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1、第三章第三章 基因工程制药基因工程制药概述概述一、基本概念一、基本概念DNADNA重重组（invitroDNArecombinationinvitroDNArecombinationtechnologytechnology）：）：基因克隆基因克隆（genecloninggenecloning）或分子克隆或分子克隆（molecularmolecularcloningcloning）技）技术。基因工程基因工程（geneengineeringgeneengineering）：二、基因工程二、基因工程产生的基生的基础11理理论上三大上三大发现4040年代年代发现了生物的了生物的遗传物物质-DNA-DN
2、A5050年代年代阐明了生物明了生物遗传物物质的分子机制，的分子机制，WatsonandCrickWatsonandCrick提出了提出了DNADNA双螺旋双螺旋结构构模型。模型。6060年代确定了年代确定了遗传信息的信息的传递方式方式-中心中心法法则 22技技术上三大上三大发明明v限制性内切限制性内切酶和和连接接酶的的发现v载体体（VectorVector）的的发现：载体体相相当当于于运运送送重重组DNADNA分子到宿主分子到宿主细胞的胞的车子子v逆逆转录酶的的发现，打破了中心法，打破了中心法则，使真核基，使真核基因的制因的制备成成为可能可能 一、重一、重组DNADNA技技术的基本的基本过程
3、程v基因工程要素基因工程要素v目的基因的制目的基因的制备和分离和分离vDNADNA重重组体的构建体的构建vDNADNA重重组体体扩增和表达增和表达v重重组体体筛选和和鉴定定v外源基因的表达外源基因的表达v表达表达产物的分离物的分离纯化、化、鉴定定载体载体酶切酶切目的基因目的基因重组体重组体导入受体细胞导入受体细胞扩增、抽提和鉴定扩增、抽提和鉴定表达表达表达产物的分离鉴定表达产物的分离鉴定大量生产大量生产基因工程的基本流程基因工程的基本流程二、二、基因工程的分基因工程的分类v真核基因工程真核基因工程v原核基因工程原核基因工程三、三、重重组DNADNA技技术-基因工程与医学的关系基因工程与医学的关
4、系1.1.研究基因的研究基因的结构功能和活构功能和活动的的规律。律。2.2.为疾疾病病的的防防治治、诊断断、预后后及及发病病机机理理的的研研究究开辟新途径。开辟新途径。3.3.研究研究细胞分化和胚胎胞分化和胚胎发育的本育的本质问题。4.4.基因治基因治疗。5.5.促促进基基础理理论的研究。的研究。四、四、基因工程技基因工程技术制制备药物的物的优势v 制制备很珍很珍贵但利用但利用传统方法方法难以制以制备的的药v 可以提供足可以提供足够数量的生理活性物数量的生理活性物质，以便，以便对其生理、其生理、生化和生化和结构构进行深入研究，行深入研究，v 可以可以发现和挖掘更多的内源生理活性物和挖掘更多的内
5、源生理活性物质。v 内源生理活性物内源生理活性物质在作在作为药物使用物使用时存在的不足之存在的不足之处，可通可通过基因工程和蛋白工程基因工程和蛋白工程进行改造和克服。行改造和克服。v 利用基因工程技利用基因工程技术可可获得新型化合物，得新型化合物，扩大大药物物筛选来源。来源。第三第三节 基因工程的基因工程的酶和和载体体第一部分：工具第一部分：工具酶v限制性内切限制性内切酶和甲基化和甲基化酶vDNADNA连接接酶vDNADNA多聚多聚酶第二部分：基因工程的第二部分：基因工程的载体体v原核原核细胞（大胞（大肠杆菌）的常用杆菌）的常用载体：体：v真核真核细胞胞载体体：第一部分：工具第一部分：工具酶一
6、一 限制性内切限制性内切酶和甲基化和甲基化酶v限制性内切限制性内切酶的的发现 v限制性内切限制性内切酶的生理功能的生理功能v限制性内切限制性内切酶的分的分类和命名和命名 v识别和切割位点及切割片段的末端和切割位点及切割片段的末端 v型型酶的分的分类v反反应系系统v 限制性内切限制性内切酶的的应用用 1 1限制性内切限制性内切酶（restrictionendonuclease)restrictionendonuclease)v定定义v发现vArberArber的假的假说限制修限制修饰酶2 2 限制性内切限制性内切酶的生理功能的生理功能v构成了构成了细胞抵御外源入侵胞抵御外源入侵DNADNA的防御
7、机制的防御机制v提供了提供了细菌种属菌种属间进行交叉繁殖的屏障，但又行交叉繁殖的屏障，但又允允许外源外源DNADNA有某些有某些遗漏漏3 3 限制性内切限制性内切酶的分的分类和命名和命名v三种三种类型：型：型、型、型、型、型型v命名：命名：EcoREcoRE:EscherichiaE:Escherichia属属Co:coliCo:coli种种R:RY13R:RY13株株：该菌株第一个被菌株第一个被发现的核酸内切的核酸内切酶4 4 型限制性核酸内切型限制性核酸内切酶：识别与与切切割割DNADNA链上上同同一一个个特特异异性性核核苷苷酸酸顺序序，产生特异性的生特异性的DNADNA片断。片断。1 1
