型分光光度计；温箱；电子天平；研钵 1 套；镊子 1 把；漏斗 1 个；刻度吸管 2ml 1 支、10ml 2 支、0.5 ml 1 支；容量瓶 10ml 1 个、刻度试管 20 ml 6 支；烧杯 500 ml 1 个；石英砂适量。3. 试剂1 、乙酸乙酯分析纯500
22、 ml；2 、分析纯连二亚硫酸钠Na2S204粉末少许；3 、1%TTC 溶液，准确称取 TTC 1.000g，溶于水中，定容至 100 ml；溶液 pH 应在 6.57.5，以 pH 试纸试之，如不易溶解，可先加少量酒精，使其溶解后再加水。4 、0.4%TTC 溶液，准确称取TTC 0.400g，溶于水中，定容至 100 ml；5 、1/15 mol/L 磷酸缓冲液pH=7.0，配制方法为：A 液：称取分析纯 Na2HP042H20 11.876g 溶于蒸馏水中成 1000 ml，B 液：称取分析纯KH2P04，9.078g 溶于蒸馏水中成 1000 ml。用时取A 液 60ml、B 液 4
23、0 ml 混合即成。6 、1mol/L 硫酸：用量筒取出比重 1.84 的浓硫酸 55 ml，边搅边参加盛有 500 ml dH 2O 的烧杯中，冷却后稀释至 1000 ml。三、试验步骤定量测定（1） TTC 标准曲线的制作：吸取 0.25 ml 0.4% TTC 溶液放入 10ml 刻度试管中，参加少许 Na2S204 粉末 应尽量多加一些，以使 TTC 充分复原，摇匀后马上产生红色的三苯基甲腙。用乙酸乙酯原液定容至刻度，摇匀。然后分别取此液 0.10，0.25，0.50，0.75，1.00 ml 置 10 ml 刻度试管中，分别加乙酸乙酯 4.90，4.75， 4.50，4.25，4.0
24、0ml，即得到含三苯基甲腙 0.01，0.025，0.05，0.075，0.10 mg 的标准比色系列，以乙酸乙酯做空白作参比，在 485nm 波长下测定光密度。以TTC 复原量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。（2） 剪取植物根尖 1cm 局部为试验材料，称取 0.1g，放入刻度试管中，参加 0.4%TTC 溶液和磷酸缓冲液的等量混合液 10 ml，把根充分浸在溶液内，在 37下保温 40-60min，植物根尖局部成为红色。之后参加1mol/L 硫酸 2 ml，以停顿反响。空白试验为先加硫酸再参加根样品，其它操作一样。（3） 用镊子将根夹出，冲洗后擦干外表水分，参加少许乙酸乙酯和少量石
25、英砂在研钵内研磨，以提取 出红色的三苯基甲腙，把红色浸提液滤入试管，并用乙酸乙酯洗涤研钵中的残渣 23 次，至到残渣为白色。然后用乙酸乙酯将浸提液定容至 5 ml。浸提液在 485nm 下比色，以空白试验先加硫酸到再参加根样品操作得到的溶液作参比，读出光密度，查标准曲线，求出TTC 复原量。四、结果计算：TTC 复原量mgTTC 复原强度= mgg-1min-1 根重g酶促反响时间min试验五、过氧化氢酶CAT活性的测定一、原理：过氧化氢酶CAT在植物体内普遍存在，它能把过氧化氢分解为水和氧气。其活性大小以肯定时间内 分解的过氧化氢量来表示。让酶与定量的底物过氧化氢进展定时的反响，反响完毕后，
26、再用碘量法测定 剩余的过氧化氢量。以钼酸铵作催化剂，过氧化氢与碘化钾在酸性条件下反响，放出游离碘。然后用硫代硫 酸钠滴定碘，其反响为：4H2O2+2KI+H2SO I2+K2SO4+2H2OI2+2Na2S2O32NaI+Na 2S4O6依据空白不加酶液和测定加酶液二者滴定值之差，即可求出酶分解的过氧化氢量。酶活性单位为：分解H2O2 mg/gmin二、材料与设备1. 植物材料：小麦或其它植物叶片2. 设备：电子天平；研钵一套；100ml 三角瓶 4 个；100ml 容量瓶 2 个；50ml 酸式滴定管 1 支；恒温水浴；漏斗 1 个；滤纸适量；移液管 10ml 1 支、5ml 2 支、1ml
