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1、仪器分析仪器分析生物工程系生物工程系任务五任务五 高效液相色谱仪的使用高效液相色谱仪的使用了解高效液相色谱法的主要特点及其适用范围了解高效液相色谱法的主要特点及其适用范围了解高效液相色谱仪的构造了解高效液相色谱仪的构造 掌握高效液相色谱法的使用技术和定量方法掌握高效液相色谱法的使用技术和定量方法 学学 习习 目目 标标一、一、概概 述述 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC）：以气相色谱为基础，在）：以气相色谱为基础，在经典液相色谱（经典液相色谱（LC）实验和技术基础上建立的一种液相）实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。色谱法。（一）（一）HPLC的特点的特点（二）（二）与经典与经典LC
2、相比相比HPLC的优点的优点（三）（三）HPLC的适用范围的适用范围 高压高压压力可达压力可达150 150 300kg/m300kg/m2 2；高速高速流速为流速为0.10.110.0mL/min10.0mL/min；高效高效柱效高，在一根柱中同时分离成分可达柱效高，在一根柱中同时分离成分可达100100种；种；高灵敏度高灵敏度紫外检测器可达紫外检测器可达0.01ng0.01ng，荧光和电化学检，荧光和电化学检测器可达测器可达0.1pg0.1pg。（一）（一）HPLC的特点的特点（二）（二）与经典与经典LC相比相比HPLC的优点的优点 速度快速度快通常通常151530min30min一个样，
3、某些样品一个样，某些样品5min5min可完成；可完成；分辨率高分辨率高可选择固定相和流动相达到最佳分离效果；可选择固定相和流动相达到最佳分离效果；灵敏度高灵敏度高紫外检测器可达紫外检测器可达0.01ng0.01ng，荧光和电化学检测，荧光和电化学检测器可达器可达0.1pg0.1pg；柱子可反复使用柱子可反复使用用一根色谱柱可分离不同的化合物；用一根色谱柱可分离不同的化合物；样品量少，容易回收样品量少，容易回收样品经过色谱柱后不被破坏。样品经过色谱柱后不被破坏。（三）（三）HPLC的适用范围的适用范围 适合分析高沸点、热不稳定、离子型的样品适合分析高沸点、热不稳定、离子型的样品 ；应用范围广泛
4、，适用于医药、环保、石化、生命科学、食应用范围广泛，适用于医药、环保、石化、生命科学、食品工业、农业等多个领域；品工业、农业等多个领域；在已知的化合物中能用液相色谱分析的可占在已知的化合物中能用液相色谱分析的可占707080%80%。一一二、二、结结 构构（一）工作流程（一）工作流程高压输液系统高压输液系统 色谱柱系统色谱柱系统（数据记录处理系统）工作站（数据记录处理系统）工作站 检测系统检测系统进样系统进样系统动画（二）工作系统（二）工作系统1 1、高压输液系统高压输液系统主要部件：贮液器、过滤器、主要部件：贮液器、过滤器、高压输液泵、梯度淋洗装置高压输液泵、梯度淋洗装置（二）工作系统（二）
5、工作系统2 2、进样系统、进样系统 流路中为高压力工流路中为高压力工作状态，通常使用耐高作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置。压的六通阀进样装置。动画（二）工作系统（二）工作系统3 3、色谱柱系统、色谱柱系统 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径1 16 6 mmmm，柱长柱长5 540 40 cmcm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。（二）工作系统（二）工作系统4 4、检测器系统、检测器系统 紫外检测器紫外检测器 荧光检测器荧光检测器 示差折光检测器示差折光检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器（二）工作系统（二）工作系统
6、5 5、色谱工作站、色谱工作站 以以VI2010VI2010色谱工作站（色谱工作站（软件操作示范软件操作示范）为例：）为例：此工作站适用范围广，支持多个检测器：可与任何此工作站适用范围广，支持多个检测器：可与任何气相色谱仪、液相色谱仪或带电压输出的电子设备气相色谱仪、液相色谱仪或带电压输出的电子设备连接，可同时采集一到两个独立检测器信号。连接，可同时采集一到两个独立检测器信号。三、三、使使 用用 技技 术术准准 备备 清洗、关机清洗、关机冲洗柱子冲洗柱子冲洗管路冲洗管路关主机关主机关电脑关电脑关电源关电源开机、进样开机、进样流动相流动相标液标液样液样液柱子选择柱子选择仪器检查仪器检查开电脑、主