8、）基本特性）基本特性v识别与切割与切割DNADNA链上同一个特异性核苷酸上同一个特异性核苷酸顺序序v切割片段的末端切割片段的末端对dsDNAdsDNA的两条的两条链同同时切割，切割，产生生3 3种不同的种不同的切口：切口：识别序列识别序列：切割末端：5GTTAAG-33CAATTG-55GTT-33CAA-55AAG-33-TTG-5平末端5CTGCAG-33GACGTC-55CTGCA-33-G5G-33ACGTC-55-粘末端Hpa IPst I5GAATCC-33CTTAAG-55-G-33CTTAA-55AATCC-33G-5EcoR I3粘末端5 5 型型酶的分的分类A:Isochi
9、zomers(A:Isochizomers(异异源源同同工工酶)，来来源源不不同同，识别顺序序相相同的同的酶。Sma Sma Xma Xma 它它们识别顺序序相相同同，切切割割位位点点不不同同，产生生平平头或或粘粘性性末末端端。C C C G G GC C C G G GG G G C C C G G G C C C C C C G G GC C C G G GG G G C C CG G G C C CB:同尾同尾酶（isocaudarner）5-GATC-33-CTAG-5 5-GGATCC-33-CCTAGG-5 5-AGATCT-33-TCTAGA-5 Mbo I BamH I Bgl
10、 II 来源及来源及识别序列不相同，切割后序列不相同，切割后产生相同的粘性片段生相同的粘性片段6 6 反反应系系统组成：成：酶及活性及活性缓冲液（冲液（buffer)buffer)：影响影响酶反反应的因素：的因素：vDNADNA的的纯度度vDNADNA甲基化程度甲基化程度vDNADNA分子分子结构：构：线性性环状状v反反应温度温度v反反应系系统组成成7 7 限制性内切限制性内切酶的的应用用vDNADNA重重组v 组建新建新质粒粒v组建建DNADNA物理物理图谱vDNADNA的分子的分子杂交交v制制备DNADNA的放射性探的放射性探针vDNADNA的序列分析的序列分析vDNADNA甲基化碱基的甲
11、基化碱基的识别与切割。与切割。二、二、DNADNA连接接酶 功能功能:是指催化两条分是指催化两条分别具有具有5-5-磷磷酰基末端与基末端与3-3-羟基末端的基末端的DNADNA单链连接形成磷酸二接形成磷酸二酯键的的酶 常用的常用的连接接酶：T4DNAT4DNA连接接酶大大肠杆菌杆菌DNADNA连接接酶 1 T4 DNA ligase 1 T4 DNA ligase 来自T4感染的Ecoli，MR:68Kd，辅助因子：Mg2+and ATP 1 1）反应特性）反应特性 5ACG-OH P-AATTCGT-3 5ACG-OH P-AATTCGT-3 TGCTTAA-P +OH-GCA-5 TGCT
12、TAA-P +OH-GCA-5 ATP Mg2+ATP Mg2+5ACGAATTCGT3 5ACGAATTCGT3 3TGCAAGTTCA5 3TGCAAGTTCA5 2 2）2020ulul反反应体系体系:10*buffer2ul(66mMTris-HCl,pH7.5,10*buffer2ul(66mMTris-HCl,pH7.5,6.6mMMgCl6.6mMMgCl2 2,10mMMDTT,0.4,10mMMDTT,0.4mMATP)mMATP)底物底物10pM10pM 连接接酶：33）反）反应温度及温度及时间：1616，过夜夜4 4）用途：粘端）用途：粘端DNADNA或切口或切口间连接，
13、也接，也连接平末端接平末端2 2大大肠杆菌杆菌DNADNA连接接酶 来自来自Ecoli,Mr:7.4kDa,Ecoli,Mr:7.4kDa,辅助因子助因子NAD+NAD+。作作用用：封封闭双双螺螺旋旋DNADNA上上具具有有55磷磷酸酸酰基基和和33羟基基的的缺缺口口（nicknick）形形成成磷磷酸酸二二酯键。无无法法封封闭裂裂口口（gapgap）。因因此此可可连接接粘粘性性末末端端的的DNADNA片片断，不能断，不能连接平末端的接平末端的DNADNA片断。片断。用途：粘端用途：粘端DNADNA或切口或切口间连接接三三 DNADNA多聚多聚酶v 聚合聚合酶vTaqDNATaqDNA聚合聚合酶
14、 v逆逆转录酶(reversetranscriptase)(reversetranscriptase)v末末 端端 脱脱 氧氧 核核 苷苷 酸酸 转 移移 酶（TerminalTerminalDeoxynucleotidaylTransferaseDeoxynucleotidaylTransferase）(一）一）聚合聚合酶v功功能能：以以DNADNAororRNARNA为模模板板，催催化化DNADNAandandRNARNA的的体体外外合成。合成。以以DNADNA为模板模板不耐不耐热聚合聚合酶耐耐热聚合聚合酶 大大肠杆菌杆菌DNADNA聚合聚合酶TaqDNATaqDNA聚合聚合酶Klenow
