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1、HPLC的基础知识及应用2007年10月26日工业催化与反应器设计实验室内部学术交流活动徐 帅State Key Laboratory of Chemical Resource EngineeringContents液相色谱法发展史与分类1色谱方法基本原理2345样品分析方法的建立液相色谱的维护及注意事项软件的简单介绍及示范State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering1 液相色谱发展历史与分类1.1 色谱的起源(1903)Chromatography Chromatography色谱 色谱M.S.TswettState Key La
2、boratory of Chemical Resource Engineeringv IUPAC definition of chromatography(1993):Chromatography is a physical method of separation in which the components to be separated are distributed between two phases,one of which is stationary while the other moves in a definite direction.v固定相（stationary ph
3、ase）：在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。v流动相（mobile phase）：带动样品向前移动的另一相。v色谱法：是一种物理化学分离方法，它利用不同组分与两相（固定相和流动相）之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，样品在两相中做相对移动时，各组分在两相间进行多次平衡，使不同物质达到相互分离。1.2 色谱的定义State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering1.3 色谱的发展历程State Key Laboratory of Chemical Resource EngineeringState Key Laborat
4、ory of Chemical Resource Engineering1.4 色谱中的分离过程定性定量 串联应用样品纯化成分分析分离State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering色谱中的分离过程咖啡流动相 流动相固定相 固定相利用混合物中各组份在不同的两相中溶解、分配、吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering1.5 色谱的分类v 按流动相的物态分:气相色谱(Gas Ch
5、romatography,GC)：用气体作为流动相(又叫载气)液相色谱(Liquid Chromatography,LC)：用液体作为流动相(又叫洗脱剂)v 按固定相的形态分:平面色谱 纸色谱 薄层色谱 柱色谱v 按流动相和固定相的相对极性 正相色谱(Normal Phase Chromatography)固定相的极性大于流动相 反相色谱(Reversed Phase Chromatography)固定相的极性小于流动相State Key Laboratory of Chemical Resource EngineeringHPLC 与 GC 的应用差异State Key Laboratory
6、 of Chemical Resource EngineeringHPLC 与 GC 的应用差异挥发 非挥发疏水性亲水性糖环氧化合物多氯联苯脂肪酸甲酯 芳香酯 C2/C5 碳氢化合物无机离子氨基酸糖类衍生物香精油 聚合物单体 甘油三酸酯磷脂亚硝胺有机磷杀虫剂酒精多环芳烃芳族胺脂溶性维生素抗体天然食用色素类黄酮抗生素腈类抗氧化剂乙二醇脂肪酸磺胺类挥发性羧酸醛酮类甘草膦合成食用色素苯酚黄曲霉毒素酶糖醇State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering2.色谱方法基本原理v 色谱的主要理论 热力学理论 以相的平衡观点研究色谱过程 塔板理论为代表
7、(Martin&Synge)动力学理论 以动力学观点研究各种动力学因素对色谱峰的影响 Van Deemter 方程为代表Martin SyngeState Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 分离的原理v 样品组分在固定相和流动相之间的分配 流动相带动样品经过色谱柱 不同组分与固定相之间相互作用 的强度不同 不同组分在固定相上移动速度不同，形成分离v 分配系数 KD Xm Xs KD1=Xs/Xm Ym Ys KD2=Ys/Ym 流动相固定相State Key Laboratory of Chemical Resource Engin
8、eering 样品组分的分离v 进样、分配、移动、流出、分离KD2 KD1，所以 Y 先流出來State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 分配系数Kv 分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。v 在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs、Cm 很小）时，K 只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K 减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K 也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽
9、可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。v 在同一色谱条件下，样品中K 值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K 值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。v 在HPLC 中，固定相确定后，K 主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH 值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering样品组分分离情况v A.样品与色谱柱固定相无任何
10、作用 三种样品在 t0 时间流出，无保留 无保留时间v B.样品组分保留时间一致 与色谱柱作用力相同 v C.样品组分保留时间不一致 样品各组分与色谱柱作用力不同 v D.实际分离状况 高斯分布曲线State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 色谱出峰形状v 实际出峰形状为高斯分布曲线(Gaussian curve)样品的扩散效应无扩散 样品扩散State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 分离度 分离度（R esolution)两个相邻峰的分离程度。以两个组份保留值之差
11、与其平均半峰宽值的比来表示：R=?时两峰认为已分开?State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 不同分离度 Rv 相邻两吸收峰分离度 R=1.0,98%,基线分离 R=1.5,99.7%v R=1.5 時，完全分离（中国药典规定）两色谱峰被视为 分开State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 分离度R 的数学表达v 分离度R 的基本公式 k:容量因子(capacity factor)反映吸收峰的保留特性:选择因子(selectivity factor)反映相邻两色谱峰
12、的分离程度 色谱过程热力学因素 N:理论塔板数，反映色谱柱的分离效率(column efficiency)色谱过程动力学因素有关R=1/4Nx xk1+k-1柱效选择因子 容量因子State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 容量因子 k 测量溶质在固定相和流动相中分布的摩尔数（量）之比 与温度有关(GC)与流动相溶剂种类及组成有关(LC)Injectiont0tRtRState Key Laboratory of Chemical Resource Engineeringvk 决定样品能进入色谱柱固定相的量 k 太小，在固定相上保