7、开电脑、主机、工作站机、工作站参数设置参数设置方法建立方法建立进样进样操操 作作 步步 骤骤1 1、准备所需的流动相，用合适的、准备所需的流动相，用合适的0.45m滤膜滤膜过滤，超过滤，超声脱气声脱气20min。2、根据待检样品的需要更换合适的色谱柱。、根据待检样品的需要更换合适的色谱柱。3、准备样品和标准溶液，用、准备样品和标准溶液，用合适的合适的0.450.45m滤膜过滤。滤膜过滤。4、检查仪器各部件的电源线、数据线、输液管道是否连、检查仪器各部件的电源线、数据线、输液管道是否连接正常。接正常。准准 备备 接通电源，依次开启接通电源，依次开启不间断电源不间断电源、真空脱气机真空脱气机、多多
8、元泵、检测器元泵、检测器。待泵和检测器自检结束后，打开待泵和检测器自检结束后，打开电脑显电脑显示器示器，主机主机、最后打开、最后打开色谱工作站色谱工作站。1 1、参数设定：波长、流速、流动相比例、梯度。、参数设定：波长、流速、流动相比例、梯度。2 2、更换流动相并排气泡。、更换流动相并排气泡。3 3、平衡系统：流动相冲洗系统、检查管路是否漏液、观、平衡系统：流动相冲洗系统、检查管路是否漏液、观察压力值变化、观察基线变化。察压力值变化、观察基线变化。4 4、进样：自动进样、手动进样。、进样：自动进样、手动进样。开机、进样开机、进样1 1、分析结束，数据处理、打印报告。、分析结束，数据处理、打印报
9、告。2 2、关闭、关闭柱温箱柱温箱和和检测器检测器，然后再用经过滤和脱气的适当，然后再用经过滤和脱气的适当溶剂冲洗溶剂冲洗色谱系统色谱系统。3 3、冲洗完毕后，、冲洗完毕后，逐步降低流速逐步降低流速至至0，关泵关泵。4 4、关闭、关闭液相装置液相装置，作好使用登记，内容包括日期、检品、，作好使用登记，内容包括日期、检品、色谱柱、流动相、柱压、使用小时数、仪器完好状态等。色谱柱、流动相、柱压、使用小时数、仪器完好状态等。清洗、关机清洗、关机四、四、数数 据据 分分 析析（一）谱图判断（一）谱图判断（二）结果分析（二）结果分析（一）谱图判断（一）谱图判断 分离度分离度一般应一般应1 1.5.5；重
10、复性重复性两次谱图的峰面积应相差不超过两次谱图的峰面积应相差不超过1%1%；理论塔板数理论塔板数应应规定的理论塔板数目；规定的理论塔板数目；拖尾因子拖尾因子0.950.95T T1.051.05；保留时间保留时间对照与样品的主成分保留时间应大致一致。对照与样品的主成分保留时间应大致一致。（二）结果分析（二）结果分析1 1、定性方法、定性方法 利用已知标准品定性利用已知标准品定性 利用检测器的选择性定性利用检测器的选择性定性 利用紫外检测器全波长扫描功能定性利用紫外检测器全波长扫描功能定性2 2、定量方法、定量方法 归一化法归一化法 外标法外标法 内标法内标法 课后思考题课后思考题1 1、外标法
11、定量与内标法定量有何差别？、外标法定量与内标法定量有何差别？2 2、流动相在使用前为何要经过脱气处理？、流动相在使用前为何要经过脱气处理？实训六实训六 高效液相色谱仪的使用高效液相色谱仪的使用一、一、实训目的实训目的二、二、实训原理实训原理 三、三、实训材料实训材料四、四、实训步骤实训步骤五、五、结果分析结果分析六、六、注意事项注意事项一、实一、实 训训 目目 的的1 1、了解高效液相色谱仪的构造及工作原理；、了解高效液相色谱仪的构造及工作原理；2 2、掌握高效液相色谱仪的使用方法；、掌握高效液相色谱仪的使用方法；3 3、学会用单点外标法进行数据处理和结果分析。、学会用单点外标法进行数据处理和
12、结果分析。二、实二、实 训训 原原 理理 利用试样中各组分在色谱柱中的淋洗液和固定相间的利用试样中各组分在色谱柱中的淋洗液和固定相间的分配系数不同，当试样随流动相进入色谱柱中后，组分就分配系数不同，当试样随流动相进入色谱柱中后，组分就在两相间进行反复多次分配，由于固定相对各种组分的吸在两相间进行反复多次分配，由于固定相对各种组分的吸附能力不同，因此各组分在色谱柱中的运行速度就不同，附能力不同，因此各组分在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，顺序进入色谱柱，产生经过一定的柱长后，便彼此分离，顺序进入色谱柱，产生的离子流信号经放大，在记录器上描绘出各组分的色谱峰。的离子流信号经
13、放大，在记录器上描绘出各组分的色谱峰。三、实三、实 训训 材材 料料1 1、主要仪器设备：、主要仪器设备：AgilentAgilent高效液相色谱仪，高效液相色谱仪，Hypersil Hypersil ODS-CODS-C1818柱（柱（5 5m，4.6*100mm），），MWDMWD检测器，超声波清检测器，超声波清洗器，膜过滤装置。洗器，膜过滤装置。2 2、主要试剂：甲醇（色谱纯），、主要试剂：甲醇（色谱纯），0.02mol/L0.02mol/L乙酸铵溶液，乙酸铵溶液，25g/mL25g/mL苯甲酸标准溶液。苯甲酸标准溶液。3 3、样品测试溶液：市售碳酸饮料。、样品测试溶液：市售碳酸饮料。所