15、Klenow大片段大片段酶pfupfu聚合聚合酶T4(T7)T4(T7)噬菌体噬菌体DNADNA聚合聚合酶 以以RNARNA为模板模板反反转录酶共共 性：性：v需要引物和模板需要引物和模板v不能起始新的不能起始新的DNADNA连，催化，催化dNTPdNTP连续加到双加到双链DNADNA分子引物分子引物链3OH3OH端；端；v不不发生从引物模板上解离生从引物模板上解离11大大肠杆菌杆菌DNADNA聚合聚合酶（E.coliPolymeraseE.coliPolymerase）来自来自E.coliE.coli细胞。胞。Mr:109kDMr:109kD。由由单一多一多肽组成。沿成。沿DNADNA模板催
16、化核苷酸聚合，是一多功能模板催化核苷酸聚合，是一多功能酶，有三种活性，有三种活性：5-3外切酶外切酶N3-5外切酶外切酶聚合聚合酶酶C小片段小片段大片段（大片段（Klenow片段）片段）1 1）5353聚合聚合酶活性活性在模版指在模版指导下，以下，以4 4种种dNTPdNTP为底物，催化底物，催化单核苷酸接合核苷酸接合到到DNADNA引物引物的的3-OH3-OH末端。末端。5CCGOH5CCGATAGCCT5CCGOH5CCGATAGCCTGGCTATCGGAGGCTATCGGAGGCTATCGGAGGCTATCGGA催化合成的要求：模板，催化合成的要求：模板，4 4种种dNTPdNTP，引物
17、，引物与模板形，引物，引物与模板形成正确的成正确的氢键配配对三种活性：三种活性：vgapgapfilling:filling:在在双双链DNADNA上上的的缺缺口口部部分分的的3OH3OH末端上附加核苷酸，末端上附加核苷酸，补平其平其链部分部分vNickNick translation:translation:在在双双链DNADNA的的切切口口部部分分的的3OH3OH末末端端附附加加核核苷苷酸酸，同同时外外切切性性除除去去55末末端的核苷酸。端的核苷酸。vStranddisplacement:Stranddisplacement:通通过在切口的在切口的3OH3OH末端末端附加核苷酸达到置附加核
18、苷酸达到置换据有据有5-5-末端的末端的链2 2）双双链特异性的特异性的5353外切外切酶活性活性 无无dNTPdNTP时，从从55末末端端降降解解ds-DNAds-DNA成成为55单核核苷酸。苷酸。5CGCATCG5CGCATCGGCGTAATCGCGTAATC 5CATTAG3GCGTAAGCPC、PG3 3）单链特异性的特异性的3-53-5外切外切酶活性活性 无无dNTPdNTP时从从3-OH3-OH末末端端降降解解ss-DNAss-DNA或或游游离离3_OH3_OH末端成末端成为单核苷酸核苷酸。5CGCATCGGCG5CGC GCGPA、PC、PT、PG 5-3外切酶3-5外切酶起始端
19、5-P3-OH断裂位置末端磷酸二酯键3OH末端切除特点配对的不配对的脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸coliDNAPolcoliDNAPol在基因工程中的用途：在基因工程中的用途：v制制备高比活的高比活的DNADNA探探针v用于分子克隆用于分子克隆 vDNADNA序列分析序列分析 v与与DNaseIDNaseI一起使用，一起使用，进行切口平移行切口平移v通通过Okayama_BergOkayama_Berg合成合成cDNAcDNA的第二条的第二条链 2 2KlenowKlenow 片段：片段：3 3 E.coliE.coliDNADNA聚合聚合酶的一个大片断。的一个大片断。MW:7.6KDaMW:7.
20、6KDa。v 具有聚合具有聚合酶I I的的5353聚合聚合酶活性活性在在模模版版和和引引物物存存在在时，以以dNTPdNTP做做底底物物，沿沿5-35-3方方向向合合成与模版互成与模版互补的的DNADNA。v对单链DNADNA有有3355外外切切酶活活性性，较弱弱，不不适适于于33突出端的平滑化突出端的平滑化v无无5353外切外切酶活性。活性。KlenowKlenow片断用途：片断用途：v填充用限制填充用限制酶消化消化dsDNAdsDNA的的33延伸末端延伸末端平末端平末端。v用用3232PdNTPPdNTP进行行补平反平反应，可，可对DNA3DNA3末端末端进行行标记v合成合成cDNAcDN