13、留太短，很快流出，难以确定保留时间 k 太大，在固定相上保留太强，洗脱时间太长，理想的 k 为 1 5 State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 分离效果与 k 值的最优化v k 值的优化 改变溶剂成分、梯度条件(洗脱强度)State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 选择因子 v 色谱柱分开两组份的能力 1 时两组分分离 表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。t0tR1tR2InjectionState Key Laboratory
14、 of Chemical Resource Engineering选择因子 的影响因素v 影响 的因素 改变流动相成分，包括改变 pH 值 改变柱温(在 LC 不明显)改变固定相成分 使用特殊化学效应State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering理论板数 Nv 塔板理论 热力学平衡理论 色谱柱效的量化 从分馏法技术衍生而来 分离法依组分挥发性不同而分馏 色谱法依组分分配系数不同而分离 分配系数 K=Cs/Cm 理论板数 N、塔板高度 H 柱效随 N 增大和 H 减小而增加 分配色谱流程模型N=L/HState Key Laborato
15、ry of Chemical Resource Engineeringv 理论塔板数N 与半峰宽W1/2 和保留时间的关系如下 在相同保留时间色谱峰越尖锐，则色谱柱效越高 State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 分离效能的最优化增加容量增加选择因子增加柱效增加 k 值可增加分离度但会增加分析时间改变流动相、固定相成分 增加 值可增加分离度但不能因此影响 k 值State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering液相色谱仪设备概述State Key Laboratory of
16、 Chemical Resource Engineering 液相色谱仪器组成溶剂传输系统（泵系统）进样系统 检测器工作站组分收集（选项）State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering液相色谱仪器结构组成示意图 流动相储液瓶单元或多元泵梯度混合器预柱手动-进样器自动-进样器保护柱色谱柱柱后反应器柱温箱检测器 馏分收集器积分仪工作站计算机接口温度控制单元样品制备单元State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering3.样品分析方法开发 State Key Laboratory of
17、 Chemical Resource EngineeringState Key Laboratory of Chemical Resource Engineering样品预处理样品预处理的目的是为了纯化样品。完成纯化的方法有:u 稀释-用一种互溶的且比流动相弱的溶剂或流动相本身稀释样品u 过滤-有不同孔径的过滤材料.提示:有的化合物可能吸附在过滤器上，从而影响定量.u离心-可除去样品中的颗粒物质.u萃取-液液萃取，固相萃取u挥发-采用惰性气体通过样品鼓泡或抽真空除去溶剂样品准备State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering优化概览优化
18、应当是系统进行的，也就是说每个参数应当逐步变化.!每次运行只改变一个参数!目标是在最短的分析时间内获得最好的分离结果.优化溶剂强度 流速 温度 柱长 固定相*优化State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering流动相的选择流动相的选择原则是：样品易溶，且溶解度尽可能大。化学性质稳定，不损坏柱子。不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。粘度低，流动性好。易于从其中回收样品。无毒或低毒，易于操作。易于制成高纯度，即色谱纯。废液易处理，不污染环境。反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下：H2O 甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃正相色谱常用的流动相及
19、其冲洗强度的顺序是：正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering系统方法开发1)选择初始色谱柱(直径,长度,填料粒度）-4.6 x 250 mm,5 m 使用适当的孔径 初始运行采用与流动相组成条件一致的pH2)优化 k*(保留)梯度范围,时间,斜率 流动相-很小变化3)优化回收率 样品的溶解性 温度的作用 键合相的作用 有机改性剂4)优化*(选择性)温度 键合相 pH(最后的手段)5)优化 N(色谱柱条件)流速 长度 填料粒度State Key Laboratory of Chemical Resource
20、 Engineering分离度与 k,N,和 的关系初始改变k提高N提高梯度范围,斜率流速,填料粒度,柱长温度、流动相、pH 优化State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 色谱的定性分析v 色谱定性分析:v 用保留值定性和色谱联用技术（如LC-MS、LC-FTIR)定性v 利用保留值定性v 基本依据：两个相同的物质在相同的色谱条件下应该有相同的保留 值。但是，相反的结论却不成立，即在相同的色谱条件 下，具有相同保留值的两个物质不一定是同一个物质v 利用已知物直接对照进行定性分析 用绝对保留值定性一般要求用自动进样 用相对保留值定
21、性 用已知物增加峰高法定性 利用文献值对照进行定性分析采用保留指数(I)State Key Laboratory of Chemical Resource Engineeringv检测器信号响应与时间的关系v测量每个峰的保留时间tR1t0tR2timesignalState Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 色谱的定量分析l检测器信号响应与时间的关系l测量每个峰的峰面积State Key Laboratory of Chemical Resource Engineeringv 定量分析的基本公式：Mi i 组分的量；Aii 组分的峰
22、面积；fi i 组分的校正因子，与检测器的行为和被测组份的行为有关。定量分析的依据是被测组分的量与响应信号成正比，但相同含量的物质由于物理、化学性质的差别，即使在同一检测器上产生的信号也不同，直接用响应信号定量，必然导致较大误差。故引入校正因子。校正因子是定量计算公式中的比例常数，其物理意义是单位面积所代表的被测组分的量。State Key Laboratory of Chemical Resource Engineeringv1.面积百分法(Area Percent)v2.外标法(External Standard)v3.内标法(Internal Standard)v4.归一化法(Norma
23、lized Percent)色谱定量分析方法的种类State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 面积百分法 最简单的计算方法样品中的所有成分对检测器的响应值相同样品中的所有成分必须完全分离表示样品中单一组份相对于其他组份的含量 面积%=(AI/A)*100 AI=单一色谱峰的面积 A=全部色谱峰的面积之和v不要求进样量准确v不适用于选择性检测器State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering归一化法(Normalized%)v 将样品中所有组份的含量之和定为100%。计算其中某一组份百分含量的定量方法：其中：xi 试样中组份I 的百分含量 fi组份I 的校正因子 Ai 组份I 的峰面积或峰高