14、用溶液均经过所用溶液均经过0.450.45m膜过滤。膜过滤。四、实四、实 训训 步步 骤骤1 1、取市售碳酸饮料约、取市售碳酸饮料约10mL10mL于于50mL50mL烧杯中，超声脱气烧杯中，超声脱气30min30min后，准确吸取后，准确吸取1mL1mL，经滤膜过滤至，经滤膜过滤至10mL10mL比色管，以比色管，以经滤膜过滤的高纯水定容至经滤膜过滤的高纯水定容至5mL5mL。2 2、色谱条件：柱温、色谱条件：柱温2525；检测波长；检测波长230nm230nm；进样量进样量2020L；流速流速1.0mL/min1.0mL/min；流动相流动相 甲醇：乙酸铵溶液甲醇：乙酸铵溶液=5:95=5
15、:95四、实四、实 训训 步步 骤骤3 3、开机，打开色谱工作站。、开机，打开色谱工作站。4 4、打开脱气阀，以、打开脱气阀，以5mL/min5mL/min流速对流动相进行脱气。流速对流动相进行脱气。5 5、脱气完毕后，调节流动相流量为、脱气完毕后，调节流动相流量为1.0mL/min1.0mL/min，切换脱，切换脱气阀，打开柱温控制开关，打开气阀，打开柱温控制开关，打开UVUV检测器开关。按色谱检测器开关。按色谱条件设置相应参数。条件设置相应参数。6 6、建立方法和进样序列。、建立方法和进样序列。四、实四、实 训训 步步 骤骤7 7、待基线平稳后，调用方法和序列，开始测样。、待基线平稳后，调
16、用方法和序列，开始测样。8 8、测样结束，打印图谱报告。、测样结束，打印图谱报告。9 9、关闭检测器和柱温箱，清洗色谱柱及管路，以、关闭检测器和柱温箱，清洗色谱柱及管路，以1.0mL/min1.0mL/min的流速，先以水清洗色谱柱的流速，先以水清洗色谱柱20min20min，再以甲醇，再以甲醇清洗色谱柱清洗色谱柱30min30min。1010、关闭色谱工作站、关机，作好使用记录。、关闭色谱工作站、关机，作好使用记录。五、结五、结 果果 分分 析析1 1、定性分析、定性分析 以保留时间定性，填写下列表格。以保留时间定性，填写下列表格。标标准准样样品名称品名称苯甲酸苯甲酸保留时间（min）标准图
17、谱中标准样品浓度（g/mL）25.0判断样品中有无苯甲酸（打勾）A 有 B 无五、结五、结 果果 分分 析析2 2、定量分析、定量分析 以峰面积定量，根据公式计算样品中苯甲酸的含量。以峰面积定量，根据公式计算样品中苯甲酸的含量。W W样品中苯甲酸的含量，样品中苯甲酸的含量，g/mLg/mL；A A样品中被测物质的峰面积；样品中被测物质的峰面积；As As标准样品中被测物质的峰面积；标准样品中被测物质的峰面积；C C标准样品的浓度，标准样品的浓度，g/mLg/mL；V V2 2样液定容体积，样液定容体积，mLmL；V V1 1所取样液体积。所取样液体积。六、注六、注 意意 事事 项项1 1、流动
18、相必须使用色谱纯试剂，使用前用、流动相必须使用色谱纯试剂，使用前用0.450.45m膜或更细膜或更细的膜过滤，并超声的膜过滤，并超声脱气脱气，恢复到，恢复到室温室温后使用。后使用。2 2、不能用纯乙腈作流动相，防止单向阀粘住导致泵不进液。、不能用纯乙腈作流动相，防止单向阀粘住导致泵不进液。3 3、长时间不用仪器，应将柱子取下用堵头封好保存，注意、长时间不用仪器，应将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存，应该用不能用纯水保存，应该用有机相（如甲醇等）有机相（如甲醇等）保存。保存。4 4、C18C18柱绝对不能进柱绝对不能进蛋白样品蛋白样品、血样血样、生物样品生物样品。六、注六、注 意意 事
19、事 项项5 5、注意柱子的、注意柱子的pHpH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。是碱性样品。6 6、更换流动相时，应先将吸滤头部分放入烧杯中，边振动、更换流动相时，应先将吸滤头部分放入烧杯中，边振动边清洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶相的流动相边清洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶相的流动相时要用异丙醇过滤一下。时要用异丙醇过滤一下。7 7、气泡会致使压力不稳，重现性差，在使用过程中尽量、气泡会致使压力不稳，重现性差，在使用过程中尽量避避免产生气泡。免产生气泡。实训技能考核标准实训技能考核标准项目项目考核内容考核内容考核重点考核重点分值比例分值比例高效液相色谱仪的使用样品处理样品移取 吸量管的正确使用；达到熟练程度5%脱气处理及定容 超声波仪的正确使用能够精密移取，达到熟练程度。5%滤膜过滤 注射器的正确使用；微孔滤膜器的正确使用；熟练操作。5%上机测量 能够正确仪器操作，包括开关机、设置参数、建立方法、测量；操作熟练安全。50%结果分析 原始记录及时规范整洁；有效数字准确；定性分析正确；计算准确。30%其他操作 按规定着装、能够正确进行标识、注意操作文明；注意操作安全。5%合计100%