21、A第二条第二条链。v寡核苷酸定向寡核苷酸定向诱变中双中双链DNADNA合成合成v在在SangerddNTPSangerddNTP系系统中中进行行顺序分析。序分析。（二）（二）TaqDNATaqDNA聚合聚合酶TaqTaq DNADNA聚聚合合酶是是耐耐热的的依依赖于于DNADNA的的DNADNA聚聚合合酶。MW:6.5kDa.MW:6.5kDa.在在模模版版及及引引物物存存在在的的条条件件下下，催催化化与与模模版版互互补的的脱脱氧氧核核苷酸一次苷酸一次选择性地性地连接在引物的接在引物的3OH3OH末端上的反末端上的反应v末端末端A,A,即粘性末端即粘性末端v5353外切核酸外切核酸酶活性活性v
22、 有有链置置换的能力。的能力。v 无无3535外切核酸外切核酸酶活性，无校活性，无校对功能功能,易突易突变。vMg2+Mg2+依依赖酶用途：用途：vDNADNA序列分析；序列分析；v应用用于于聚聚合合酶连反反应（PCRPCR）,对DNADNA分分子子的的特特定定序列体外序列体外扩增增(产物物为粘末端）；粘末端）；pfuDNAPolymerasepfuDNAPolymerasev有有DNADNA聚合聚合酶活性活性v没有逆没有逆转录活性活性v有有3-53-5方向的外切方向的外切酶活性活性.产物物为平末端平末端v但是但是这些聚合些聚合酶的的产量比量比TaqDNATaqDNA聚合聚合酶低。低。常用于常
23、用于PCRPCR反反应 v高保真高保真（三）、（三）、逆逆转录酶(reversetranscriptase)(reversetranscriptase)11特性：特性：v依依赖于于RNARNA的的DNADNA聚聚合合酶，又又称称RNARNA依依赖的的DNADNA聚聚合合酶v有效的有效的转录RNARNA成成为DNADNAv产物物DNADNA又又称称cDNA,cDNA,即即互互补DNA(ComplementaryDNA(ComplementaryDNA)DNA)v逆逆转录酶是一个多功能是一个多功能酶2 2 活性：活性：v将真核生物的将真核生物的mRNAmRNA转录成成cDNAcDNA。v单链DNA
24、DNA或或RNARNA为模模板板时，使使用用反反转录酶制制备杂交探交探针。v标记带55突出端的突出端的DNADNA片断。片断。v用于双脱氧用于双脱氧链法法测序序v反反转录PCRPCR。（四）（四）末端脱氧核苷酸末端脱氧核苷酸转移移酶（TerminalDeoxynucleotidaylTransferaseTerminalDeoxynucleotidaylTransferase）简称末端称末端转移移酶（TerminalTransferaseTerminalTransferase）来自小牛胸腺，来自小牛胸腺，Mr:34kD,Mr:34kD,碱性蛋白碱性蛋白质。作用：作用：在在二二价价阳阳离离子子存
25、存在在下下，催催化化dNTPdNTP沿沿5-35-3方方向向聚聚合合作作用逐个用逐个顺序加于序加于线性性DNADNA分子的分子的3OH3OH末端。末端。v不不需需模模版版，4 4种种dNTPdNTP任任意意一一种种可可作作前前体体物物；只只一一种种dNTPdNTP组成有一种核苷酸成有一种核苷酸组成的成的33尾巴，同聚物尾巴尾巴，同聚物尾巴用途：用途：v 给载体或体或cDNAcDNA加上同聚尾。加上同聚尾。v33末端用末端用3232P P标记的的dNTPdNTP标记。v 利利用用非非放放射射性性标记物物生生物物素素-11-dUTP-11-dUTP渗渗入入到到DNADNA片段分子的片段分子的33末
26、端。末端。第二部分：基因工程的载体第二部分：基因工程的载体一、概述一、概述 载体的概念（载体的概念（VectorVector）：凡来源于质粒）：凡来源于质粒或噬菌体的或噬菌体的DNADNA分子，可以供插入或克隆分子，可以供插入或克隆目的基因并具有传递运载外源目的基因并具有传递运载外源DNADNA导入宿导入宿主细胞能力的主细胞能力的DNADNA片段称为载体片段称为载体。载体的功能及特征v运送外源基因高效转入受体细胞v为外源基因提供复制能力或整合能力v为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体应具备的条件v具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）v具有合适的筛选标记v具有较高的外源DNA的载装能
27、力v具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点v具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点用于基因工程的载体v质粒（plasmid）v噬菌体或病毒DNAv考斯质粒（cosmid）与噬菌粒v人造染色体载体质粒(plasmid)质粒的基本特征v质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子.v质粒常见于原核细菌和真菌中v绝大多数的质粒是DNA型的v绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA(covalenty,closed and circular double-stranded DNA)v质粒DNA的分子量范围：1-300 kb 质粒DN