27、 1 支。3. 试剂：1 碳酸钙粉末。2 1.8mol/L 硫酸：取 1000ml 烧杯 1 只，参加约 500mldH O，边搅拌边参加 100 ml 浓硫酸，冷却后，2用容量瓶定容至 1000ml。3 10%钼酸铵溶液。4 1%淀粉溶液：取 1g 可溶性淀粉于小烧杯中加约 20ml 水调匀，渐渐倾入约 80ml 沸水中，在搅拌下加热至重沸腾，冷却后贮于滴瓶中。5 0.1mol/L 硫代硫酸钠溶液：称取Na S O 5H O 25g 溶于煮沸并冷却过的dH O 中，参加约2 2 3220.1 gNa CO ，并稀释至 1L。保存于棕色中，放置暗处，一天后进展标定。23标定方法：准确称取分析纯
28、 K Cr O 约 0.15g 置于 500ml 三角瓶中，加 30mldH O 溶解，参加 2gKI 和 5ml22 726mol/L 盐酸，在暗处放置 5min，然后用水稀释至 200ml，用 0.1mol/L 硫代硫酸钠溶液滴定，当溶液从棕红色变成浅黄色时，参加 1ml 淀粉溶液，连续滴至溶液由兰色变成亮绿色 Cr+离子的颜色为止，计算出Na S O 的摩尔浓度。2 2 36 0.02mol/L 硫代硫酸钠：吸取 20ml 标定过的 0.1mol/L 硫代硫酸钠溶液，参加到 100ml 容量瓶中，加 dH O 定容到刻度。留意现用现配。27 0.06mol/L 过氢化氢，取 1ml30%
29、的过氧化氢用dH O 称释至 150ml。2三、试验步骤：1、酶液提取：称取剪碎混匀的颖小麦叶片 1g 置于研钵中，加 0.2g 碳酸钙和 dH O 2ml，认真研磨成2匀浆。过滤至 100ml 容量瓶中，用 dH O 称释至刻度，振荡片刻，静置。取 10ml 溶液再移入另一容量瓶中，2加 dH O 至刻度，摇匀备用。22、 测定：取 100ml 三角瓶 4 个，编号。每瓶加酶液 5ml，马上向 3、4 号瓶中参加 1.8mol/L 硫酸3ml，终止酶的活性，作为空白测定。然后将各瓶放在20水浴中保温， 10min 后依次向各瓶参加 3ml0.06 mol/L 过氢化氢，摇匀并记录参加时间，让
30、酶作用 5min，再依次向 1、2 号瓶各参加 3ml 1.8mol/L 硫酸。然后 4 个瓶各参加 1ml 20%碘化钾、3d 钼酸铵及 5d 淀粉指示剂，用 0.02mol/L 硫代硫酸钠滴定到兰色消逝。四、过氧化氢酶活性的计算：从空白测定的硫代硫酸钠滴定值减去样品测定的滴定值，即可求出此期间过氧化氢酶所分解的过氧化氢量。空白滴定值ml样品滴定值ml被分解的 H2O2 量mg= 硫代硫酸钠mol/L342【注：34 为H2O2 的分子量】被分解 H2O2 量mg酶液总体积ml测定时用酶液mlCAT活性H2O2 mg/gmin= 样品重g时间min试验六、植物硝酸复原酶(NR)活性的测定一、
31、原理：硝酸复原酶 NR是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐复原为亚硝酸盐。其反响式为：NO - + NADH + H+3 NO - + NAD2+ H O 。硝酸复原酶活性凹凸以生成的亚硝态氮衡量，酶活性一般以2单位时间每克鲜重植物材料复原生成的亚硝态氮含量表示，即以 NO2-ug/g.h 为单位。NO2-含量的测定可用磺胺比色法，该方法能测定的NaNO2 浓度为 0.5ug/ml。亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸或对-氨基苯磺酰胺及-萘胺或萘基乙烯胺在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在 540nm 有最大吸取峰，可用分光光度计测定。硝酸复原酶活性的测定可分为活体法和离
32、体法。活体法步骤简洁，硝酸复原酶不用从植物组织中提取出来，其作用产物 NO2-可以从组织内渗透到外界溶液中，通过测定反响液中 NO2-含量的增加，即能说明酶活性的大小。硝酸复原酶是一种诱导酶，当向培育介质中参加硝酸盐时，植物体内很快就会消灭硝酸复原酶。二、材料设备：1. 植物材料：小麦、玉米或其它植物材料的叶片。2. 设备：分光光度计；真空抽气装置；温箱；打孔器；电子天平；小三角瓶；试管；移液管 5ml 的 2 支、2ml 的 4 支。3. 试剂：1 、0.2 mol/L 硝酸钾溶液：溶解 10.11g 硝酸钾于dH2O 中，定容至 500ml。2 、0.1 mol/L 磷酸缓冲液，PH=7.