28、A分子构型：三种分子构型：v线性(sscDNA)：L-构型v环状（OCDNA)：一条保持完整环形结构，另一条链有缺口，OCD构型v超螺旋：共价闭合环状DNA(CCCDNA)，呈超螺旋构型 线性环状超螺旋OCDNALDNASCDNA质粒的特性质粒的特性v质粒的自主复制性v质粒具有不相容性 v质粒具有遗传传递和遗传交换的能力。v携带特殊的遗传标记质粒的自主复制性v质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制v质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系v根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：v严紧型复制控制的质粒1-3 拷贝v松弛型复制控制的质粒10-60 拷贝质
29、粒的不相容性v任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。v以大肠杆菌的质粒为例：vColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容vpSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容vp15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容质粒的不相容性：分子机制 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同。因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势 两种含有不同复制子结构的不同质
30、粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定。质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：v接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等。v非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员v值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom 和mob 基因决定携带特殊的遗传标记v野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：v物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物v物质合成：
31、抗生素、细菌毒素、有机碱v这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义质粒作为载体的优缺点质粒作为载体的优缺点优点：分子量小，易操作。优点：分子量小，易操作。大多有抗性标记大多有抗性标记 易导入宿主细胞易导入宿主细胞缺点：插入外源基因的片断不能太大缺点：插入外源基因的片断不能太大质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：v高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数1000-3000，扩增基因v低拷贝质粒来自pSC101，拷贝数小于10，表达某些毒性基因v温敏质粒在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质v测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinkerv整合质粒装有整合促进
32、基因及位点，便于外源基因的整合v穿梭质粒装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆v表达质粒装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件v探针质粒装有报告基因便于启动子等元件的克隆筛选（一）（一）质粒粒-克隆克隆载体体复制起始位点复制起始位点多克隆位点多克隆位点筛选标记筛选标记克隆载体三个要素：1）复制子：复制子又称复制起始区，包含控制质粒DNA复制起点和质粒拷贝数等遗传因素。2）选择标记：v由质粒编码的选择标记赋予宿主细胞新的表型，用于鉴定和筛选转化有质粒的宿主细胞。v最常见的选择标记为抗生素抗性基因，包括氨苄青霉素（amp），四环素（tet），氯霉素（cm），卡那霉素（kan）和新霉素（n
33、eo）等。3）多克隆位点：质粒载体中由多个限制性内切多克隆位点：质粒载体中由多个限制性内切酶识别序列密集排列形成的序列称之为酶识别序列密集排列形成的序列称之为多克隆多克隆位点位点（multiple cloning site,MCS）。常用的质粒克隆载体常用的质粒克隆载体pBR322质粒图谱质粒图谱4363bp;Ampr and tetr,拷贝数拷贝数3000松弛型松弛型pUC18/19质粒图谱质粒图谱（二）表达载体表达表达载体具体具备的条件的条件:v载体能够独立的复制载体能够独立的复制 稳定的遗传复制、传代能力，稳定的遗传复制、传代能力，在无选择压力下能存在无选择压力下能存 在于宿主细胞内。在
34、于宿主细胞内。v强的启动子，能为大肠杆菌强的启动子，能为大肠杆菌RNARNA聚合酶所识别。聚合酶所识别。v应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。能进行转录。v强的终止子。强的终止子。v好的核糖体结合位点：好的核糖体结合位点：SDSD序列、序列、ATGATGv目的基因插入位点目的基因插入位点v筛选标记筛选标记2 表达表达载体分体分类：原核表达原核表达载体体v非融合蛋白表达非融合蛋白表达载体：启体：启动子和核糖体子和核糖体结合位点合位点启启动子包括子包括噬菌体噬菌体PLPL启启动子，子，T7T7噬菌体启噬菌体启动子，子，tactac
35、启启动子，子，trctrc启启动子等子等v融合蛋白表达融合蛋白表达载体。体。pETpET系列系列载体，硫氧体，硫氧还蛋白融合表达蛋白融合表达载体，体，XpressXpress表达系表达系统，GSTGST基因融合系基因融合系统-pGEX-pGEX系列系列载体等。体等。真核表达真核表达载体体v不不带病毒复制子病毒复制子v带病毒复制子病毒复制子真核表达真核表达载体含有原核基因序列和真核体含有原核基因序列和真核转录单位，能在大位，能在大肠杆菌杆菌中自我复制，也能在真核中自我复制，也能在真核细胞中胞中进行表达。行表达。质粒DNA的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：v氯化铯密度梯度离心法
36、质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染v碱溶法 质粒DNA纯度低、快速、操作简便v沸水浴法 质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间二二噬菌体载体噬菌体载体1 1 特点：特点：v 噬菌体噬菌体容量大容量大v 噬噬菌菌体体转转染染宿宿主主细细胞胞的的效效率率比比大大肠肠杆杆菌菌转转化化效效率率高高2-32-3个数量级个数量级2 2 常用的常用的噬菌体载体：噬菌体载体：v噬菌噬菌-体衍生物体衍生物v Cosmid Cosmid1)噬菌体衍生物v 噬菌体是双链DNA病毒v 基因组长度为48502bpv分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。当感染宿主细胞后线性DNA分子会迅速籍助
37、粘性末端互补连接成环，连接区 域 称 为 COS（cohesive site）位点。-DNA载体的构建：缩短长度v野生型-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型-DNA的长度，可以提高装载量。v其实野生型-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将-DNA载体分成两大类载体：v插入型载体v取代型载体-DNA作为载体的优点：v-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量。v重组-DNA分子的筛选
38、较为方便v-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因2)2)Cosmid Cosmid（考考斯斯质质粒粒，粘粘性质粒）性质粒）CosmidCosmid质质粒粒是是将将质质粒粒和和COSCOS粘粘性性末末端端构构建建的的克克隆隆载体。载体。长长度度约约4-6kb4-6kb，克克隆隆的的真真核基因核基因DNADNA大约在大约在31-45kb31-45kb。特点：特点：v 具有具有噬菌体粘性末端特性噬菌体粘性末端特性v 具有质粒载体抗药性标记特性具有质粒载体抗药性标记特性v 具有一个或多个限制性酶切位点具有一个或多个限制性酶切位点v 具有高容量的克隆能力具有高容量的克隆能力v 接