33、5A 液：0.2 mol/LNaH2PO4，取 NaH2PO4 27.8g, dH2O 溶解，配制成 1000ml 溶液。B 液：0.2 mol/LNa2HPO4，取 Na2HPO4 71.7g，dH2O 溶解，配制成 1000ml 溶液。取 A 液 16ml、B 液 84 ml，混合，用dH2O 稀释至 200ml。3 、磺胺试剂：1g 磺胺或对氨基苯磺酸加 25ml 浓盐酸，用dH2O 稀释至 100 ml。4 、-萘胺试剂： 0.2g -萘胺溶于含 1 ml 浓盐酸的 dH2O 中，定溶至 100ml。或将-萘胺溶于25ml 的冰醋酸中，用dH2O 稀释至 100ml。5 、亚硝酸钠标准
34、液：称取 AR 级 NaNO2 0.1000g，用 dH2O 溶解、定溶至 100ml，取 5ml，再用 dH2O 稀释至 1000ml，即为NO2-含量是 5ug/ml 的标准液。三、试验步骤1、将颖的叶片用水洗净，吸水纸吸干外表水分，然后用打孔器打成直径为 1cm 的园片，称取等量叶园片 2 份每份 0.20.3g，用 dH2O 洗涤 23 次，吸干水分，分别置于含有以下溶液的 2 个 50ml 三角瓶中： 1 0.1mol/L 磷酸缓冲液 (PH7.5) 5ml + dH 2O 5ml,(2)0.1 mol/L 磷酸缓冲液 (PH7.5) 5ml +0.2 mol/L KNO3 5ml。
35、留意将溶液浸没植物材料，然后将三角瓶置于真空枯燥器中，接上真空泵抽气7-10min，放气后，园片即沉于溶液中。将三角瓶置于30温箱中，不见光，保温 30min。留意取样前叶子要进展一段时间的光合作用，以积存碳水化合物，假设组织中的碳水化合物含量低，会使酶的活性降低。2、NO2-含量测定：保温 30min 完毕后，分别取出 1ml 反响液于试管中，参加磺胺试剂或对氨基苯磺酸 2ml，摇匀。再参加-萘胺试剂 2ml，摇匀。留意各试剂的参加挨次。在 30温箱中保温 30min，用分光光度计在 520nm 波长比色，测定光密度。从标准曲线上查得NO2-含量，然后计算酶活性。单位为NO2-ug/g.h。
36、3、标准曲线的制作：取 7 支试管，编号，按下表挨次添加试剂，每参加一种试剂后留意摇匀。待试剂加完后，将各试管置 30温箱中保温 30min，马上于 520nm 波长下进展比色，读出光密度，以光密度为纵坐标，NO -浓度为横坐标绘制标准曲线。 2留意：测定 NO -的磺胺比色法很灵敏，可以检出低于 1ug/ml 的 NaNO 含量，由于显色反响的速度与重22氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但假设标准曲线与样品的测定都在一样条件下进展则显色速度相等，彼此可以比较。试管号NaNO2标准液mldH O2ml磺胺试剂ml-萘胺ml反响终了 NO -含量2g
37、/管制作标准曲线的试剂配比10122020.10.9220.530.20.8221.040.40.6222.050.60.4223.060.80.2224.071.00225.0四、结果计算:硝酸复原酶活性=亚硝酸盐复原量g：在标准曲线中以试验中的吸光度值查出gg-1h-1材料重量 g 酶促反响时间h试验七、 植物细胞膜透性的测定一、原理：植物组织受不良环境条件如干旱、低温、高温、盐渍和大气污染危害时，细胞膜的构造和功能首先 受到损害，使细胞膜透性增大，导致细胞的内含物会有不同程度的外渗。假设将受损害的组织浸入无离子水 中，其外渗液中电解质的含量增加。组织受损害越严峻，电解质含量增加得越高。用
38、电导仪测定外渗液电导 度的变化，可反映出质膜受损害的程度。透性变化愈大，电导度愈大，表示受损害愈重，也就表示抗性愈 弱。二、材料与设备：1. 植物材料：选取小麦或其它作物肯定叶位和叶龄的功能叶片。2. 设备：电导仪 1 套，真空抽气装置 1 套；50ml 三角瓶 3 只；剪子 1 把；滤纸适量，打孔器 1 个，玻棒 2 根。3. 试剂：ddH2O 或去离子水。三、试验步骤：1、清洗用具：电导法对水和容器的干净度要求严格，器皿稍有杂质即产生电导度的很大误差。故所用玻璃用具洗净后，再用自来水、无离子水冲洗四、五次。倒置于洗净而垫有干净滤纸的盘中。2、取样及处理：分别在正常生长和逆境胁迫的植株上取同