39、上真核细胞的表达元件，能在真核细胞中表接上真核细胞的表达元件，能在真核细胞中表达和生存。达和生存。应用：应用：人造染色体载体v人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的DNA片段，此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。目前常用的人造染色体载体包括：v细菌人造染色体（BAC）v酵母人造染色体（YAC）细菌人造染色体（Bacterial Artific
40、ial Chromosomes BAC）v细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子FF质粒的基础上构建的，其装载量范围在50-300 kb之间，各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝。vpBACs主要适用于：v克隆大型基因簇（gene cluster）结构v构建动植物基因文库酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）基因工程的宿主基因工程的宿主细胞胞条件：v限制性缺陷型 外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）v重组整合缺陷型 用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）v具有较高的转化效率v具有与载体选择标记互补的表型v
41、感染寄生缺陷型 防止重组细菌扩散污染，生物武器除外原核：细菌：大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌等原核：细菌：大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌等真核：酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等真核：酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等大肠杆菌v遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定v产结构复杂、种类繁多的内毒素v适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌枯草杆菌v遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素v适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌v遗传欠稳定，载体受体系统欠完备酵母菌v具有真核生物的
42、特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定v内源性蛋白产物种类繁多且含量高v适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌昆虫细胞（家蚕）v具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定v适用于真核生物基因的高效表达vDNA重组操作系统欠完善哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）v与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统v细胞培养条件苛刻，生长缓慢v适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实
43、验和基因工程的主要哺乳动物受体实验室常用的基因工程受体v大肠杆菌：v用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、JM101（Aps、Tcs、Cms）v用于接受-DNA：LE392、ED8654v酵母菌：毕赤酵母 啤酒酵母v哺乳动物细胞CHO 第四第四节目的基因的制备生物合成基因未知v基因文库组构建vcDNA文库生物合成基因已知(GeneBank可查)v聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）v逆转录PCR（retrotranscriptionPCR，RTPCR）v化学合成 v基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基
44、因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：v一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；v另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。一、寻找目的基因找目的基因11基因基因组文文库（genomicDNAlibrarygenomicDNAlibrary）：）：是是指指
45、将将基基因因组DNADNA通通过限限制制性性内内切切酶部部分分酶解解后后所所产生生的的基基因因组DNADNA片片断断随随即即的的同同相相应的的载体体重重组、克克隆隆，所所产生生的的克克隆隆群群体体代代表表了了基基因因组DNADNA的所有序列，包括外的所有序列，包括外显子和内含子序列子和内含子序列。基因基因组文文库应用：用：11）原核生物目的基因的分离（目的基因在）原核生物目的基因的分离（目的基因在质粒上）粒上）提取提取质粒粒DNADNA限制性限制性酶切切从从DNADNA凝胶凝胶电泳回收泳回收不同大小的片段不同大小的片段与与载体体连接构建物理接构建物理图谱探探针杂交交分离目的基因。分离目的基因。
46、22）鸟枪法分离基因（目的基因在染色体法分离基因（目的基因在染色体DNADNA上）：上）：用限制性内切用限制性内切酶将将染色体染色体DNADNA酶切，得到很多同一般切，得到很多同一般基因大小相当的基因大小相当的DNADNA片断，然后将片断，然后将这些片断混合物随些片断混合物随即重即重组入适当的入适当的载体，体，转化后在受体菌种化后在受体菌种扩增，再用增，再用适当的方法适当的方法筛选出需要的基因：出需要的基因：鸟枪法克隆目的基因的基本战略v染色体DNA的切断v超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端v全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控v部分酶切：片段
47、长度可控，含有粘性末端，目的基因完整v与载体连接v如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体v受体细胞；v如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为转化受体细胞v如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞v筛选含有目的基因的目的重组子v菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）鸟枪法克隆目的基因的局限性v工作量较大，需要了解目的基因的背景知识v不能获得的最小长度的目的基因v不能除去真核生物目的基因的内含子结构2 2 真核生物基因组文库真核生物基
48、因组文库-（cDNAcDNA文库含内含子文库含内含子）cDNAcDNA文库（文库（cDNA librarycDNA library）建立：）建立：从真核细胞分离总从真核细胞分离总RNA,RNA,纯化出纯化出mRNA,mRNA,逆转录合逆转录合成互补的成互补的DNA,DNA,再在聚合酶作用下合成再在聚合酶作用下合成cDNAcDNA第二第二条链条链,然后将双链然后将双链cDNAcDNA插入到载体内插入到载体内,构建重组构建重组体体,转入宿主菌转入宿主菌,得到的克隆总和成为该类细胞得到的克隆总和成为该类细胞的的cDNAcDNA文库文库.cDNAcDNA文库特征：文库特征：包含成熟包含成熟mRNAmR
49、NA的全部信息的全部信息,即包含该细胞内表达的全即包含该细胞内表达的全 部蛋白的编码信息部蛋白的编码信息.它只包括在特定的组织或细胞类型中已经被它只包括在特定的组织或细胞类型中已经被 转录成转录成mRNAmRNA的那些基因序列。其复杂性比基因组文库低。的那些基因序列。其复杂性比基因组文库低。由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定状态是由特定基因的表达的所决定的，因此各自的状态是由特定基因的表达的所决定的，因此各自的mRNAmRNA的种类就不同，由此而产生独特的的种类就不同，由此而产生独特的cDNAcDNA文库。文库。cDNA法克隆目的基因的
50、局限性v并非所有的mRNA分子都具有polyA结构v细菌或原核生物的mRNA半衰期很短vmRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，v分离纯化困难v仅限于克隆蛋白质编码基因二二.制备目的基因制备目的基因（一）聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）1 基本原理:根据碱基配对原则利用DNA聚合酶催化和dNTP的参与下，引物依赖于DNA模板特性引导DNA的合成。v使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或 DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物 变性（denaturation）：94 3-5min.退火（annealing）：