39、一部位的功能叶假设干片，分成 2 份。用纱布擦净外表灰尘。将其中一份低温处理：放在-20左右的温度下冷冻 20min或高温处理：置 40左右的恒温箱中处理 30min；另一份裹入潮湿的纱布中放置在室温下作比照。处理后分别用去离子水冲洗两次，用干净的滤纸吸干，然后用打孔器1cm2将叶片打取 12 个叶园片，分别放入三角瓶中，准确参加 20 ml 的无离子水，浸没叶片，然后放入真空抽气装置中抽气约 10min，以抽出细胞间隙空气，缓缓放气，水即渗入细胞间隙，叶子变成透亮状，沉在三角瓶底部，取出三角瓶，放在室温下保持30min，间或摇动几次。3、测定：将电导仪的电极插入三角瓶中，测定外渗液的电导值，
40、记录其初始电导值 S 。之后，将1三角瓶放入沸水浴中 5min，以杀死组织。待冷至室温后，再次测定外渗液的电导值S 。2四、结果计算：按下式计算相对电导度：相对电导度L=S /S12相对电导度的大小表示细胞受损害程度。由于比照在室温下也有少量电解质外渗，故可按下面公式计算由于高温或低温胁迫而产生的外渗， 称为损害度。损害度%= L L / 1-L 100%tckckt式中：L处理叶片的相对电导度；L 比照叶片的相对电导度。ck试验八、植物光合速率的测定I. TPS-1 便携式光合作用测定系统一、原理：1. 测定 CO2 和 H2O 的值是通过测定参比气体进入叶室气体中的CO2 和 H2O 浓度
41、和流出叶室气体中的 CO2 和H2O 浓度分析气的浓度差值来实现的。CO2 对红外线的最大吸取波长是 4.26m.。TPS 利用这一吸取特点测定CO2 的浓度。水蒸气压是由一个电容传感器测定的。2. 仪器测定参数：光合速率、蒸腾速率、气孔导度、叶片温度、细胞间隙CO2 浓度、大气湿度、大气温度、大气 CO2 浓度、光合有效辐射、光光合响应曲线、CO2光合响应曲线。并且可以通过这些响应曲线计算出 RuBP 羧化效率、表观量子产量、光补偿点、CO2 补偿点、光饱和点、CO2 饱和点、RuBP 最大再生速率以及光合作用气孔限制值等一些格外有用的生理生态参数。二、材料与设备：1. 材料：绿色植物叶片2
42、. 设备：英国 PP 公司 TPS-1 便携式光合作用测定系统。TPS-1 是以开放式气路系统原理设计的光合作用测定系统， 主要由主机和叶室两局部组成。三、操作步骤：翻开TPS 前，请进展以下检查：1. 假设TPS 与叶室连用，在翻开电源之前要确定叶室与TPS-1 系统是否正确连接，假设正确连接，开机后TPS-1 系统会自动检测。2. 检查吸取管中的化学试剂，必要时应更换参考吸取管和化学试剂的环境条件局部。正式开机操作：第一步： 翻开 TPS-1 系统电源：大约 7 秒钟后显示主菜单假设显示CHECKSUM ERROR 或1 REC2 CAL4 CLR其次步：按 1 键REC后，显示：5 CL
43、K3 DMP6 DIAGMEMORY CORRUPT请查阅错误信息局部：SET PLC1：BROAD 2：UNIVERSAL第三步：选 2 键UNIVERSAL后，显示：1 REC：M 2INT：001 FLO：300第四步：当屏幕显示如上时，按Y 键后，显示：1：LIGHT=SUNorLAMP第五步：按 2 键后，屏幕显示2为：LEAF AREA=99.91：LIGHT=SUNorLAMP2：LEAF AREA=?.?第六步：设置好测量叶面积后，按Y 键进入测量状态，屏幕显示：C nnnn+/-nnnQ nnnn H nn.n+/-nn.nT nn.nC ： 为参比CO2 浓度，以ppm 为
44、单位00002500；+/-nnn：为分析气与参比气CO2 浓度差值，以ppm 为单位；Q ： 为光量子通量密度，以 molm-2s-1 为单位00002500；H ： 为参比水蒸气压，以毫巴为单位00.075.0；+/-nn.n 为分析气与参比气水蒸气压之间的差值，以毫巴为单位；第七步：选X 键，屏幕显示：T ： 为叶室温度，以为单位。E nn.nn G nnnn Tnn A+/-nn.n CI nnnE为蒸腾速率， 以 mmol m-2 s-1 为单位；G为气孔导度，以mmolm-2s-1 为单位； T为叶片温度，以为单位；A 为同化速率/净光合速率，单位： molm-2s-1；正值为光合速率，负值为呼吸速率。CI